陳 琢 孔藝然

沉默UHRF1對乳腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響

陳 琢 孔藝然

目的探討UHRF1對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖以及侵襲的影響及其相關(guān)機制。方法采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)檢測沉默UHRF1基因后對乳腺癌MDA-MB-231細胞活力的影響；應(yīng)用克隆形成實驗檢測沉默UHRF1后對乳腺癌MDA-MB-231細胞存活的影響；吖啶橙-溴乙錠(AO/EB)檢測沉默UHRF1后對乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的影響；Caspase-3活性試劑盒檢測沉默UHRF1后乳腺癌細胞Casapse-3活性的變化；Western blot法檢測細胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Bad、p-Bad、XIAP、p53、p21Cip1/Waf1和p16INK4a的表達；應(yīng)用Transwell實驗研究沉默UHRF1對MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響；Wound Healing實驗研究沉默UHRF1后對其遷移能力的影響。結(jié)果沉默UHRF1使乳腺癌MDA-MB-231細胞活力降低；克隆形成實驗結(jié)果顯示沉默UHRF1后MDA-MB-231細胞存活能力降低，AO/EB染色顯示沉默UHRF1促進MDA-MB-231細胞凋亡。同時Caspase-3活性實驗結(jié)果顯示沉默UHRF1后乳腺癌MDA-MB-231細胞Caspase-3的活性增加；Western blot結(jié)果顯示，沉默UHRF1后，能夠使凋亡蛋白Bad、XIAP和Bax的表達上調(diào)，同時抗凋亡蛋白p-Bad，Bcl-2的表達下調(diào)，也使p53，p21Cip1/Waf1，p16INK4a蛋白表達升高；Transwell以及Wound Healing實驗證明沉默UHRF1能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲和遷移。結(jié)論沉默UHRF1能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞活力和存活，并抑制乳腺癌MDA-MB-231的侵襲和遷移。沉默UHRF1通過調(diào)控p53，p21Cip1/Waf1，p16INK4a信號發(fā)揮作用。

UHRF1；乳腺癌；p53；侵襲；凋亡

乳腺癌(Breast cancer)是世界范圍內(nèi)女性較常見的惡性腫瘤之一[1]。盡管目前臨床對于乳腺癌的治療主要集中于手術(shù)和放化療[2-3]，但因其對患者的損傷大，術(shù)后對于女性心理以及生理的影響巨大[4]。因此，進一步研究乳腺癌的致病因素和發(fā)生機制，明確靶向治療方向[5]，是目前困擾廣大學(xué)者的重要研究問題。UHRF1，也被稱為ICBP90，屬于UHRF家族[6]。UHRF1被發(fā)現(xiàn)在前列腺癌[7]、膀胱癌[8]和乳腺癌[9]中過量表達，但是其確切的生物學(xué)功能仍然被學(xué)者們所關(guān)注。文獻報道[10]體外實驗中UHRF1基因可能是一種生長調(diào)節(jié)基因，其主要作用在于能夠抑制細胞有絲分裂從而對細胞增殖產(chǎn)生影響，進而對細胞周期進行調(diào)節(jié)。然而，關(guān)于UHRF1對乳腺癌細胞增殖的具體影響鮮有報道。本研究主要探討沉默UHRF1后，乳腺癌細胞系MDA-MB-231增殖以及遷移能力的變化，及其初步機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞系用RPMI-1640(含10%小牛血清)培養(yǎng)基于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。UHRF1-shRNA購自中國Gene Pharma公司?？笲cl-2、抗Bax、抗Bad、抗p-Bad、抗p53，抗p21Cip1/Waf1以及p16INK4a單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 將正常對照組，NC組以及UHRF1-shRNA組分別轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231細胞中(NC組：陰性對照組；UHRF1-shRNA組，轉(zhuǎn)染UHRF1-shRNA 48 h后的MDA-MB-231細胞)，Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染后UHRF1蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)NC組與正常對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.0923)，因此在后續(xù)的實驗中，本研究以NC組為對照組(圖1A)。

1.2.2 MTT法測定MDA-MB-231細胞生長抑制率 將2×103L-1的MDA-MB-231細胞接種于96孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h后，分別向MDA-MB-231細胞中轉(zhuǎn)染UHRF1-shRNA及NC 48 h后，MTT法測定細胞的吸光度值。

1.2.3 Caspase-3活性檢測 向MDA-MB-231細胞中轉(zhuǎn)染UHRF1-shRNA，48 h后，按照Caspase-3活性檢測試劑盒說明書測定Caspase-3的酶活性。

1.2.4 Western blot檢測細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達 總蛋白是從轉(zhuǎn)染UHRF1-shRNA及其NC 48 h后MDA-MB-231細胞中提取。使用12%的SDS-PAGE膠，每個孔道蛋白樣品50 μg，濃縮膠70 V，分離膠110 V后，將蛋白轉(zhuǎn)印至醋酸纖維素膜上，300 mA轉(zhuǎn)印1.5 h后，在5%的脫脂牛奶中封閉2 h。分別將不同的抗體p16INK4a、p21CIP1/WAF1、p53、Bcl-2、Bax、Bad、p-Bad、XIAP、β-actin在4℃恒溫?fù)u床上孵育過夜，紅外熒光染料標(biāo)記的第二抗體室溫孵育1 h。Western blot通過奧德賽3.0軟件進行紅外成像系統(tǒng)采集，以相應(yīng)蛋白條帶的灰度值/β-actin蛋白條帶的灰度值表示相對蛋白含量。

1.2.5 吖啶橙-溴乙錠(AO/EB)染色法檢測細胞生存 將MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于滅菌的玻片上24 h。瞬時轉(zhuǎn)染UHRF1-shRNA 48 h。加入吖啶橙-溴乙錠混合液染色100 mg/mL的AO以及100 mg/mL的EB融于PBS中。用熒光顯微鏡檢測細胞形態(tài)的變化(100×)。細胞凋亡率用以下公式檢測：凋亡率(%)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)。

1.2.6 Transwell法檢測侵襲能力的影響 將5×104個細胞加入無血清培養(yǎng)基的上室，接種前需提前鋪設(shè)Matrigel膠，加入1×104個細胞于血清培養(yǎng)基的上室，下室均為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。24 h后取出小室，依次經(jīng)甲醛固定及結(jié)晶紫染色，采用倒置顯微鏡計算侵襲或遷移細胞數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.2.7 劃痕實驗 將乳腺癌細胞接種至6孔板中，分別轉(zhuǎn)染NC組與UHRF1-shRNA組12 h后，待細胞完全貼壁，使用10 μL的槍頭對兩組細胞進行劃痕，磷酸鹽緩沖液清洗細胞并拍照觀察，100倍視野下隨機選擇3個視野進行記錄劃痕寬度。24 h后再拍照觀察，記錄劃痕寬度。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

用GraphPad Prism 5.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用t檢驗，Kruskal-wallis秩和檢驗或Wilcoxon秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沉默UHRF1后乳腺癌MDA-MB-231細胞活性的變化

UHRF1-shRNA與NC分別轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231細胞中作用48 h后，Western blot方法檢測其敲減效率(圖1A)。MTT方法檢測轉(zhuǎn)染UHRF1-shRNA后細胞活性的變化，分別與正常對照組以及NC組相比，UHRF1-shRNA轉(zhuǎn)染組細胞活性相較于正常對照組(50.28+3.89)%以及NC組(48.36+5.80)%(P<0.05)有所降低(圖1B)。通過AO/EB染色法和克隆形成實驗檢測MDA-MB-231增殖能力，發(fā)現(xiàn)與NC相比，UHRF1-shRNA組乳腺癌細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)(圖1C，圖1D)。

圖1 沉默UHRF1后對乳腺癌MDA-MB-231細胞活性的影響Figure 1 Knockdown UHRF1 affected the viability of MDA-MB-231 cellsNote：A.MDA-MB-231 cells were transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA and siRNA-depletion efficiency was examined by Western blot；B.MDA-MB-231 cells transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA were cultured and cell viability was analyzed by MTT assay；C.MDA-MB-231 cells transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA were subjected to AO/EB staining to detect changes in the nucleus.The orange-colored region indicated initiation of apoptosis；D.MDA-MB-231 cells transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA were seeded into 6-cm dishes at a density of 800 cells/dish.Colony formation was assessed by crystal violet staining.*P<0.05 vs.control or NC group.

2.2 沉默UHRF1對Caspase-3通路的影響

本研究首先檢測了線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax(圖2A)、Bad與p-Bad(圖2B)的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于NC組，沉默UHRF1后Bax與Bcl-2比值顯著上調(diào)(P=0.0233)，Bad蛋白表達相較于NC組顯著上調(diào)(P=0.0451)，而p-Bad蛋白相對于NC組顯著下調(diào)(P=0.0315)。同時通過Caspase-3的活性檢測，發(fā)現(xiàn)與NC組相比，轉(zhuǎn)染UHRF1-shRNA后MDA-MB-231細胞Caspase-3活性顯著升高(P=0.0194)(圖2C)，說明沉默UHRF1能夠抑制MDA-MB-231細胞增殖是依賴于Caspase-3的活化。隨后本研究又檢測了XIAP蛋白的表達，相對于NC組，沉默UHRF1后XIAP蛋白的表達顯著上調(diào)(P=0.0412)(圖2D)。

圖2 沉默UHRF1對于Bax，Bcl-2(A)Bad，p-Bad(B)以及Xiap(D)蛋白影響，及其對于caspase-3活性的改變Figure 2 Knockdown UHRF1 altered the expression of p-Bad，Bad，Bax，Bcl-2 and XIAP，and promoted caspase-3 activation in MDA-MB-231 cellsNote：Western blot was used to detect Bax，Bcl-2(A)，p-Bad，Bad，(B)and XIAP(D)expression in MDA-MB-231 cells transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA.Relative expression of Bax，Bcl-2，p-Bad，Bad and XIAP was normalized to β-actin.n=3 independent experiments for each group.(C)Activation of caspase 3 by UHRF1-shRNA or NC-shRNA.Data are averaged from five independent experiments for each group.*P<0.05 vs.NC group.

2.3 沉默UHRF1對于乳腺癌細胞MDA-MB-231侵襲能力的影響

Transwell以及Wound Healing實驗檢測沉默UHRF1對于細胞侵襲和遷移能力的影響，結(jié)果顯示UHRF1能夠明顯的抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的侵襲和遷移能力，說明UHRF1參與了MDA-MB-231的侵襲和遷移過程(圖3A，B)。

2.4 沉默UHRF1對于p53信號通路的影響

為進一步驗證UHRF1是否通過p53信號通路影響MDA-MB-231細胞增殖及侵襲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與NC組相比，UHRF1-shRNA組中p53，p21Cip1/Waf1，p16INK4a蛋白的表達顯著上調(diào)(P<0.05)(圖4)。

圖3 轉(zhuǎn)染UHRF1-shRNA對于乳腺癌細胞MDA-MB-231侵襲能力的影響Figure 3 UHRF1 shRNA inhibited the migration of MDA-MB-231 cellsNote：MDA-MB-231 cells were transfected with UHRF1-shRNA or NC-shRNA.(A)Wound-Healing assay was performed to analyze the effect of UHRF1 on cell migration.Representative images(100×)and quantitative analyses are shown；(B)Transwell assay in the presence or absence of matrigel was performed.*P<0.05 vs. NC group.

圖4 UHRF1-shRNA對于乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞凋亡通路的影響Figure 4 Knockdown UHRF1 increased the expression of p53，p21Cip1/Waf1 and p16INK4a in MDA-MB-231 cellsNote：A.p53 protein level；B.p21Cip1/Waf1 protein level；C.p16INK4a protein level.*P<0.05 vs.NC group.

3 討論

UHRF1基因是近些年深受廣大學(xué)者關(guān)注的一個凋亡相關(guān)基因[11]。目前，很多研究表明，其廣泛參與各種生物學(xué)過程，包括表觀遺傳調(diào)控[12]、細胞周期調(diào)控和細胞分化調(diào)控等眾多生命活動，成為遺傳學(xué)研究熱點?，F(xiàn)有的文獻報道，UHRF1對于肝癌[13]和胃癌[14]的發(fā)生發(fā)展有著巨大的影響。但是其對于乳腺癌增殖、侵襲的影響并沒有太多的相關(guān)報道，本研究主要通過沉默UHRF1來研究其對乳腺癌細胞系MDA-MB-231增殖的作用及其相關(guān)機制。

過度增殖是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[15]。本結(jié)果顯示，沉默UHRF1后，MDA-MB-231細胞的生存率均低于正常水平，表明沉默UHRF1能夠抑制乳腺癌細胞的增殖，克隆形成以及AO/EB的結(jié)果均印證了UHRF1能夠影響乳腺癌細胞系MDA-MB-231的活性?，F(xiàn)有的文獻[16]大多關(guān)于過表達UHRF1后對于增殖能力影響的研究，但是對于乳腺癌的研究鮮有報道。此外，本研究進一步發(fā)現(xiàn)沉默UHRF1基因后，MDA-MB-231細胞的增殖能力明顯降低，表明UHRF1對調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的增殖過程起到一定作用。

遷移和侵襲是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中重要的環(huán)節(jié)[17]。腫瘤細胞的遷移和侵襲能力與乳腺癌的預(yù)后密切相關(guān)，也是導(dǎo)致治療失敗的主要原因。本研究采用Transwell和WoundHealing實驗檢測發(fā)現(xiàn)沉默UHRF1后，MDA-MB-231細胞的侵襲遷移能力受抑制，表明UHRF1與乳腺癌細胞的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。

p53基因突變被認(rèn)為是目前所有人體腫瘤中最常見的基因改變。p53基因定位于染色體17p13.1，對細胞周期DNA的修復(fù)、合成、細胞分化、基因組的穩(wěn)定和細胞的凋亡起調(diào)控作用，p53通過對多種基因的調(diào)控引起G1、S和G2期停頓從而調(diào)控凋亡。Huang等[18]證明p53能夠參與到乳腺癌細胞凋亡的過程。Cao等[19]的研究同時證明了p53能夠參與到乳腺癌的侵襲。而本研究結(jié)果表明沉默UHRF1后能夠使p53蛋白表達上調(diào)，同時p53信號通路中重要蛋白p21Cip1/Waf1和p16INK4a蛋白表達也上調(diào)。

綜上所述，沉默UHRF1后，能夠抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖，同時也能夠抑制其侵襲的能力。而這種抑制增殖和侵襲的能力可能是通過上調(diào)Caspase-3活性，進而上調(diào)p53蛋白表達，然后激活下游的p21Cip1/Waf1和p16INK4a蛋白而實現(xiàn)的，以上研究為UHRF1對于乳腺癌的治療提供了理論依據(jù)。

1 Rao N，Qiu J，Wu J，et al.Significance of tumor-infiltrating lymphocytes and the expression of topoisomerase IIalpha in the prediction of the clinical outcome of patients with triple-negative breast cancer after taxane-anthracycline-based neoadjuvant chemotherapy[J]，Chemotherapy，2017，62(2)：246-255.

4 Joseph FJ，van Oepen A，F(xiàn)riebe M，et al.Breast sentinel lymph node biopsy with imaging towards minimally invasive surgery[J]，Biomed Tech(Berl)，2017[Epub ahead of print].

5 Treitl D，Radkani P，Rizer M，et al.Adenoid cystic carcinoma of the breast，20 years of experience in a single center with review of literature[J]，Breast Cancer，2017[Epub ahead of print].

6 Hopfner R，Mousli M，Jeltsch JM，et al.ICBP90，a novel human CCAAT binding protein，involved in the regulation of topoisomerase IIalpha expression[J]，Cancer Res，2000，60(1)：121-128.

7 Abu-Alainin W，Gana T，Liloglou T，et al.UHRF1 regulation of the keap1-nrf2 pathway in pancreatic cancer contributes to oncogenesis[J]，J Pathol，2016，238(3)：423-433.

8 Saidi S，Popov Z，Janevska V，et al.Overexpression of UHRF1 gene correlates with the major clinicopathological parameters in urinary bladder cancer[J].Int Braz J Urol，2017，43(2)：224-229.

9 Li XL，Xu JH，Nie JH，et al.Exogenous expression of UHRF1 promotes proliferation and metastasis of breast cancer cells[J].Oncol Rep，2012，28(1)：375-383.

10 Bonapace IM，Latella L，Papait R，et al.Np95 is regulated by E1A during mitotic reactivation of terminally differentiated cells and is essential for S phase entry[J].J Cell Biol，2002，157(6)：909-914.

11 Subramani R，Gangwani L，Nandy SB，et al.Emerging roles of microRNAs in pancreatic cancer diagnosis，therapy and prognosis(Review)[J].Int J Oncol，2015，47(4)：1203-1210.

12 Kang SM，Lee HJ.MicroRNAs in human lung cancer[J].Exp Biol Med(Maywood)，2014，239(11)：1505-1513.

13 Ahmed K，Tabuchi Y，Kondo T.Hyperthermia：an effective strategy to induce apoptosis in cancer cells[J].Apoptosis，2015，20(11)：1411-1419.

14 Chen WM，Huang MD，Sun DP，et al.Long intergenic non-coding RNA 00152 promotes tumor cell cycle progression by binding to EZH2 and repressing p15 and p21 in gastric cancer[J].Oncotarget，2016，7(9)：9773-9987.

15 Li J，Zhang N，Zhang R，et al.CDC5L Promotes hTERT expression and colorectal tumor growth[J].Cell PhysiolBiochem，2017，41(6)：2475-2488.

16 Seo JS，Choi YH，Moon JW，et al.Hinokitiol induces DNA demethylation via DNMT1 and UHRF1 inhibition in colon cancer cells[J].BMC Cell Biol，2017，18(1)：14.

17 Li J，Zhang N，Zhang R，et al.CDC5L Promotes hTERT expression and colorectal tumor growth[J].Cell Physiol Biochem，2017，41(6)：2475-2488.

18 Huang L，Li A，Liao G，et al.Curcumol triggers apoptosis of p53 mutant triple-negative human breast cancer MDA-MB 231 cells via activation of p73 and PUMA[J].Oncol Lett，2017，14(1)：1080-1088.

19 Cao Y，Lin M，Bu Y，et al.p53-inducible long non-coding RNA PICART1 mediates cancer cell proliferation and migration[J].Int J Oncol，2017，50(5)：1671-1682.

EffectofsilencingUHRF1onproliferationandmetastasisofbreastcancercells

CHENZhuo，KONGYiran

Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China

ObjectiveThe objective of this study was to investigate the effect of UHRF1 on the proliferation and metastasis of breast cancer MDA-MB-231 cells and its mechanism.MethodsThe effect of silencing UHRF1 gene on the viability of MDA-MB-231 cells was detected by MTT assay.Colony formation assay was performed to analyze the effect of silencing UHRF1 on cell survival of MDA-MB-231 cells.The effect of silencing UHRF1 on the apoptosis of MDA-MB-231 cells was detected by acridine orange-ethidium bromide (AO / EB).Caspase-3 activity kit was used to detect the expression of caspase-3 in MDA-MB-231 cells.The expressions of Bcl-2，Bax，Bad，p-Bad，XIAP，p53，p21Cip1/Wafand p16INK4awere detectedby Western blot.The abilities of invasion and migration of MDA-MB-231 cells silenced by UHRF1were examined by Transwell and Wound healing assays，respectively.ResultsSilencing UHRF1 significantlydecreased the viability of MDA-MB-231 cells.Silencing UHRF1 decreased colony formation in MDA-MB-231 cells.Depletion of UHRF1 resulted in apoptosis inducedin MDA-MB-231 cells，showing nuclear morphological changes by AO/EB staining and increasing caspase-3 activity.After knockdown of UHRF1，the expression of Bad，XIAP，Bax，p53，p21Cip1/Waf1and p16INK4awas up-regulatedand down-regulated the expression of p-Bad and Bcl-2 in MDA-MB-231 cells.Transwell and wound healing assays demonstrated that silencing UHRF1 could decrease metastasisin MDA-MB-231 cells.ConclusionSilencing UHRF1 can inhibit the viability and survival of MDA-MB-231 cells，and inhibit the invasion and migration of MDA-MB-231 cells regulated by p53/p21Cip1/Waf1/p16INK4asignalings.

UHRF1；Breast cancer；p53；Metastasis；Apoptosis

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(哈爾濱 150081)

陳琢，女，(1987-)，碩士，住院醫(yī)師，從事外科疾病的研究。

陳琢，E-mail：zhuochen930@hotmail.com

R737.9

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.06.006

(收稿：2017-07-14)