雷 蕾 葉慶華 王國增 黃賢莉 吳乾渝

Aurora-A在宮頸癌及癌前病變中的表達以及與HPV感染的相關性研究

雷 蕾1葉慶華1王國增1黃賢莉1吳乾渝2

目的分析正常宮頸、不同級別宮頸上皮內瘤變(Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宮頸鱗狀細胞癌(Cervical squamous cell carcinoma，SCC)組織中Aurora-A的表達差異，觀察其異常表達對宮頸癌變過程的影響及與人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)感染的相關性，了解Aroura-A在CIN與宮頸癌發(fā)病機制中的作用。方法選取已進行宮頸管分泌物高危型HPV檢測的宮頸活檢或手術標本存檔蠟塊100例，其中正常宮頸組織20例，CIN1級組織20例、CIN 2級組織20例、CIN 3級組織20例，宮頸癌全部選取的是宮頸鱗狀細胞癌組織20例。采用免疫組化方法檢測Aurora-A蛋白的表達水平，并分析Aurora-A表達與HR-HPV感染的相關性。結果Aurora-A在CIN以及宮頸癌中存在高表達(P<0.05)，且其陽性表達率隨著宮頸病變程度的加深而增強，兩者呈正相關性(r=0.475，P<0.001)；在高級別宮頸上皮內瘤變(CIN2、3)組織中，Aurora-A表達與HPV感染間存在正相關(V=0.591，P<0.05)。結論Aurora-A的異常表達可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切有關，Aurora-A可能作為早期診斷CIN或宮頸癌的重要分子生物學指標，同時也可能是宮頸癌的潛在治療靶點。

Aurora-A；中心體；人乳頭瘤病毒；宮頸上皮內瘤變；宮頸癌

宮頸癌(Cervical cancer)是婦科常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一[1]，根據《2016年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析》報告統(tǒng)計，宮頸癌居我國女性惡性腫瘤發(fā)病率前五位，嚴重影響廣大女性的身心健康[2]。研究表明，宮頸上皮內瘤變反映了宮頸癌發(fā)生發(fā)展的連續(xù)過程，是與宮頸浸潤癌密切相關的一組癌前病變。從宮頸上皮內瘤變發(fā)展到宮頸浸潤癌是一個漫長但是可逆轉的過程，多種因素在這個過程中起作用，眾多研究一致認為，高危型人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染與CIN和宮頸癌的發(fā)生密切相關。隨著對腫瘤分子生物學研究的加深，中心體在腫瘤發(fā)生發(fā)展早期階段的作用受到廣泛關注，中心體缺陷可能通過染色體不穩(wěn)定性在宮頸癌形成的最早期階段發(fā)揮作用。Aurora-A蛋白激酶是一種中心體相關蛋白，其基因擴增和高表達會引起中心體復制擴增以及功能異常，進而使細胞惡性轉化而最終導致腫瘤的形成[3-4]。Aurora-A在多種腫瘤中存在過表達，與腫瘤病理、臨床分期及預后緊密相關，被認為是一個新的癌基因[5]。但在宮頸癌特別是癌前病變中Aroura-A的表達還沒有廣泛和深入的研究[6]。本研究擬選取人正常宮頸、不同級別CIN和宮頸鱗癌組織，檢測各組中Aurora-A的表達差異，分析Aurora-A的異常表達與HPV感染的相關性，明確Aurora-A是否是HPV的作用位點，從而為宮頸癌的早期診斷和預防提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

隨機選取東方醫(yī)院婦產科2008年11月—2012年5月已進行宮頸管分泌物高危型HPV檢測的宮頸活檢或手術切除標本存檔蠟塊100例。所有患者年齡在30～55歲之間，性生活3年以上，有完整隨訪資料。高危型HPV DNA檢測應用雜交捕獲二代技術：高危型HPV(+)宮頸病變59例，高危型HPV(-)宮頸病變41例。宮頸癌組織學類型按WHO標準選取宮頸鱗癌共20例，CIN1、2、3級各20例。所有宮頸癌患者術前均未行化療、放療或激素治療；無合并其他疾??；無生殖道系統(tǒng)炎癥；排除同時合并子宮內膜病變者。

正常宮頸組織20例，選自因子宮肌瘤入院行全子宮切除術的標本，所有子宮切除的患者均行宮頸液基細胞學檢查排除宮頸疾病。以上所有組織標本的獲取和使用均經過上海市東方醫(yī)院倫理委員會的審核通過，并經過患者或患者家屬簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

使用免疫組化二步法檢測組織標本中Aurora-A的表達水平。

1.3 結果判斷

由兩位病理科醫(yī)生，在雙盲條件下判斷免疫組化結果，出現結果不一致時，共同討論決定。

Aurora-A結果的判斷：在光學顯微鏡下觀察組織標本的著色程度。Aurora-A蛋白陽性表達主要表現為細胞漿以及細胞核內呈現棕黃色或者棕褐色顆粒，高倍鏡下(放大200倍)隨機取4個不同的視野，計算陽性細胞占比，陽性細胞率≤25%為1分，>25%且≤50%為2分，>50%且≤75%為3分，>75%為4分；同時根據染色程度計分，不染色1分，弱染色2分，中等強度染色3分，強染色4分；根據兩者的乘積判斷結果：≤4分為(-)；>4且≤8為(+)；>8且≤12為(++)；>12且≤16為(+++)。統(tǒng)計分析時(-)和(+)合為陰性或弱陽性表達，(++)和(+++)合為強陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數資料采用卡方檢驗及Fisher精確概率分析，相關性分析用等級變量的Spearman秩相關分析和分類變量的卡方檢驗進行列聯(lián)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Aurora-A在CIN以及宮頸癌組織中的表達

在宮頸鱗癌組織中，Aurora-A表達定位于宮頸癌細胞的胞漿及胞核，表達較強，呈棕黃色，陽性細胞較多；在CIN組織中，Aurora-A表達以胞漿著色為主，表達強度中等(圖1)。在正常宮頸組織中Aurora-A幾乎不表達，只有1例呈弱陽性表達。Aurora-A在正常宮頸、CIN 1、CIN 2、CIN 3、宮頸鱗癌組織中的陽性表達率依次升高。Spearman相關分析結果顯示Aurora-A的表達和宮頸病變程度呈正相關關系(r=0.475，P<0.001)(表1)。進一步研究發(fā)現，在CIN組中Aurora-A存在過表達；其中高級別上皮內瘤變(CIN 2、3)中Aurora-A的陽性表達率為45%(18/40)，低級別上皮內瘤變(CIN 1)中Aurora-A的陽性表達率為15%(3/20)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.022)(表2)。

圖1 Aurora-A在CIN1、CIN2、CIN3和宮頸鱗癌中的陽性表達Figure 1 Positive expression of Aurora-A in CIN1-3 and SCCNote：A.HE；B.IHC.

表1 Aurora-A在不同宮頸組織中的表達情況(n，%)Table 1 The expression of Aurora-A protein in different cervical tissues(n，%)

Note：1.The difference between the five groups was analyzed by Chi-square test regarded as significant difference：P<0.05；2.The correlation between Aurora-A and cervical lesions was analyzed by Spearman correlation analysis showed significant positive correlation：r：0.475，P<0.05.

表2 Aurora-A在宮頸上皮內瘤變組織中的表達情況(n，%)Table 2 The expression of Aurora-A protein in different degrees of CIN(n，%)

Note：The difference between the two groups was analyzed by Chi-square test regarded as significant difference：P=0.022，P<0.05.

2.2 HPV在CIN以及宮頸癌組織中的表達

HR-HPV在正常宮頸、CIN 1、CIN 2、CIN 3、宮頸鱗癌組織中的陽性表達率分別為20%(4/20)、35%(7/20)、60%(12/20)、80%(16/20)、100%(20/20)(圖2)。五組間比較使用卡方檢驗，結果顯示，HR-HPV在這五組間的陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。HPV和宮頸病變程度的相關分析使用卡方檢驗求Cramer′sV系數，V=0.591，P<0.05，呈顯著正相關(表3) 。

表3 HPV在不同宮頸組織中的表達Table 3 The HPV infection in different cervical tissues(n，%)

Note：1.The difference between the five groups was analyzed by Chi-square test：P<0.05，regarded as significant difference；2.The correlation between HPV and cervical lesions was analyzed by Spearman correlation analysis showed significant positive correlation：r：0.455，P<0.05.

2.3 Aurora-A表達與HPV感染的相關性

選取的標本均檢測HR-HPV，結果顯示HPV在正常宮頸、CIN 1、CIN 2、CIN 3、宮頸鱗癌組織中的陽性表達率分別為20%(4/20)、35%(7/20)、60%(12/20)、80%(16/20)、100%(20/20)。使用卡方檢驗進行列聯(lián)分析，其中φ的絕對值<0.3無相關，φ的絕對值>0.3有相關，但相關較弱，φ的絕對值>0.6有相關，相關較強。在正常宮頸組織中Aurora-A和HPV的共陽性表達率為0%(0/20)，不具有相關性(φ=-0.115，P>0.05)；在CIN1中兩者共陽性表達率為5.00%(1/20)，不具有相關性(φ=-0.015，P>0.05)；在CIN2、3兩者共陽性表達率為40.00%(16/40)，呈正相關關系(φ=0.373，P<0.05)；宮頸鱗癌HPV陽性表達率為100 %，無法進行統(tǒng)計學分析(表4)。

表4 Aurora-A與HPV在不同宮頸組織中表達的比較Table 4 Comparison of Aurora-A and HPV infection in different cervical tissues(n，%)

3 討論

流行病學和基礎研究已經明確高危型人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌前病變以及宮頸癌的關鍵因素。近年來，眾多學者在分子生物學領域對腫瘤發(fā)生機制進行深入研究，發(fā)現中心體相關蛋白的異常表達導致上皮細胞中心體復制異常以及分離缺陷，在有絲分裂期使染色體錯誤分離以及分配不平衡，導致染色體不穩(wěn)定以及非整倍體形成，是腫瘤發(fā)生的早期事件[8]。作為一個定位于中心體上的蛋白激酶，Aurora-A與中心體密切相關，在本實驗中，我們發(fā)現Aurora-A的陽性表達率隨著CIN的發(fā)展逐漸升高，宮頸癌中陽性表達率最高，我們推測隨著CIN級別的進展，中心體異常情況加深。呂玉宇等[9]研究發(fā)現Caski細胞的中心體微管蛋白表達水平明顯高于H8細胞，說明中心體擴增是宮頸癌的重要特征之一。同時，高危HPV感染可能引起中心體異常，在宮頸癌前病變中甚至可以出現病理性核分裂。Skyldberg等[10]發(fā)現在高危HPV感染的宮頸病變中，隨著宮頸上皮內瘤變的發(fā)展，中心體數目逐漸增加，宮頸癌中心體數目明顯高于CIN。Duensing等[11]研究發(fā)現，同時表達HPVE6、E7癌基因的宮頸細胞中出現中心體數目異常，影響雙極紡錘體的形成，從而導致染色體非整倍體以及基因組不穩(wěn)定。所以我們推測Aurora-A的過表達通過導致中心體異常引起染色體不穩(wěn)定，從而導致基因組不穩(wěn)定，可能是其介導宮頸癌發(fā)生與發(fā)展的重要機制之一。

在本課題中，我們發(fā)現Aurora-A在正常宮頸、不同級別CIN、宮頸鱗癌組織中的陽性表達率依次升高，在CIN2、3組織中Aurora-A和HPV共陽性表達率呈正相關關系，提示Aurora-A可能在CIN到宮頸癌的進展過程中起到一定作用。我們推測Aurora-A可能通過以下途徑促進宮頸癌發(fā)生：(1)Aurora-A參與p53細胞調控通路，使抑癌基因p53失活，導致腫瘤發(fā)生[12]。在宮頸癌的發(fā)生過程中，HPV E6可通過形成E6-AP復合物的介導，促使p53進入泛素依賴的降解途徑[13]。而Aurora-A可以直接磷酸化p53的ser315位點，促進Mdm2與p53結合，并通過泛素化途徑降解p53蛋白[14]，進一步實驗發(fā)現，抑制Aurora-A的表達可以減少p53的315位絲氨酸的磷酸化，增強其穩(wěn)定性，使細胞周期阻止在G2/M期。Aurora-A還可以磷酸化p53的ser215位，下調其下游靶基因的表達，從而使p53失活，細胞逃離正常凋亡，處于無限增殖[15]；(2)Aurora-A通過上調c-myc表達，誘導端粒酶活性參與轉化細胞。研究證實端粒酶的激活與宮頸異型增生和宮頸癌的進展過程相關。原癌基因c-myc編碼的蛋白可直接結合到多種細胞hTERT基因的核心啟動子5′端的E-box上，調節(jié)hTERTmRNA的表達，激活端粒酶，誘導細胞轉化和腫瘤形成[16]。體外實驗已證實Aurora-A高表達在卵巢癌細胞HIOSE118和乳腺癌細胞株MCF-710A中上調c-myc，誘導端粒酶活性[17]。Yang等[18]亦在研究發(fā)現，Aurora-A的高表達不僅可以誘導c-myc蛋白表達升高，增加其轉錄活性，并且可促進中心體擴增的能力。說明Aurora-A在宮頸細胞的惡性轉化中有樞紐作用。所以我們推測Aurora-A可能主要通過以上兩個方面在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起作用。

隨著腫瘤分子生物學的發(fā)展，對宮頸癌的研究已經深入到細胞分子和基因水平。在人類惡性腫瘤中廣泛存在中心體異常，且都發(fā)生在腫瘤發(fā)生早期，Aurora-A是與中心體功能密切相關的一類蛋白激酶，其高表達于人類多種惡性腫瘤組織中，已經明確為一種新的癌基因。Aurora-A蛋白表達可作為早期診斷宮頸癌的重要分子生物學指標，其也是一種潛在的腫瘤治療靶點，研發(fā)Aurora-A蛋白激酶抑制劑可能為宮頸癌的臨床治療提供助力。

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ExpressionofAurora-Aincervicalcancerandprecancerouslesions，anditscorrelationwithHPVinfection

LEILei1，YEQinghua1，WANGGuozeng1，HUANGXianli1，WUQianyu2

1.Department of Obstetrics and Gynecology，Dongfang Hospital，Tongji University，Shanghai 200123，China；2.Shanghai Municipal Health and Family Planning Commission

ObjectiveThe objectives of this study were to investigate the expression of Aurora-A protein in cervical cancer and precancerous lesions，and its relationship with human papilloma virus(HPV)infection，and to analyze the role of Aurora-A in the pathogenesis of cervical cancer.MethodsOne hundred cases of cervical biopsy or surgical resection specimens were collected from high-risk HPV(HR-HPV)test.There were 20 cases of normal cervical tissues，20 cases of CIN grade 1(CIN1)，20 cases of CIN grade 2(CIN2)，20 cases of CIN grade 3(CIN3)，and 20 cases of cervical squamous cell carcinoma.The expression of Aurora-A protein was detected by immunohistochemistry and the correlation between Aurora-A expression and HR-HPV infection was analyzed.ResultsAurora-A was highly expressed in cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer(P<0.05)，and its positive expression rate increased with the degree of cervical lesions.There was a positive correlation between Aurora-A expression and cervical cancer(r=0.475，P<0.001).There was a positive correlation between Aurora-A expression and HR-HPV infection in CIN2 and CIN3(V=0.591，P<0.05).ConclusionAurora-A may be associated with the development of cervical cancer.Aurora-A can be used as an important biomarker for the early diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia or cervical cancer.It is also a potential therapeutic target for cervical cancer.

Aurora-A；Centrosome；Human papillomavirus；Cervical intraepithelial neoplasia；Cervical cancer

上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會面上項目(201640246)

1.同濟大學附屬東方醫(yī)院婦產科(上海 200123)；2.上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會

雷蕾，女，(1980-)，碩士，主治醫(yī)師，從事婦科腫瘤的研究。

吳乾渝，E-mail：wuqianyu369@163.com

R737.3

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.06.003

(收稿：2017-05-18)