孟永生

番茄紅素對人骨肉瘤細胞生長的影響及機制研究

孟永生

目的研究番茄紅素(Lycopene，LP)對人骨肉瘤MG-63細胞增殖和凋亡的影響并初步探討其機制。方法取處于對數(shù)生長期的人骨肉瘤MG-63細胞，設空白對照組，LP低、中、高劑量組(5、10、20 μg/mL)和順鉑(40 μg/mL)組；給藥干預48 h，觀察細胞生長狀況，MTT比色法檢測細胞增殖抑制率，流式細胞術(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測細胞周期、細胞凋亡狀況并計算凋亡率，逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測凋亡相關基因Bax mRNA、bcl-2 mRNA表達并計算Bax/bcl-2值，免疫蛋白印跡法(Western blot)檢測凋亡相關蛋白caspase-3表達。結(jié)果光學顯微鏡下觀察可見，空白對照組人骨肉瘤MG-63細胞呈貼壁生長，增殖迅速，而LP組細胞增殖受到抑制，細胞數(shù)明顯減少，呈現(xiàn)回縮、脫落現(xiàn)象。與空白對照組比較發(fā)現(xiàn)經(jīng)LP干預48 h能夠顯著提高人骨肉瘤MG-63細胞增殖抑制率，顯著延長細胞周期G0/G1期并縮短S期、G2/M期，顯著提高細胞凋亡率(Apoptosis index，AI)，上調(diào)Bax mRNA表達并下調(diào)bcl-2 mRNA表達，顯著提高Bax/bcl-2比值，顯著上調(diào)caspase-3蛋白表達，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論LP具有抑制人骨肉瘤細胞增殖并促進其凋亡的藥理學作用，機制可能與阻滯細胞周期和影響凋亡調(diào)控基因、蛋白表達有關。

番茄紅素；骨肉瘤細胞；增殖；凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

骨肉瘤多發(fā)于青少年，其發(fā)病率高、預后差、生存期短，是臨床上亟待解決的醫(yī)學難題之一。番茄紅素(Lycopene，LP)是一種具有多種生物學活性的類胡蘿卜素[1-2]，近年來LP抗腫瘤作用逐漸得到廣大醫(yī)藥研究者的普遍關注。既往研究發(fā)現(xiàn)，LP對肺癌細胞、胃癌細胞、卵巢癌細胞生長均表現(xiàn)出一定的抑制作用[3-5]，抑制細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡和阻滯細胞周期是其主要的作用機制，但LP是否對骨肉瘤細胞生長具有一定的抑制作用尚未見文獻報道，本研究通過體外培養(yǎng)人骨肉瘤MG-63細胞并給予LP進行干預，并對比順鉑組療效，探討分析LP對人骨肉瘤細胞增殖和凋亡的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物與試劑

人骨肉瘤MG-63細胞株由河北醫(yī)科大學細胞生物研究室惠贈；LP購自南京澤朗生物科技有限公司(批號：20141218，純度≥96%)；順鉑注射液購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；caspase-3單抗購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 人骨肉瘤MG-63細胞株經(jīng)常規(guī)解凍復蘇后使用DMEM高糖培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞，滴加10%胰酶進行消化處理，然后調(diào)整細胞濃度為5×104/mL，分別設空白對照組，LP低、中、高劑量組(5、10、20 μg/mL)和順鉑(40 μg/mL)組，每組設10個復孔。

1.2.2 光學顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)以及MTT法檢測細胞增殖抑制率 給藥48 h后，各組細胞通過倒置光學顯微鏡觀察生長狀態(tài)。MTT法檢測細胞增殖抑制率：將人骨肉瘤MG-63細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組設6個復孔，每孔加入 MTT(5 mg/mL)20 μL，37℃孵育4 h后，去上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩 15 min后，酶標儀于波長490 nm處測定吸光度(OD)，計算公式：細胞增殖抑制率(%)=[1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%

1.2.3 FCM法檢測細胞周期和細胞凋亡狀況 遵照流式細胞術檢測試劑盒操作方法步驟，各組細胞經(jīng)PBS洗滌3次后分別加入70%乙醇5 mL，置4℃環(huán)境48 h后離心取細胞，加5 μL濃度為10 mg/mL的水解酶Rnase，37℃放置1 h后加入碘化丙啶染液，避光孵育30 min后行FCM檢測，通過CELL Quest軟件檢測分析細胞周期時相及凋亡狀況。

1.2.4 RT-PCR法檢測bcl-2 mRNA、bax mRNA表達 查詢并設計合成大鼠bcl-2、Bax、β-actin基因上、下游引物(Bcl-2引物上游：5′-CCTTTGTGTAACTGTACGGCC-3′，下游：5′-CTTTGGCAGTAAATAGCTGATTCGAC-3′，擴增片段長度317bp；Bax引物上游：5′-GGATGCGTCCACCAAGAA-3′，下游：5′-TCCCGGAGGAAGTCC ATT-3′，擴增片段長度282bp；β-actin引物上游：5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAA-3′，下游：5′-AAAGAAAGGGAGTAAACCGCA-3′，擴增片段長度432bp)。經(jīng)胰酶消化并收集各組細胞，加入適量TRIzol試劑提取總RNA并測定濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后行PCR反應，擴增完畢后取PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳，最后通過凝膠成像儀觀察并照相。以β-actin為內(nèi)參，通過對比條帶灰度值半定量分析bcl-2mRNA、Bax mRNA表達并計算Bax/bcl-2值。

1.2.5 Western blot法檢測caspase-3蛋白表達 各組細胞加入冷裂解液后行超聲裂解，恒溫4℃低溫離心(轉(zhuǎn)速12 000 rpm，20 min)取沉淀，BCA法檢測蛋白濃度，沸水浴加熱5 min行蛋白變性后上樣(30 μg)，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，滴加一抗(1∶500)caspase-3、β-actin 4℃過夜，洗膜、二抗(1∶100)室溫孵育1 h后經(jīng)ECL系統(tǒng)顯影；以β-actin為內(nèi)參，通過對比條帶灰度值半定量分析caspase-3蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)運用SPSS 17.0軟件進行數(shù)理統(tǒng)計分析，計量資料多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞生長狀態(tài)觀察結(jié)果

空白對照組細胞呈貼壁生長、增殖迅速，生長狀態(tài)良好；較空白對照組，LP各干預組和順鉑組細胞生長狀態(tài)較差：細胞增殖受到抑制，細胞數(shù)明顯減少，呈現(xiàn)回縮、脫落現(xiàn)象，其中以LP高劑量組細胞生長狀態(tài)最差(圖1)。

2.2 各組細胞增殖抑制率測定結(jié)果

較空白對照組，LP各劑量組和順鉑組人骨肉瘤MG-63細胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.01)；較順鉑組，LP高劑量組細胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)(表1)。

圖1 各組細胞生長狀況Figure 1 The cell growth status in each groupNote：A.The cells in the control group；B.The cells in the low dose of LP group；C.The cells in the medium dose of LP group；D.The cells in the high dose of LP group；E.The cells in the Cisplatin group.

表1 LP對細胞增殖的抑制率Table 1 The inhibitory rate of MG-63 cells treated with LP or Cisplatin(±s)

Note：**P<0.01，compared to the control group；△P<0.05，compared to the Cisplatin group.

2.3 各組細胞周期測定結(jié)果

較空白對照組，LP中、高劑量組人骨肉瘤MG-63細胞周期G0/G1期均顯著延長(P<0.05)，S期和G2/M期顯著縮短(P<0.05)；順鉑組G2/M期顯著縮短(P<0.01)；與順鉑組比較，LP高劑量組G0/G1期顯著延長且S期、G2/M期顯著縮短(P<0.05)(表2)。

表2 LP對細胞周期的影響Table 2 The distribution of cell cycle in MG-63 cells treated with LP or Cisplatin(±s)

Note：*P<0.05，**P<0.01，compared to the control group；△P<0.05，compared to the Cisplatin group.

2.4 各組細胞凋亡狀況及凋亡指數(shù)(AI)結(jié)果

較空白對照組，LP各組和順鉑組人骨肉瘤MG-63細胞凋亡數(shù)明顯增多，其中以LP高劑量組最為顯著(圖2)；計算AI結(jié)果如表3所示，較空白對照組，LP各組和順鉑組人骨肉瘤MG-63細胞AI顯著升高(P<0.01)，其中LP高劑量組AI顯著高于順鉑組(P<0.01)。

圖2 流式細胞術檢測各組細胞凋亡狀況Figure 2 The apoptosis in MG-63 cells treated with LP or CisplatinNote：A.The cells in the control group；B.The cells in the low dose of LP group；C.The cells in the medium dose of LP group；D.The cells in the high dose of LP group；E.The cells in the Cisplatin group.

表3 不同濃度LP對細胞凋亡指數(shù)的影響Table 3 The apoptotic index(AI)in MG-63 cells treated with LP or Cisplatin(±s)

Note：**P<0.01，compared to blank control group；△△P<0.01，compared to cisplatin group.

2.5 bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達檢測和Bax/bcl-2比值

較空白對照組，LP中、高劑量組和順鉑組MG-63細胞凋亡相關基因bcl-2 mRNA表達顯著下調(diào)、Bax mRNA顯著上調(diào)(P<0.05)，Bax/bcl-2值顯著提高(P<0.05)；較順鉑組，LP高劑量組bcl-2 mRNA表達顯著降低(P<0.05)、Bax mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)、Bax/bcl-2值顯著升高(P<0.05)(表4)。

表4 各組細胞bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達Table 4 mRNA levels of Bax and bcl-2 were detected in MG-63 cells treated with LP or Cisplatin(±s)

Note：*P<0.05，**P<0.01，compared to the control group；△P<0.05，compared to the Cisplatin group.

2.6 各組細胞caspase-3蛋白表達檢測結(jié)果

較空白對照組，LP低、中、高劑量組和順鉑組MG-63細胞caspase-3蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.01)；較順鉑組，LP高劑量組caspase-3蛋白表達量升高(P<0.05)(圖3，表5)。

圖3 各組細胞caspase-3蛋白表達Figure 3 The expression of caspase-3 protein in MG-63 cellsNote：A.The control group；B.The low dose of LP group；C.The medium dose of LP group；D.The high dose of LP group；E.The Cisplatin group.

表5 各組細胞caspase-3蛋白表達Table 5 The expression of caspase-3 protein was detected in MG-63 cells treated with LP or Cisplatin(±s)

Note：*P<0.05，**P<0.01，compared to the control group；△P<0.05，compared to the Cisplatin group.

3 討論

骨肉瘤患者每年新發(fā)約50/10萬[6]，且多發(fā)于青少年，臨床上主要采取早期截肢手術輔以術前術后化療的治療方案，但80%的患者因確診時體內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶而致使療效不佳[7]，5年生存率僅30%左右。因此，以抑制骨肉瘤細胞生長為切入點研究高效、低毒的新型抗腫瘤藥物仍是醫(yī)藥工作者迫待解決的問題。

LP具有多種生物學活性[1-2]，近年來LP的抗腫瘤活性逐年得到人們的關注，張玉江等[3]等研究發(fā)現(xiàn)LP能夠抑制人肺癌H520細胞的侵襲和遷移從而抑制肺癌細胞的擴散；范現(xiàn)英等[8]總結(jié)分析發(fā)現(xiàn)LP具有增強機體免疫力、誘導胃癌細胞凋亡的作用；于海榮等[9]通過體外細胞實驗研究發(fā)現(xiàn)LP通過改變膜電位、誘導氧化應激反應來抑制人宮頸癌HeLa細胞增殖；魯昊等[10]通過體外培養(yǎng)人喉癌Hep-2細胞并給予LP進行干預研究發(fā)現(xiàn)，LP能夠通過改變細胞周期來起到抑制Hep-2細胞增殖的作用。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LP干預48 h能夠?qū)⑷斯侨饬鯩G-63細胞周期顯著阻滯于G0/G1期，抑制細胞生長增殖并促進其凋亡，并且LP 20 μg/mL組上述藥理學作用優(yōu)于順鉑40 μg/mL組；提示LP具有抑制人骨肉瘤細胞增殖并促進其凋亡的作用。

caspase-3參與細胞凋亡的啟動及整個凋亡過程的調(diào)節(jié)，在細胞凋亡的調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用；而Bcl基因家族中的bcl-2能夠抑制線粒體破裂，可直接與多種凋亡刺激因子結(jié)合而抑制caspase-3激活，并且抑制促凋亡蛋白Bax細胞毒性作用，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣濃度，從而起到抑制細胞凋亡的作用[11]；Bax具有誘導線粒體滲透性改變從而釋放細胞色素C、激活促凋亡蛋白caspase-9的作用，表現(xiàn)出促細胞凋亡作用[12]。此外，Bax能夠與bcl-2聚合成二聚體而互相抑制活性，因此Bax/bcl-2比值更加能夠反應二者對細胞凋亡的調(diào)控作用[13]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LP干預48 h后，能夠有效上調(diào)人骨肉瘤MG-63細胞caspase-3蛋白表達，上調(diào)Bax mRNA表達、下調(diào)bcl-2 mRNA表達，提高Bax/bcl-2比值，并且LP 20 μg/mL組對caspase-3、bcl-2 mRNA及Bax/bcl-2的表達調(diào)控作用均優(yōu)于順鉑組。

綜上所述，LP對人骨肉瘤細胞生長起到一定的抑制作用，機制可能與LP阻滯細胞周期于G0/G1期以及調(diào)節(jié)凋亡調(diào)控相關基因和蛋白表達有關。

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Effectoflycopeneonthegrowthofhumanosteosarcomacellsanditsmechanism

MENGYongsheng

Wu′an First People ′s Hospital，Handan 056300，China

ObjectiveThe objective of this study was to investigate the effect of lycopene(LP)on the proliferation and apoptosis of human osteosarcoma MG-63 cells and to explore its mechanism.MethodsMG-63 cells in the logarithmic growth phase were treated with LP(5，10 and 20 μg/mL)or Cisplatin(40 μg/mL)for 48 h.No LP or Ciplatin treatment was as the control group.The cell growth status was observed and the cell proliferation was measured by MTT colorimetric assay.Flow cytometry(FCM)was used to detect the cell cycle and apoptosis of MG-63 cells and the apoptotic rate was calculated in this study.Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to measure mRNA levels of Bax and bcl-2，and calculate the ratio of Bax/bcl-2 in MG-63 cells.Western blot also was used to examine the expression of caspase-3 protein in MG-63 cells.ResultsMG-63 cells were adherent and proliferated rapidly in the control group.The cells in LP treated groups showed that the cell proliferation was inhibited and the number of cells was significantly decreased，with retraction and detaching.The inhibitory rate of MG-63 cells in LP treated group were significantly increased when compared to the control group.LP significantly prolonged the cell cycle at the G0/G1phase and shortened the cell cycle at the S and G2/M phase.LP also significantly increased the apoptosis rate，up-regulated the mRNA level of Bax，down-regulated the mRNA level of bcl-2，increased the ratio of Bax/bcl-2 and the expression of caspase-3 protein in MG-63 cells(P<0.05 orP<0.01).ConclusionLP may effectively inhibit the proliferation of MG-63 cells and promote the apoptosis.The mechanism may be related to the cell cycle and the regulation of apoptosis and gene expression.

Lycopene；Osteosarcoma；Proliferation；Apoptosis；Caspase-3

武安市第一人民醫(yī)院(邯鄲 056300)

孟永生，男，(1964-)，本科，副主任醫(yī)師，從事骨科疾病的研究。

孟永生，E-mail：chaixuze666@163.com

R738.7

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.06.005

(收稿：2017-06-14)