逯代鋒, 楊傳東, 董 鋒, 周 勇, 嚴 實

·實驗與臨床·

酸性成纖維細胞生長因子復(fù)合膠原蛋白對兔前交叉韌帶重建后腱-骨愈合的影響

逯代鋒, 楊傳東, 董 鋒, 周 勇, 嚴 實

目的觀察酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)復(fù)合膠原蛋白對兔前交叉韌帶(ACL)重建后腱-骨界面愈合的影響。方法將30只新西蘭白兔隨機分為實驗組與對照組,每組15只,均取趾長伸肌腱作為移植物。實驗組將aFGF/膠原蛋白復(fù)合物植入到重建的ACL腱-骨界面,對照組單純行ACL重建。于術(shù)后第4、8、12周分別處死動物取材,將股骨與脛骨端分別固定于生物力學(xué)試驗機上,測試移植肌腱的腱-骨界面抗拉伸強度,取其絕對值作比較;同時,將股骨隧道和脛骨隧道縱向剖開,取下標本組織學(xué)觀察移植物界面愈合情況。結(jié)果術(shù)后第4、8、12周抗拉力強度實驗組強于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。兩組動物均在第4周時移植物與骨隧道之間均形成了纖維結(jié)締組織。術(shù)后第12周,實驗組肌腱移植物在骨隧道內(nèi)形成了纖維軟骨移行帶,類似于正常的纖維軟骨連接,而對照組則形成了走向與骨隧道軸向垂直的Sharpey樣纖維。結(jié)論aFGF復(fù)合膠原蛋白能促進兔ACL重建腱-骨界面的早期直接愈合。

酸性成纖維細胞生長因子;前交叉韌帶重建;腱-骨愈合

關(guān)節(jié)鏡下前交叉韌帶(ACL)重建術(shù)是治療ACL損傷、糾正膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)和延緩膝關(guān)節(jié)退行性變的重要方法。以腘繩肌腱為移植物末端生物學(xué)固定屬于腱-骨愈合,愈合時間長,愈合強度不確定,限制了患者早期的康復(fù)訓(xùn)練,進而影響韌帶重建的最終治療效果,能否解決腱-骨愈合不良問題成為評判ACL重建是否成功的重要指標[1]。近年來應(yīng)用生物生長因子促進骨隧道內(nèi)的腱-骨愈合越來越受到學(xué)者們的重視[2]。研究表明[3],酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)可促進分化中的軟骨細胞發(fā)生遷移和集落形成,促進軟骨細胞的增殖和成熟,可應(yīng)用于ACL重建,促進腱-骨愈合,但由于“滑液灌注效應(yīng)”的影響,腱-骨界面單純應(yīng)用aFGF易流失。膠原蛋白為研究成熟的具有緩釋功能的載體材料,本研究采用aFGF與膠原蛋白復(fù)合體植入重建ACL的兔模型的腱-骨界面,評估其對腱-骨早期愈合的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組健康清潔級新西蘭大白兔30只, 雌雄各15只,月齡為6～8個月,體重2.0～4.0(3.15±0.61)kg,由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院動物實驗中心提供。采用隨機數(shù)字表法將30只兔分為實驗組與對照組,每組15只。

1.2主要材料與儀器熒光顯微鏡(BX43奧林巴斯,日本),生物力學(xué)測試機(3342 INSTRON CORPORATION,單臂式電子拉伸機,美國),aFGF由暨南大學(xué)提供。

1.3實驗方法

1.3.1aFGF/ 膠原蛋白復(fù)合物的制備 ① 膠原蛋白的制備:將新鮮牛跟腱去除脂肪、筋膜后, 清洗干凈, 置-20 ℃ 冰箱冷凍硬化;取出后沿著腱纖維方向切成均勻薄片,取100 g 用去離子水洗凈, 用75%乙醇消毒30 min, 雙蒸水反復(fù)清洗后放入1 L 0.5 mol/L 冰醋酸中, 置4 ℃冰箱 24 h 以上, 間歇攪拌;將膨脹的膠原倒入高速組織搗碎機中搗碎成漿糊樣;放入4 L 0.5 mol/L冰醋酸中, 同時加入1 g 胃蛋白酶, 置4 ℃ 冰箱24 h 以上,充分溶解; 取上清液置預(yù)冷為4 ℃離心機內(nèi), 4 000 r/min 離心30 min;取上清液倒入容量瓶中定容, 加入等量的20% NaCl 溶液進行鹽析48 h 以上;將析出的絮狀沉淀再次溶于2 L 0.5 mol/L冰醋酸中, 用雙層紗布過濾,去除膠原溶液中殘存的少許絮狀物;將所得膠原蛋白溶液灌入透析袋中用雙蒸水透析5 d 以上, 每日換水2 次, 即得到膠原蛋白溶液。② aFGF/膠原蛋白復(fù)合物的制備:在15 ml 膠原蛋白溶液中加入4 μg aFGF, 冷凍干燥后可制成aFGF/膠原蛋白復(fù)合物,aFGF 的濃度為267 μg/L。實驗前所有的測試樣品均用60Co 作滅菌處理。

1.3.2動物模型制備 在兔左后腿內(nèi)側(cè)口取出趾長伸肌腱作為移植物,兩端用縫合線縫合備用。再從右后腿髕骨內(nèi)側(cè)行縱向切口,分別從上下止點處將ACL切除,在脛骨結(jié)節(jié)內(nèi)上方的骨面原ACL止點殘端定位,用1.2 mm鉆頭鉆骨道作為下止點;同法于股骨外髁鉆骨道作為上止點。將預(yù)先縫在移植物兩端的縫合線牽出關(guān)節(jié)腔,繼而牽拉移植物兩端進入骨道內(nèi)。上下止點固定:先用克氏針在脛骨結(jié)節(jié)稍偏下的皮質(zhì)骨上鉆孔,將其中1根縫線穿孔而過,繞回后與下端另1根縫線打結(jié)固定;然后在股骨干部韌帶終點外側(cè)以克氏針從外向內(nèi)斜行鉆2個單皮質(zhì)骨道,外孔間隔0.3 cm,將縫線兩端穿過骨道后屈膝位90°位拉緊韌帶打結(jié)固定。用1號不可吸收線固定。實驗組將aFGF/膠原蛋白復(fù)合物植入到重建的ACL骨隧道內(nèi);對照組單純行ACL重建。

1.3.3生物力學(xué)檢測 于術(shù)后第4、8、12周每組分別取5只兔,經(jīng)空氣栓塞法處死取材。將膝關(guān)節(jié)ACL外周軟組織去除,股骨和脛骨各保留5 cm長,股骨與脛骨端分別固定于生物力學(xué)試驗機上,使拉力經(jīng)過韌帶的軸線。測試前去除脛骨端移植肌腱骨道外的軟組織及縫線結(jié)構(gòu),使脛骨端腱-骨界面成為拉力測試對象。行最大拉脫負荷實驗,測試移植肌腱的腱-骨界面抗拉伸強度,按5 mm/min速度加載負荷,記錄拉脫或斷裂負荷。因各測試對象的移植肌腱長度、骨道直徑和長度接近,各組樣本的最大載荷未用隧道長度來標準化,直接取其絕對值作比較。

1.3.4組織學(xué)觀察 在術(shù)后第4、8、12周每組分別將取得的膝關(guān)節(jié)標本取股骨髁上1 cm部位及脛骨結(jié)節(jié)下方0.5 cm完整切斷。15%戊二醛溶液固定,10% EDTA磷酸緩沖液脫鈣。脫鈣后以蒸餾水沖洗,清除關(guān)節(jié)周圍軟組織,將股骨隧道和脛骨隧道縱向剖開,取下標本并修整成1 cm×0.5 cm×0.5 cm大小。依次梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,切成5μm厚的薄片,常規(guī)HE染色,觀察骨隧道內(nèi)移植物界面愈合情況。

2 結(jié)果

2.1生物力學(xué)檢測見表1。兩組術(shù)后第4、8、12周的抗拉力強度比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

2.2組織學(xué)觀察術(shù)后第4周,實驗組腱-骨界面膠原纖維排列緊密、有序,新生骨細胞較多且比較成熟;對照組腱-骨界面組織疏松、無序,成骨不明顯;

表1 兩組腱-骨界面術(shù)后不同時間點抗拉力強度比較

兩組均未見Sharpey纖維；見圖1A、B、C。術(shù)后第8周,實驗組可見排列密集的垂直腱-骨界面的Sharpey樣纖維,纖維及新生骨長入肌腱;對照組偶見Sharpey樣纖維,新生骨細胞趨向肌腱生長,腱-骨結(jié)合疏松;見圖1D、E、F。術(shù)后第12周,實驗組腱-骨界面幾乎全部由新生骨填充,新生纖維軟骨、鈣化軟骨及骨細胞成熟,Sharpey樣纖維較術(shù)后第8周時減少,形成“潮線”樣結(jié)構(gòu);對照組腱-骨界面逐漸成熟,形成少量的纖維軟骨,但是纖維軟骨分化較差,腱-骨過渡組織狹窄,無“潮線”結(jié)構(gòu);見圖1G、H、I。

3 討論

我國每年有60萬～70萬例行ACL重建手術(shù)的患者,但術(shù)后有2.1%～11%的患者出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)的松弛而接受二次手術(shù)治療[4]；美國每年有10萬～15萬例需接受ACL重建手術(shù)以恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)和功能[5],但術(shù)后仍有0.7%～10%的患者因關(guān)節(jié)不穩(wěn)接受二次手術(shù)[6]。腱-骨愈合的好壞直接影響ACL重建的效果。研究表明[7-8]腱-骨愈合分為間接愈合和直接愈合,間接愈合的特征為一些穿插性的膠原纖維連接肌腱移植物和骨隧道,這種纖維的走向通常與骨隧道軸向垂直,稱為Sharpey樣纖維;直接愈合特征是通過纖維軟骨移行帶連接移植物和骨隧道,類似于正常的纖維軟骨連接,且形成嗜堿性染色的“潮線”結(jié)構(gòu),見于正常ACL的腱-骨止點或腱-骨愈合晚期的骨隧道出口處[9]。大多數(shù)學(xué)者認為間接愈合在力學(xué)上不如直接愈合,只有移植肌腱與骨隧道壁形成牢固的愈合才能達到有效的力學(xué)強度[10]。因此促進ACL重建后腱-骨早期、可靠的愈合成為研究熱點。王永健 等[11]用自體腘繩肌腱重建兔ACL,6個月觀察到直接止點的4層結(jié)構(gòu),12個月與正常ACL的止點相似;有研究表明[12]腱-骨界面形成正常止點需要24周以上。aFGF對中胚層來源的細胞包括成骨細胞、成軟骨細胞有明顯的促有絲分裂作用, 并且能刺激新生毛細血管的形成[13],但是它對于腱-骨愈合的影響未見相關(guān)報道。膠原蛋白具有低抗原性, 良好的生物相容性和生物可降解性,膠原蛋白在細胞的增生分化與運動、血液凝固、傷口愈合中起重要作用,膠原作為生物材料可用于創(chuàng)傷敷料、止血材料、手術(shù)縫線、藥物緩釋載體等[14-16]。本研究將膠原作為載體能使aFGF在腱-骨界面持續(xù)發(fā)揮作用。

圖1兩組術(shù)后腱-骨界面的愈合情況A.術(shù)后4周，實驗組見膠原纖維排列緊密,HE×100;B.術(shù)后4周，實驗組見膠原纖維排列有序,HE×400;C.術(shù)后4周，對照組見膠原纖維排列疏松,HE×100;D.術(shù)后8周，實驗組見Sharpey纖維致密,HE×100;E.術(shù)后8周，實驗組見Sharpey纖維排列、其間可見軟骨細胞,HE×400;F.術(shù)后8周，對照組見Sharpey纖維疏松,HE×100;G.術(shù)后12周，實驗組見直接止點,HE×100;H.術(shù)后12周，實驗組見新生纖維軟骨、鈣化纖維軟骨及骨組織成熟,HE×400;I.術(shù)后12周，對照組見少量新生骨細胞,腱骨界面疏松,HE×100

ACL重建術(shù)后早期功能鍛煉時移植肌腱所承受的應(yīng)力負荷與腱-骨間接愈合有關(guān)[17],所以Sharpey纖維數(shù)量決定了移植肌腱的抗拉程度。本實驗結(jié)果顯示,術(shù)后4周兩組未見Sharpey纖維,實驗組的膠原纖維比對照組致密、有序;術(shù)后8周兩組可見數(shù)量不等的Sharpey纖維,但實驗組明顯多于對照組;術(shù)后12周時,實驗組Sharpey樣纖維明顯減少,被連續(xù)性的纖維軟骨、鈣化纖維軟骨連接取代,近似于直接止點結(jié)構(gòu),對照組Sharpey樣纖維多,形成少量的纖維軟骨;生物力學(xué)檢測兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,表明aFGF復(fù)合膠原蛋白可明顯提高ACL重建術(shù)后早期的移植肌腱的生物力學(xué)性能。

有研究認為[18],移植肌腱直徑小于隧道直徑,彼此間在關(guān)節(jié)的每次運動時,會產(chǎn)生腱-骨間的微小移動和關(guān)節(jié)滑液的隧道沖刷。aFGF為可溶性蛋白,由于“滑液灌注效應(yīng)”的影響,在骨道內(nèi)單純應(yīng)用容易流失,膠原蛋白有骨傳導(dǎo)活性,二者結(jié)合在一起能使腱-骨之間形成嚴密的栓塞,關(guān)閉關(guān)節(jié)腔和隧道的孔隙交通,能減少“滑液灌注效應(yīng)”,并能減少移植肌腱在骨道內(nèi)橫向及縱向活動所形成的“雨刷效應(yīng)”和“蹦極效應(yīng)”[19],緩慢釋放的aFGF有利于長效誘導(dǎo)腱-骨界面的直接愈合。Gulotta et al[20]將黏合劑填入腱-骨界面內(nèi)顯示腱-骨愈合更牢固,說明減少“滑液灌注效應(yīng)”可有效促進腱-骨愈合。本實驗發(fā)現(xiàn),術(shù)后各時間段aFGF復(fù)合膠原蛋白組移植肌腱的抗拉力、腱-骨界面的成熟度、Sharpey纖維數(shù)量均好于對照組,并且實驗組在術(shù)后12周形成了纖維軟骨移行帶,類似于正常的纖維軟骨連接,說明aFGF復(fù)合膠原蛋白能促進ACL重建腱-骨界面的早期直接愈合。

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Effectofacidicfibroblastgrowthfactorcomplexcollagenontendon-bonehealingafterACLreconstructionofrabbits

LUDai-feng,YANGChuan-dong,DONGFeng,ZHOUYong,YANShi

(DeptofOrthopaedics,theFourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin,Heilongjiang150001,China)

ObjectiveTo observe the effects of acidic fibroblast growth factor(aFGF) complex collagen on tendon-bone interface healing in anterior cruciate ligament(ACL) reconstruction of rabbits.MethodsThe 30 New Zealand white rabbits were randomly divided into experimental group and control group,each 15 only,all were taken toe long extensor tendon as graft. Experimental group aFGF/collagen composite were implanted to the reconsruction of the ACL tendon-bone interface,control group underwent pure ACL reconstruction.In 4,8,12 weeks after surgery，animals were put to death,femur and tibia end were respectively fixed on the biomechanical test machine,tested hamstring tendon transplantation-bone interface tensile strength,took the absolute value comparison;At the same time,the femoral and tibial tunnel were opened longitudinally tunnel, removed the specimen histological observation graft interface healing.ResultsAt 4,8,12 weeks postoperation, pushing of the experimental group was stronger than the control group, the difference was statistically significant(P<0.001).At 4 weeks posoperation, two groups animals had formed fibrous connective tissue between implant and bone tunnel. At 12 weeks postoperation, the experimental group tendon grafts had formed fibrocartilage transitinonal zone in bone tunnel, which was similar to normal fibrocartilage connection, while control group had formed a trend and bone tunnel axis vertical Sharpey sample fibers.ConclusionsThe aFGF-collagen is beneficial to the early direct healing of tendon-bone interface after anterior cruciate ligament reconstruction.

acidic fibroblast growth factor;anterior cruciate ligament reconstruction;tendon-bone healing

10.3969/j.issn.1008-0287.2017.06.041

黑龍江省衛(wèi)生計生委科研課題(編號:2014-375)

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院骨科,黑龍江 哈爾濱 150001

逯代鋒,男,副主任醫(yī)師,主要從事運動醫(yī)學(xué)研究,E-mail:ludaifengletter@163.com

R 686.5;R 687.2

A

1008-0287(2017)06-0752-05

(接收日期:2017-09-20)