楊宏達(dá) 劉志

TLR9-mRNA的表達(dá)與急性胰腺炎病人炎性因子變化的相關(guān)性研究

楊宏達(dá) 劉志

目的探討單核巨噬細(xì)胞TLR9-mTLR9-mRNA的表達(dá)與急性胰腺炎(AP)病人炎性因子變化的相關(guān)性。方法24小時(shí)內(nèi)被診斷為AP的病人40例，分別于第1，3，5天采集病人的EDTAK2抗凝靜脈血，并檢測(cè)胰彈性蛋白酶、促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子。分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)TLR9-mRNA進(jìn)行檢測(cè)，分析其5天內(nèi)表達(dá)變化規(guī)律。結(jié)果所有AP病人在第 1天、第3天、5天時(shí)單核巨噬細(xì)胞 TLR9-mRNA對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AP病人外周血單核巨噬細(xì)胞TLR9-mRNA的改變與胰彈性蛋白酶、促炎細(xì)胞因子呈明顯正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論外周血單核巨噬細(xì)胞TLR9-mRNA的表達(dá)改變與AP病人炎性因子(胰彈性蛋白酶、促炎細(xì)胞因子)表達(dá)上調(diào)有相關(guān)性，TLR9可能介導(dǎo)AP的發(fā)生與發(fā)展。

急性胰腺炎； 胰彈性蛋白酶； 促炎細(xì)胞因子； 抗炎細(xì)胞因子； 單核巨噬細(xì)胞TLR9-mRNA

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是由于多種原因?qū)е乱让副患せ?，而引起胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的炎癥反應(yīng)，以血、尿淀粉酶增高為主要表現(xiàn)[1]。臨床上常表現(xiàn)為腹痛、嘔吐、發(fā)熱等癥狀[2]。臨床上根據(jù)預(yù)后分型，預(yù)后良好者為輕型急性胰腺炎；預(yù)后不良、發(fā)生胰腺出血壞死，并繼發(fā)感染、腹膜炎，甚至休克者為重型急性胰腺炎。統(tǒng)計(jì)顯示，AP發(fā)病率不斷上升，治療效果不理想，主要是因?yàn)槟壳把芯可形疵鞔_AP的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，以及未能認(rèn)識(shí)疾病發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)以及分子生物學(xué)基礎(chǔ)[3]。在AP分子生物學(xué)機(jī)制的研究中，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)已成為備受關(guān)注的一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面信號(hào)傳導(dǎo)跨膜蛋白，它在炎性反應(yīng)的發(fā)生過(guò)程中起著重要的介導(dǎo)作用[4]，其中，TLR9是TLRs中的一種重要受體，它主要通過(guò)識(shí)別外源性的非甲基化CpG基序來(lái)啟動(dòng)炎癥的鏈性反應(yīng)[5]。我們對(duì)單核巨噬細(xì)胞TLR9-mRNA的表達(dá)與急性胰腺炎病人炎性因子變化的相關(guān)性進(jìn)行探討。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2016年2月～2016年9月本院急診科于24小時(shí)內(nèi)診斷為AP的病人40例，男性23例，女性17例，平均年齡(52.32±3.21)歲。入院時(shí)的40例病人為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組按時(shí)間分組，分為第1天組、第3天組和第5天組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≤60歲；臨床確診為AP；無(wú)其它嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床未診斷為AP；伴有其它系統(tǒng)嚴(yán)重性疾?。徊辉竻⒓颖敬窝芯空?。所有AP病人年齡、性別和病情等基本資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、方法

分別采用人淋巴細(xì)胞分離液、Ficoll Taq DNA聚合酶、Trizol試劑和Rever Tra Ace逆轉(zhuǎn)錄酶。所有AP病人分別于第1、3、5天采集靜脈血，EDTAK2抗凝，并檢測(cè)其胰彈性蛋白酶、促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子。分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)TLR9-mRNA進(jìn)行檢測(cè)，分析其表達(dá)規(guī)律。

以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照半定量，各樣本表達(dá)強(qiáng)度由各樣本灰度值/GAPDH灰度值計(jì)算所得。利用自動(dòng)生化儀測(cè)定淀粉酶和脂肪酶含量，利用全自動(dòng)定量繪圖標(biāo)儀測(cè)量細(xì)胞因子含量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1.對(duì)照組與第1、3、5天時(shí)的單核巨噬細(xì)胞TLR9mRNA表達(dá)含量比較：所有AP病人在第1天、第3天、5天時(shí)單核巨噬細(xì)胞TLR9mRNA與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明單核巨噬細(xì)胞TLR9在AP炎癥反應(yīng)過(guò)程中起著重要的作用，也就能間接推測(cè)AP能誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞TLR9的強(qiáng)烈表達(dá)。

2.對(duì)照組與第1、3、5天時(shí)的淀粉酶與脂肪酶含量比較：在第1天、第3天時(shí)的淀粉酶、脂肪酶含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第5天時(shí)的淀粉酶、脂肪酶含量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AP病人的淀粉酶、脂肪酶與胰腺的自身免疫反應(yīng)有關(guān)，單核巨噬細(xì)胞TLR9的高表達(dá)可能介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組在入院時(shí)與第1、3、5天時(shí)的淀粉酶、脂肪酶含量比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05

3.比較對(duì)照組與第1、3、5天時(shí)的細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果：第3天和第5天時(shí)，細(xì)胞因子TNF-α、IL-1含量與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第1 天時(shí)IL-4含量與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這說(shuō)明在AP病人前一周內(nèi)單核巨噬細(xì)胞TLR9mRNA的表達(dá)變化與炎性因子有一定相關(guān)性，單核巨噬細(xì)胞TLR9mRNA是AP炎癥反應(yīng)中的介導(dǎo)因子。見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照組在入院時(shí)與第1、3、5天時(shí)的細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果關(guān)系比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05

討 論

AP在我國(guó)該病發(fā)病率不斷上升，病死率高，目前尚未明確該疾病發(fā)生和發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制[6-7]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，TLR9的高水平表達(dá)在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，它可能通過(guò)識(shí)別外源性的非甲基化CpG基序來(lái)啟動(dòng)炎癥的鏈性反應(yīng)[8-9]。TLR9作為一類(lèi)新的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面信號(hào)傳導(dǎo)跨膜蛋白，主要表達(dá)于B細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞等免疫細(xì)胞，甚至在非免疫細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞上也有高水平表達(dá)[10]。

有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠的胰腺組織中，采用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)TLR9主要表達(dá)在胰管上皮細(xì)胞[11]。一種被廣泛認(rèn)可的觀點(diǎn)是胰管黏膜屏障是胰腺自我保護(hù)機(jī)制，是一種物理性的機(jī)械隔離機(jī)制，也是一種化學(xué)性保護(hù)機(jī)制[12]。單核巨噬細(xì)胞TLR9作為先天性免疫系統(tǒng)的重要一員，它可能在參與到胰管黏膜屏障的抗炎調(diào)節(jié)中，并與釋放的其它細(xì)胞因子、促炎性因子等起調(diào)節(jié)作用，單核巨噬細(xì)胞TLR9也可能是免疫反應(yīng)中一個(gè)潛在的調(diào)節(jié)點(diǎn)[13]。另有研究表明，單核巨噬細(xì)胞TLR9參與了AP病人早期炎癥反應(yīng)的血管微循環(huán)損害，同時(shí)發(fā)現(xiàn)人類(lèi)AP能夠誘導(dǎo)TRL9mRNA快速而強(qiáng)烈地表達(dá)[14]。

有研究發(fā)現(xiàn)，在人外周血單核細(xì)胞中，TLR9-mRNA呈現(xiàn)低水平的表達(dá)，但其在早期AP時(shí)的水平顯著升高。所有AP病人的單核巨噬細(xì)胞TLR9在第1天時(shí)相對(duì)于對(duì)照組上調(diào)8.12倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在第3、5天時(shí)相對(duì)于對(duì)照組緩慢上調(diào)，其中，在第5天時(shí)上調(diào)至峰值，分別相對(duì)于對(duì)照組上調(diào)9.01倍和9.52倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[14]。上述研究表明，TLR9對(duì)AP反應(yīng)敏感，可短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)快速升高的趨勢(shì)，可進(jìn)一步推斷其在AP疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起到顯著的作用。有研究表明，CpG并不能夠誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞TLR9表達(dá)上調(diào)，但AP病人的炎癥反應(yīng)可以促使單核巨噬細(xì)胞TLR9表達(dá)上調(diào)[14]。說(shuō)明單核巨噬細(xì)胞TLR9在AP炎癥反應(yīng)過(guò)程中起著重要作用，也就能間接推測(cè)AP能誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞TLR9的表達(dá)。本研究通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)TLR9-mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第1天時(shí)、第3天時(shí)淀粉酶、脂肪酶含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第5天時(shí)，淀粉酶、脂肪酶含量接近于基準(zhǔn)水平值，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果表明，AP病人的淀粉酶與脂肪酶與胰腺的自身免疫反應(yīng)有關(guān)，單核巨噬細(xì)胞TLR9的高表達(dá)可能介導(dǎo)本次炎癥反應(yīng)。單核巨噬細(xì)胞TLR9表達(dá)水平的升高與血清中的部分細(xì)胞因子增加存在顯著關(guān)系。此外，既往研究指出，TLR9好激活能夠大量釋放IL-6、IL-10、IL-1、IL-12及TNF-α等促炎癥細(xì)胞因子[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，第3天和第5天時(shí)，細(xì)胞因子TNF-α與IL-1含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第1天時(shí)IL-4含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)，在AP病人前5天內(nèi)的細(xì)胞因子檢測(cè)中，雖然細(xì)胞因子TNF-α與IL-1在炎癥過(guò)程中，隨著時(shí)間不斷上調(diào)，單核巨噬細(xì)胞TLR9mRNA的表達(dá)水平也不斷升高，但I(xiàn)L-4沒(méi)有隨著單核巨噬細(xì)胞TLR9mRNA的表達(dá)水平的升高而持續(xù)上調(diào)。結(jié)果說(shuō)明，單核巨噬細(xì)胞TLR9mRNA在AP病人炎癥反應(yīng)過(guò)程中起主要介導(dǎo)作用，淀粉酶與脂肪酶在逐漸降低的時(shí)候，單核巨噬細(xì)胞TLR9mRNA表達(dá)水平仍在升高，細(xì)胞因子IL-4逐漸降低時(shí)，單核巨噬細(xì)胞TLR9mRNA表達(dá)水平仍在升高。這說(shuō)明在AP病人前一周內(nèi)單核巨噬細(xì)胞TLR9mRNA的表達(dá)變化與炎性因子有一定相關(guān)性，單核巨噬細(xì)胞TLR9mRNA是AP炎癥反應(yīng)中的介導(dǎo)因子，或者只是AP發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的一種單純的促炎性因子介質(zhì)，可能與疾病的預(yù)后和病情嚴(yán)重程度有一定關(guān)系。

在AP病人前一周內(nèi)單核巨噬細(xì)胞TLR9mRNA的表達(dá)變化與炎性因子有一定相關(guān)性，單核巨噬細(xì)胞TLR9mRNA在AP病人炎癥反應(yīng)過(guò)程中起重要的介導(dǎo)因子作用。

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Studyontherelationshipbetweentheexpressionoftoll-likereceptor9-mRNAandinflammatoryfactorsinpatientswithacutepancreatitis

YANGHongda，LIUZhi.

(DepartmentofEmergency，theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China)

ObjectiveTo investigate the correlation between the expression of Toll-like receptor 9(TLR9)-mRNA and inflammatory factors in patients with acute pancreatitis(AP).MethodsA total of 40 patients with AP diagnosed in our hospital from February 2016 to September 2016 in 24 h were enrolled.EDTAK2 anticoagulant venous blood was collected on day 1，3，5.And pancreatic elastase，proinflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines were detected.Peripheral blood monouclear cells were isolated and the mRNA expression of TLR9 was tested by polymerase chain reaction.The change of TLR9-mRNA in 5 days was analyzed.ResultsThe level of TLR9-mRNA in peripheral blood mononuclear cells of patients with AP at 1，3，5 days were significantly higher than that in the control group，and the difference was statistically significant(P<0.05).Changes of the TLR9-mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells in patients with AP was positively correlated with the levels of pancreatic elastase and proinflammatory cytokines，and the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe expression of TLR9-mRNA in peripheral blood mononuclear macrophages was closely related to the up-regulation of inflammatory cytokines in AP patients，suggesting that TLR9 may mediate the occurrence and development of AP.To investigate the correlation between the expression of TLR9-mTLR9-mRNA and inflammatory factors in patients with AP.MethodsA total of 40 patients with AP diagnosed in our hospital from February 2016 to September 2016 in 24h were selected.EDTAK2 anticoagulant venous blood was collected on day 1，3，5.And Pancreatic elastase，proinflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines were also detected.EDTAK2 anticoagulant venous blood was collected，tested the above indicators and used them as the benchmark level of the corresponding indicators.ResultsThe levels of TLR9-mRNA in peripheral blood mononuclear cells of patients with AP at 1，3，5 days were significantly higher than in the control group，and the difference was statistically significant(P<0.05).Changes of TLR9-mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells in patients with AP was positively correlated with pancreatic elastase and proinflammatory cytokine，and the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe expression of TLR9-mRNA in peripheral blood mononuclear macrophages was closely related to the up regulation of inflammatory cytokines in AP patients，suggesting that TLR9 may mediate the occurrence and development of AP.

acute pancreatitis； pancreatic elastase； proinflammatory cytokines； inflammatory cytokine； macrophage TLR9-mRNA

10.3969/j.issn.1005-6483.2017.12.013

110001 沈陽(yáng)，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科

劉志，Email：39050206@qq.com

2017-04-01)

楊澤平)