徐夢珂 李 丹 孟來生* 蔣繼宏

(1.江蘇省藥食植物生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)，徐州 221116； 2.江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，徐州 221116)

擬南芥轉(zhuǎn)錄因子Ethylene-insensitive3(EIN3)抑制花青素的合成

徐夢珂1,2李 丹1,2孟來生1,2*蔣繼宏1,2

(1.江蘇省藥食植物生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)，徐州 221116；2.江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，徐州 221116)

Ethylene-insensitive3(EIN3)和 EIN3-like1(EIL1)蛋白是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子?；ㄇ嗨厥侵参矬w中的一類水溶性天然色素，在植物的許多生理過程中起重要作用。本研究以擬南芥雙突變體ein3-1eil1-3為研究材料，通過RT-PCR技術(shù)確定了擬南芥雙突變體ein3-1eil1-3中EIN3和EIL1基因均已被敲除，單突變體ein3-1中的EIN3基因被敲除。通過肉眼定性觀察發(fā)現(xiàn)突變體ein3-1eil1-3的種子和葉片內(nèi)均呈紫色。通過紫外分光光度計(jì)定量分析發(fā)現(xiàn)，花青素積累量也明顯比突變體ein3-1和野生型多。通過GUS染色發(fā)現(xiàn)EIN3啟動(dòng)子主要在花、柱頭、成熟花粉、種子胚和果莢等組織中有較強(qiáng)的表達(dá)。這與突變體ein3-1eil1-3的種子和葉片內(nèi)均呈紫色并花青素含量增高一致。因此，擬南芥轉(zhuǎn)錄因子EIN3可能與EIL1共同參與抑制花青素的合成。

Ethylene-insensitive3(EIN3)；Ethylene-insensitive3-like 1(EIL1)；花青素；擬南芥

花青素屬于黃酮類化合物，是植物體中的一類水溶性天然色素?；ㄇ嗨卦谥参锏脑S多生理過程中起重要作用，例如可以在植物的營養(yǎng)組織中產(chǎn)生光保護(hù)屏障，是授粉和種子傳播中的視覺吸引子，并且可以作為防御反應(yīng)中的抗菌劑和拒食劑[1]。植物表皮細(xì)胞的液泡中可以大量儲(chǔ)存花青素，有利于降低植物細(xì)胞的冰點(diǎn)，防止植物體受低溫脅迫[2～3]。因此，對花青素的研究具有重要意義。

目前，植物中的花青素生物合成途徑已得到深入研究。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)和其他一些非模式植物例如金魚草(AntirrhinummajusL.)和矮牽牛(Petuniahybrida)等中，如查耳酮合酶，查耳酮異構(gòu)酶(CHI)，黃烷酮3-羥化酶和類黃酮3′-羥化酶(F3′H)[4]等在不同的類黃酮素子通路中十分常見的早期生物合成基因(EBGs)會(huì)被二氫黃酮醇4-還原酶，無花色素加成酶，花青素還原酶[5]和UDP葡萄糖，類黃酮3-O葡糖基轉(zhuǎn)移酶等后期生物合成基因(LBGs)誘導(dǎo)[6～7]。在擬南芥[8]中發(fā)現(xiàn)，形成亞微管的細(xì)胞隔室可以積聚大量的花青素[9]。發(fā)現(xiàn)擬南芥TT19可作為載體將花青素從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到葉綠體中。最近孟[10～11]等發(fā)現(xiàn)擬南芥轉(zhuǎn)錄共激活子AN3(ANGUSTIFOLIA3)是花青素生物合成的正向調(diào)控因子，an3敲除突變體種子葉片等器官上花青素含量明顯減少。AN3的下游靶標(biāo)基因是YODA,它編碼MAPKKK激酶，YODA也是新發(fā)現(xiàn)的花青素生物合成的負(fù)向調(diào)控因子[11]。AN3和YODA構(gòu)成糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控花青素的生物合成[11]。此外，AN3與COP1(Constitutive Photomorphogenic1)，編碼一個(gè)泛素化酶，構(gòu)成光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控花青素的生物合成[10]。

Ethylene-insensitive3(EIN3)和EIN3-like(EIL)蛋白是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子。乙烯是一種經(jīng)典的植物激素，影響著植物生長發(fā)育的許多進(jìn)程。目前已經(jīng)從多種高等植物中分離得到EIN3基因，包括水稻、擬南芥和煙草等。EIN3是植物特異性核轉(zhuǎn)錄因子，可以啟動(dòng)乙烯應(yīng)答的下游轉(zhuǎn)錄級聯(lián)反應(yīng)[12]。葡萄糖通過植物葡萄糖傳感器己糖激酶(HXK1)增強(qiáng)其降解，并且乙烯可以增強(qiáng)其穩(wěn)定性[12]。擬南芥基因組中有5個(gè)EIN3同源物(EIL1至EIL5)，其中EIN3和EIL1是最密切相關(guān)的。EIL1的過表達(dá)補(bǔ)充了ein3突變體，并導(dǎo)致乙烯反應(yīng)途徑的組成型激活[13]。而ein3eil1雙突變體表現(xiàn)對乙烯不敏感[14]，說明二者在乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮了重要作用。據(jù)報(bào)道，EIN3/EILs轉(zhuǎn)錄因子可以影響乙烯誘導(dǎo)的葉片和根系等的生長進(jìn)程：擬南芥ein3突變體的蓮座葉生長受阻和葉片衰老表型在外源乙烯的作用下均得到一定程度的緩解[13]，而ein3eil1雙突變體的子葉的綠化率則明顯減弱[15]；EIN3/EILs轉(zhuǎn)錄因子還影響花的形態(tài)發(fā)育，[15]研究發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)EIN3、EIL1的擬南芥植株會(huì)有雌蕊突出的表型[16]，Yin X R[17]、Hiraga S[18]等也發(fā)現(xiàn)EIN3參與抗鹽，抗凍，抗機(jī)械傷脅迫等的功能。EIN3也參與調(diào)控葉片衰老和抗凍等[19～20]。而目前關(guān)于EIN3是否參與調(diào)控花青素合成的研究較少。

在本研究中，我們以擬南芥雙突變體ein3-1eil1-3為研究材料，定性和定量分析顯示，與野生型和ein3-1單突變體相比，這個(gè)雙突變體花青素積累量明顯增加。進(jìn)一步，利用GUS染色發(fā)現(xiàn)EIN3啟動(dòng)子(EIN3pro-GUS)主要在花、柱頭、成熟花粉、種子胚和果莢等組織中有較強(qiáng)的表達(dá)。EIN3在這些器官中表達(dá)支持了花青素在ein3-1eil1-3的幾種器官中積累。該研究結(jié)果初步說明擬南芥轉(zhuǎn)錄因子EIN3可能與EIL1共同參與負(fù)調(diào)控花青素的合成，為完善花青素合成的分子調(diào)控機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 植物材料

本研究所用到的擬南芥材料均為哥倫比亞(Columbia)生態(tài)型背景，有擬南芥野生型Col-0；突變體ein3-1eil1-3由南方科技大學(xué)郭紅衛(wèi)教授提供；突變體ein3-1由擬南芥生物研究中心(ABRC)(俄亥俄州立大學(xué)，俄亥俄州哥倫布市)提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒；AMV第一鏈cDNA合成試劑盒；PCR(Taq)擴(kuò)增試劑盒。以上試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 植物生長條件

將種子在4℃下放置3天，然后播種到固體Murashige和Skoog(MS)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基含有0.8%瓊脂和1%蔗糖，pH5.8。將播撒種子的培養(yǎng)基放置在21±2℃，16 h/8 h的光/黑暗循環(huán)的培養(yǎng)室中。兩周后將培養(yǎng)基中的幼苗移栽于土盆中，置于上述同等條件的培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

TUB4：F：5′-GACGCTTCATCTCGTCC-3′；R：5′-GTAAACGTAGGTGAGTCCA-3′，基因登陸號(hào)為：AT5G44340。

EIN3：F：5′-ATGTTTAATGAGATGGGAAT-3′；R：5′-CTGCTTCTGCTGCATTCCATC-3′。

EIL1：F：5′-TTCCTCCACATCTCTCGATGT-3′；R：5′-CCTTCTCGGAATAATACCATAA-3′)。

1.3.2 RT-PCR

通過Trizol試劑從擬南芥葉片組織中提取總RNA。使用AMV第一鏈cDNA合成試劑盒對總RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA樣品，并將其用作基于RT-PCR的基因表達(dá)分析的模板。

1.3.3 花青素含量的測定

將相對樣品放置于500 mL的1% HCl的甲醇溶液(v/v)中，然后在4℃，黑暗，溫和震蕩的條件下過夜培養(yǎng)獲得花青素提取物。在該過程之后，加入300 mL水和300 mL氯仿并混合到提取物中，12 000 r·min-1離心2 min，2900×g離心2 min。在530和657 nm下測量上清液的吸光度，通過A530-0.25A657公式測定花青素濃度[21～22]。

1.3.4 載體構(gòu)建

通過啟動(dòng)子分析，插入0.5 kB的啟動(dòng)子片段構(gòu)建EIN3(At3G20770)啟動(dòng)子-GUS載體，擴(kuò)增引物為(P1-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct AACAAATGTGTC GAAGAACGTG，P2-ggggaccactttgtacaagaaagctgggt AGATCAGGAAGATAGATCATAG)。這些片段被擴(kuò)構(gòu)建到pCB308R質(zhì)粒上[23]，載體如圖1所示。之后通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，轉(zhuǎn)基因植物通過抗生素卡那篩選，從而獲得含有EIN3pro-GUS的轉(zhuǎn)基因植株，并通過多代篩選獲得含有EIN3pro-GUS的純合體種子，供GUS測試用。

圖1 pCB308R質(zhì)粒載體示意圖Fig.1 Vector diagram of plasmid pCB308R

1.3.5 GUS測定

樣品(攜帶并表達(dá)EIN3pro-GUS的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的花，胚胎等)在1 mmol·L-1X-gluc，60 mmol·L-1NaPO4緩沖液，0.4 mmol·L-1K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.1%(v)Triton X-100的溶液中染色，接著37℃培養(yǎng)6～8 h。然后在30%,50%,70%,90%和100%梯度濃度的乙醇中浸泡約10 min去除葉綠素。最后，使用HIROX三維視頻顯微鏡在相關(guān)放大倍數(shù)下拍攝材料。

1.3.6 觀察種子和葉片

使用HIROX三維視頻顯微鏡拍攝成熟的干種子和新鮮葉片的葉背部分。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果分析

根據(jù)方法1.3.1使用持家基因TUB4引物和被測試基因EIN3，EIL1的引物對突變體ein3-1eil1-3，ein3-1和野生型(Col-0)進(jìn)行RT-PCR分析驗(yàn)證。由圖1可知通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了擬南芥雙突變體ein3-1eil1-3中EIN3和EIL1基因均已被敲除，突變體ein3-1中的EIN3基因已被敲除。

圖2 RT-PCR檢測EIN3和EIL1基因的缺失 M. Marker；1.野生型；2.突變體ein3-1；3.突變體ein3-1eil1-3Fig.2 Detection of EIN3 and EIL1 gene deletion by RT-PCR M. Marker; 1.Col-0; 2.Mutant ein3-1; 3.Mutant ein3-1eil1-3

2.2 突變體ein3-1eil1-3的種子和幼苗葉片中花青素積累量增加

通過在HIROX三維視頻顯微鏡下，觀察突變體ein3-1eil1-3，ein3-1和野生型(Col-0)擬南芥成熟的干種子，發(fā)現(xiàn)在突變體ein3-1eil1-3中有部分種子顏色較深，但并沒有在突變體ein3-1和野生型中發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象(圖3:A～C)。同時(shí)又觀察了15天齡的擬南芥幼苗的葉片，發(fā)現(xiàn)也只有突變體ein3-1eil1-3的葉片呈紫色(圖3:D～F)。定性觀察顯示，ein3-1eil1-3很可能積累了大量花青素。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)結(jié)論是否正確，我們用紫外分光光度計(jì)對雙突變體的葉片進(jìn)行定量測定，發(fā)現(xiàn)突變體ein3-1eil1-3比突變體ein3-1和野生型幼苗的花青素積累量顯著增高(圖4)。這些數(shù)據(jù)表明EIN3和EIL1可能共同參與反向調(diào)節(jié)花青素的生物合成。

圖3 突變體ein3-1eil1-3的種子和幼苗葉片在白光(16 h光/8 h黑暗)下生長時(shí)，花青素積累量增加 A～C.突變體ein3-1eil1-3，ein3-1和野生型(Col-0)擬南芥成熟的干種子；D～F. 15 d齡的突變體ein3-1eil1-3，ein3-1，野生型(Col-0)擬南芥幼苗葉片的葉背部分 材料來自至少5個(gè)以上獨(dú)立傳播的植株，放大倍率相同。Fig.3 ein3-1eil1-3 seeds and seedlings leaves had increase anthocyanin accumulation when grown under white light(16 h of light/8 h of darkness) A-C. Representative mature dry seeds ein3-1eil1-3,ein3-1,wild-type(Col-0); D-F. Representative seedlings leaves ein3-1eil1-3,ein3-1,wild-type(Col-0) Materials were from at least five independently propagated lines,magnifications are the same.

圖4 柱狀圖顯示了15天齡的突變體ein3-1eil1-3，ein3-1，野生型(Col-0)擬南芥幼苗之間的花青素積累量的差異 材料來自至少五個(gè)以上獨(dú)立傳播的植株，野生型花青素含量指定為1.0(n>10;*為P<0.05)。Fig.4 Bar graph exhibiting the difference in the anthocyanin accumulation between the 15-day-old ein3-1eil1-3,ein3-1,wild-type(Col-0) And wild-type is set as 1.0;Error bars represent SD(n>10);Heteroscedastic t-test analysis showed significant differences(*is P<0.05).

2.3 EIN3的表達(dá)分析

既然花青素能夠在雙突變體ein3-1eil1-3種子上和葉片上積累，那么，EIN3是否在這些組織中表達(dá)。以大約0.5 kB的EIN3啟動(dòng)子和GUS報(bào)告基因融合(EIN3pro-GUS)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因擬南芥作為材料進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，檢測EIN3啟動(dòng)子的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EIN3啟動(dòng)子主要在花、柱頭、成熟花粉、種子胚和果莢等生殖器官組織中有較強(qiáng)的表達(dá)(圖5)，這個(gè)結(jié)論證明了我們以上的推測。

3 討論

Rabino I[21]發(fā)現(xiàn)一些環(huán)境因子如光照、溫度，和Shan X[24]發(fā)現(xiàn)的茉莉酸甲酯以及Deikman J[25]發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞分裂素均可以通過調(diào)控花青素合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平變化，以此改變擬南芥植物細(xì)胞中花青素含量的累積。近幾年來，人們發(fā)現(xiàn)了植物體內(nèi)一些轉(zhuǎn)錄因子也可以調(diào)控花青素的生物合成，并且這種調(diào)控作用是多種因子共同作用的結(jié)果。Ramsay N A[26]研究表明，調(diào)控花青素生物合成途徑的轉(zhuǎn)錄因子主要包括3個(gè)基因家族,即MYB、bHLH和WD40家族。大部分的轉(zhuǎn)錄因子是通過轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控來發(fā)揮功能。在擬南芥中，Borevitz J O等[27]研究發(fā)現(xiàn)與花色相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子PAP1和PAP2，是一大類正調(diào)控因子。而目前只在擬南芥中發(fā)現(xiàn)ICX1是CHS表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子[28]，AtMYB4是R2R3-MYB的轉(zhuǎn)錄抑制因子[29]，MYB的負(fù)調(diào)控因子MYBL2、MYB4[30]以及Pauwels L等[31]在2011年發(fā)現(xiàn)的JAZ(Jasmonate-ZIM Domain)蛋白可以作用于MBW三聚體復(fù)合物，從而抑制花青素合成。植物激素茉莉酸啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄因子MYC2與EIN3相互作用，減弱EIN3的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制乙烯增強(qiáng)的頂端鉤曲率[32～33]。在矮牽牛中也發(fā)現(xiàn)，R3-MYB蛋白PhMYBx屬于花青素合成的負(fù)調(diào)控因子[34]。

在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)只有突變體ein3-1eil1-3的種子和葉片呈紫色，且花青素積累量明顯高于突變體ein3-1和野生型。通過GUS組織化學(xué)染色表明EIN3啟動(dòng)子主要在花、柱頭、成熟花粉、種子胚和果莢等生殖器官組織中有較強(qiáng)的表達(dá)。EIN3和EIL1基因共同缺失的突變體中花青素含量的增高表明擬南芥轉(zhuǎn)錄因子EIN3可能與EIL1共同參與抑制花青素的合成。是花青素合成的負(fù)調(diào)控因子的新成員。為完善花青素生物合成的分子調(diào)控機(jī)制提供了新的思路，但是EIN3轉(zhuǎn)錄因子抑制花青素合成的具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步研究。MBW(MYB/bHLH/TTG1)蛋白復(fù)合體被認(rèn)為在是花青素生物合成的調(diào)節(jié)子[35]。盡管在本研究中我們發(fā)現(xiàn)EIN3/EIL1是花青素生物合成的負(fù)向調(diào)控子。然而，核轉(zhuǎn)錄因子EIN3/EIL1的下游靶標(biāo)基因到底編碼MBW蛋白復(fù)合體中的哪個(gè)或哪些基因尚未知道。另外，EIN3/EIL1與下游基因構(gòu)成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是由什么信號(hào)介導(dǎo)的也未知。我們知道EIN3核轉(zhuǎn)錄因子既是糖信號(hào)分子也是乙烯信號(hào)分子[36]。因此，核轉(zhuǎn)錄因子EIN3/EIL1與下游靶標(biāo)基因構(gòu)成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或許由糖信號(hào)分子或乙烯信號(hào)分子介導(dǎo)。當(dāng)然這些只是初步推測，具體通過RT-PCR,ChIP,EMSA，分子遺傳等技術(shù)從不同角度驗(yàn)證下游靶標(biāo)基因及信號(hào)分子是什么。這也是我們將來工作的重點(diǎn)。

完善花青素生物合成的分子調(diào)控機(jī)制不僅可以豐富植物次級代謝的理論基礎(chǔ)，也可以通過基因工程、代謝工程等生物技術(shù)手段提高果實(shí)和蔬菜的食用價(jià)值和品質(zhì)。同時(shí)也為實(shí)現(xiàn)人工調(diào)控工業(yè)化生產(chǎn)花青素提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1.Winkel-Shirley B.Flavonoid biosynthesis.A colorful model for genetics,biochemistry,cell biology,and biotechnology[J].Plant Physiology,2001,126(2):485-493.

2.Kramer G F,Norman H A,Krizek D T,et al.Influence of UV-B radiation on polyamines,lipid peroxidation and membrane lipids in cucumber[J].Phytochemistry,1991,30(7):2101-2108.

3.Krol M,Gray G R,Hurry N P A,et al.Low-temperature stress and photoperiod affect an increased tolerance to photoinhibition inPinusbanksianaseedlings[J].Canadian Journal of Botany,1995,73(8):1119-1127.

4.許志茹,馬靜,崔國新,等.蕪菁類黃酮3′-羥化酶基因的功能鑒定及啟動(dòng)子初步分析[J].植物研究,2015,35(4):572-582.

Xu Z R,Ma J,Cui G X,et al.Functional identification and promoter preliminary analysis of Flavonoid 3′-hydroxylase genes in turnip[J].Bulletin of Botanical Research,2015,35(4):572-582.

5.武傳建,戚驍,李仁賽,等.甘薯IbANR基因的多態(tài)性分析[J].江蘇師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2017,35(1):31-33.

Wu C J,Qi X,Li R S,et al.Polymorphic analyses ofIbANRgene from sweetpotato[J].Journal of Jiangsu Normal University:Natural Science Edition,2017,35(1):31-33.

6.Pelletier M K,Murrell J R,Shirley B W.Characterization of flavonol synthase and leucoanthocyanidin dioxygenase genes inArabidopsis(further evidence for differential regulation of ‘early’ and ‘late’ genes)[J].Plant Physiology,1997,113(4):1437-1445.

7.石少川,高亦珂,張秀海,等.植物花青素生物合成相關(guān)基因的研究及應(yīng)用[J].植物研究,2011,31(5):633-640.

Shi S C,Gao Y K,Zhang X H,et al.Progress on plant genes involved in biosynthetic pathway of anthocyanins[J].Bulletin of Botanical Research,2011,31(5):633-640.

8.Pourcel L,Irani N G,Lu Y H,et al.The formation of anthocyanic vacuolar inclusions inArabidopsisthalianaand implications for the sequestration of anthocyanin pigments[J].Molecular Plant,2010,3(1):78-90.

9.Sun Y,Li H,Huang J R,et al.ArabidopsisTT19 functions as a carrier to transport anthocyanin from the cytosol to tonoplasts[J].Molecular Plant,2012,5(2):387-400.

10.Meng L S.Transcription coactivatorArabidopsisANGUSTIFOLIA3 modulates anthocyanin accumulation and light-induced root elongation through transrepression of Constitutive Photomorphogenic1[J].Plant,Cell and Environment,2015,38(4):838-851.

11.Meng L S,Li Y Q,Liu M Q,et al.TheArabidopsisANGUSTIFOLIA3-YODAgene cascade induces anthocyanin accumulation by regulating sucrose levelsg[J].Frontiers in Plant Science,2016,7:1728.

12.Yanagisawa S,Yoo S D,Sheen J.Differential regulation of EIN3 stability by glucose and ethylene signalling in plants[J].Nature,2003(6957):521-525.

13.Chao Q M,Rothenberg M,Solano R,et al.Activation of the ethylene gas response pathway inArabidopsisby the nuclear protein ETHYLENE-INSENSITIVE3 and related proteins[J].Cell,1997,89(7):1133-1144.

14.Alonso J M,Stepanova A N,Solano R,et al.Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants inArabidopsis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2003,100(5):2992-2997.

15.Zhong S W,Zhao M T,Shi T Y,et al.EIN3/EIL1 cooperate with PIF1 to prevent photo-oxidation and to promote greening ofArabidopsisseedlings[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2009,106(50):21431-21436.

16.Cao W H,Liu J,He X J,et al.Modulation of ethylene responses affects plant salt-stress responses[J].Plant Physiology,2007,143(2):707-719.

17.Yin X R,Allan A C,Zhang B,et al.Ethylene-related genes show a differential response to low temperature during ‘Hayward’ kiwifruit ripening[J].Postharvest Biology and Technology,2009,52(1):9-15.

18.Hiraga S,Sasaki K,Hibi T,et al.Involvement of two rice ETHYL-ENE INSENSITIVE3-LIKE genes in wound signaling[J].Molecular Genetics and Genomics,2009,282(5):517-529.

19.Li Z H,Peng J Y,Wen X,et al.ETHYLENE-INSENSITIVE3 is a senescence-associated gene that accelerates age-dependent leaf senescence by directly repressing miR164 transcription inArabidopsis[J].The Plant Cell,2013,25(9):3311-3328.

20.Shi Y T,Tian S W,Hou L Y,et al.Ethylene signaling negatively regulates freezing tolerance by repressing expression of CBF and type-A ARR genes inArabidopsis[J].The Plant Cell,2012,24(5):2578-2595.

21.Rabino I,Mancinelli A L.Light,temperature,and anthocyanin production[J].Plant Physiology,1986,81(3):922-924.

22.沈維亮,靳艷玲,丁凡,等.紫薯加工廢水中花青素的快速分離方法[J].江蘇師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2016,34(4):25-28.

Shen W L,Jin Y L,Ding F,et al.A simple method of anthocyanin isolation from wastewater of purple sweet potato[J].Journal of Jiangsu Normal University:Natural Science Edition,2016,34(4):25-28.

23.Meng L S,Yao S Q.Transcription co-activatorArabidopsisANGUSTIFOLIA3(AN3) regulates water-use efficiency and drought tolerance by modulating stomatal density and improving root architecture by the transrepression ofYODA(YDA)[J].Plant Biotechnology Journal,2015,13(7):893-902.

24.Shan X Y,Zhang Y S,Peng W,et al.Molecular mechanism for jasmonate-induction of anthocyanin accumulation inArabidopsis[J].Journal of Experimental Botany,2009,60(3):3849-3860.

25.Deikman J,Hammer P E.Induction of anthocyanin accumulation by cytokinins inArabidopsisthaliana[J].Plant Physiology,1995,108(5):47-57.

26.Ramsay N A,Glover B J.MYB-bHLH-WD40 protein complex and the evolution of cellular diversity[J].Trends in Plant Science,2005,10(2):63-70.

27.Borevitz J O,Xia Y J,Blount J,et al.Activation tagging identifies a conserved MYB regulator of phenylpropanoid biosynthesis[J].The Plant Cell,2000,12(12):2383-2394.

28.Springob K,Nakajima J I,Yamazaki M,et al.Recent advances in the biosynthesis and accumulation of anthocyanins[J].Natural Product Reports,2003,20(3):288-303.

29.Jin H L,Cominelli E,Bailey P,et al.Transcriptional repression by AtMYB4 controls production of UV-protecting sunscreens inArabidopsis[J].The EMBO Journal,2000,19(22):6150-6161.

30.Matsui K,Umemura Y,Ohme-Takagi M.AtMYBL2,a protein with a single MYB domain,acts as a negative regulator of anthocyanin biosynthesis inArabidopsis[J].The Plant Journal,2008,55(6):954-967.

31.Pauwels L,Goossens A.The JAZ proteins:A crucial interface in the jasmonate signaling cascade[J].The Plant Cell,2011,23(9):3089-3100.

32.Song S S,Huang H,Gao H,et al.Interaction between MYC2and ETHYLENE INSENSITIVE3modulates antagonism between jasmonate and ethylene signaling inArabidopsis[J].The Plant Cell,2014,26(1):263-279.

33.Zhang X,Zhu Z Q,An F Y,et al.Jasmonate-activated MYC2 represses ETHYLENE INSENSITIVE3 activity to antagonize ethylene-promoted apical hook formation inArabidopsis[J].The Plant Cell,2014,26(3):1105-1117.

34.Koes R,Verweij W,Quattrocchio F.Flavonoids:A colorful model for the regulation and evolution of biochemical pathways[J].Trends in Plant Science,2005,10(5):236-242.

35.Qi T C,Song S S,Ren Q C,et al.The Jasmonate-ZIM-domain proteins interact with the WD-Repeat/bHLH/MYB complexes to regulate jasmonate-mediated anthocyanin accumulation and trichome initiation inArabidopsisthaliana[J].Plant Cell,2011,23(5):1795-1814.

36.Yoo S D,Cho Y H,Tena G,et al.Dual control of nuclear EIN3 by bifurcate MAPK cascades in C2H4signalling[J].Nature,2008,451(7180):789-795.

Agricultural Science and Technology(Agricultural High-tech Project)(KC16NG063)

introduction：XU Meng-Ke(1993—),female,postgraduate student,whose main research is molecular biology.

date:2017-05-11

ArabidopsisthalianaTranscriptionFactorEthylene-insensitive3(EIN3)InhibitstheSynthesisofAnthocyanins

XU Meng-Ke1,2LI Dan1,2MENG Lai-Sheng1,2*JIANG Ji-Hong1,2

(1.The Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plant of Jiangsu Province,Xuzhou 221116；2.College of Life Science,Jiangsu Normal University,Xuzhou 221116)

Ethylene-insensitive3(EIN3) and EIN3-like1(EIL1) proteins are important nuclear transcription factors in ethylene signal transduction pathways in higher plants. In plants, anthocyanins are one of the water-soluble natural pigments, and they play an important role in the growth and development of plants. We used theArabidopsisthalianadouble mutantein3-1eil1-3 as the research material. Firstly, we identified the mutants ofein3-1eil1-3 andein3-1 by RT-PCR. The direct observation indicated that the seeds and leaves of theein3-1eil1-3 were purple. By ultraviolet spectrophotometer analysis, the anthocyanin accumulation inein3-1eil1-3 mutant was significantly higher than that in theein3-1 mutant and wild-type.GUSstaining showed thatEIN3 was mainly expressed in flowers, stigma, mature pollen, seed embryo and siliques, which was consistent with that anthocyanin accumulation of seeds and leaves was high in mutantein3-1eil1-3. Thus,A.thalianatranscription factor EIN3 as well as EIL1 is involved in the suppression of the anthocyanin synthesis.

ethylene-insensitive3(EIN3)；ethylene-insensitive3-like 1(EIL1)；anthocyanins;Arabidopsisthaliana

農(nóng)業(yè)科技(農(nóng)業(yè)高技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目)(KC16NG063)

徐夢珂(1993—)，女，碩士研究生，主要從事分子生物學(xué)方面的研究。

* 通信作者：E-mail:menglsh@jsnu.edu.cn

2017-05-11

* Corresponding author：E-mail:menglsh@jsnu.edu.cn

Q786

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2018.01.018