張麗麗 張富春*

(1.新疆大學生命科學與技術(shù)學院，烏魯木齊 830046； 2.新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

短期鹽脅迫下鹽穗木的轉(zhuǎn)錄組分析

張麗麗1,2張富春1,2*

(1.新疆大學生命科學與技術(shù)學院，烏魯木齊 830046；2.新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

鹽穗木(Halostachyscaspica)是荒漠鹽堿地廣泛分布的鹽生植物，具有極強的耐鹽性。為揭示鹽脅迫下鹽穗木基因組層面的基因表達變化特性，通過對300和500 mmol·L-1NaCl脅迫3 h的鹽穗木同化枝進行了轉(zhuǎn)錄組測序。有效序列組裝共得到153 298條平均長度為643 bp的unigenes，進行GO和KEGG功能聚類，分別獲得47個GO功能小類和118個KEGG通路。差異表達基因分析顯示，短期低鹽(300 mmol·L-1)響應(yīng)基因有4 432個，高鹽(500 mmol·L-1)響應(yīng)基因有2 580個，兩個脅迫的共差異基因有1 245個，主要富集在細胞過程、代謝過程和響應(yīng)刺激等類別中。從短期鹽脅迫下鹽穗木轉(zhuǎn)錄組篩選出滲透調(diào)節(jié)和活性氧清除的相關(guān)基因，大多為上調(diào)基因。說明鹽穗木能夠通過促進滲透調(diào)節(jié)和增強活性氧清除提高短期的鹽脅迫適應(yīng)能力。

鹽穗木；鹽脅迫；轉(zhuǎn)錄組；差異基因；滲透調(diào)節(jié)；活性氧

土壤鹽漬化不僅是導致生態(tài)環(huán)境惡化的主要原因，同時也是世界范圍內(nèi)影響農(nóng)作物生產(chǎn)的主要非生物脅迫因素之一[1]。高濃度的鹽會對植物產(chǎn)生包括滲透脅迫、氧化脅迫和離子毒害等的次級傷害，嚴重地影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。新疆作為中國最大的鹽堿土分布區(qū)域，土壤鹽漬化面積高達11萬km2，占新疆總面積的7%[2]，但在新疆荒漠鹽堿環(huán)境中卻生長著種類繁多的鹽生植物[3～5]，因此，深入研究新疆荒漠鹽堿地區(qū)生長的鹽生植物耐鹽的分子機制，篩選和挖掘耐鹽功能基因，有助于利用基因工程技術(shù)改良植物的耐鹽性，培育耐鹽能力強的農(nóng)作物新品種，成為開發(fā)鹽堿地的重要技術(shù)手段。但由于對植物的耐鹽分子機制的了解甚少，同時缺乏有效的耐鹽基因，其直接影響了植物耐鹽基因工程技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展[6]。

RNA-seq技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用，使得非模式生物在基因組層面基因表達變化的研究有了迅猛的發(fā)展。例如利用RNA-Seq技術(shù)對鹽脅迫下日本結(jié)縷草(Zoysiajaponica)的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的差異表達基因主要富集在響應(yīng)刺激、響應(yīng)脅迫等GO功能分類中[7]；對鹽脅迫下堿蓬(Suaedaglauca)的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)運蛋白以及細胞壁和生長等功能聚類中的差異基因顯著富集，這些基因參與了植物的鹽脅迫響應(yīng)[8]。對鹽脅迫下鹽穗木轉(zhuǎn)錄組的分析表明DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因HcRev1、HcRev3基因受鹽脅迫誘導表達，參與了DNA損傷修復(fù)[9]。

鹽穗木(Halostachyscaspica)隸屬藜科(Chenopodiaceae)鹽穗木屬(Halostachys)，廣泛分布在荒漠鹽堿地區(qū)，綠色期長，生態(tài)價值重要。在長期高鹽逆境中，鹽穗木進化出抵御鹽脅迫獨特的抗逆特性。利用高通量測序技術(shù)，檢測鹽脅迫下鹽穗木的轉(zhuǎn)錄組，是研究鹽穗木響應(yīng)鹽脅迫差異基因表達的較好途徑。利用RNA-Seq技術(shù)對短期(3 h)低鹽(300 mmol·L-1)和高鹽(500 mmol·L-1)脅迫下鹽穗木的轉(zhuǎn)錄組進行測序，并對共差異基因進行GO注釋分析和驗證，為深入探討鹽穗木的耐鹽分子機制和篩選相關(guān)耐鹽功能基因奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及處理

鹽穗木種子采自野外鹽堿地(新疆五家渠103團，東經(jīng)87.31°北緯44.29°)，在室溫下，將種子種于蛭石和珍珠巖混合的培養(yǎng)基質(zhì)中使其萌發(fā)，待鹽穗木幼苗生長到5個月左右，分別以含有300 mmol·L-1NaCl和500 mmol·L-1NaCl的Hoagland’s營養(yǎng)液澆灌作為處理組，正常的Hoagland’s營養(yǎng)液澆灌作為對照組，處理3 h后，迅速將處理組和對照組植物的同化枝分別置于液氮中，再轉(zhuǎn)移至-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 cDNA文庫的構(gòu)建和Illumina HiSeq2000測序

鹽穗木同化枝樣品的后續(xù)處理包括總RNA的提取、純化、質(zhì)量分析和構(gòu)建cDNA文庫以及轉(zhuǎn)錄組測序工作由武漢生命之美科技有限公司完成，采用Illumina HiSeq2000測序平臺進行測序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

每個處理組選取3個樣本獲得的有效序列(clean reads)用Trinity軟件進行雙端有方向的組裝得到unigenes。將這些unigenes比對到擬南芥蛋白庫上，所選參數(shù)E-value為1e-5。用Blast2GO軟件對unigenes進行GO功能注釋。Unigenes的表達量采用RPKM(Reads per kilo base per million mapped reads)的方法計算。本研究以0 mmol·L-1NaCl組的表達量作為對照組，利用edgeR軟件進行差異表達基因分析，將變化倍數(shù)(fold change)≥2和P值(Pvalue)≤0.01作為差異基因的篩選標準。

1.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

為驗證鹽穗木轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的準確性，挑選了5個基因，用Primer 5.0設(shè)計引物，檢測高鹽脅迫下qRT-PCR與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的一致性。將各樣品3個生物學重復(fù)采用植物總RNA提取試劑盒(Omega公司)提取總RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶以O(shè)ligo(dT)(Takara公司)為引物合成第一條cDNA鏈,以cDNA鏈為模板,Actin為內(nèi)參,具體操作步驟參照SYBR Green RT-PCR試劑盒(QIAGEN公司)說明書進行,使用7500 Real Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosysteme公司)進行實時熒光定量檢測。每個樣品進行3個技術(shù)重復(fù),采用2-ΔΔCt法進行相對表達量計算。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

使用HiSeq2000高通量測序平臺對樣本進行測序所得的數(shù)據(jù)為原始測序數(shù)據(jù)(raw reads)具體值見表1。原始測序序列去除接頭序列，去除含有兩個N的reads，以及去除低質(zhì)量值的reads，得到有效序列(表1)。所有有效序列的百分數(shù)均大于92.99%。將3個樣本測序得到的有效序列合并，用Trinity軟件進行雙端有方向組裝共得到153 298條unigenes，平均長度為643 bp，N50為991 bp，最長的unigene為10 718 bp，最短的為201 bp。

表1 鹽穗木轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

2.2 Unigene的GO功能注釋

將組裝所得到的153 298個unigenes進行比對分析，共有71 758個unigenes比對到Nr蛋白庫，88 946個比對到擬南芥蛋白庫。用blast2go對比對到擬南芥蛋白庫的unigenes進行GO注釋，有69 526個unigenes(78,17%)有GO注釋，富集到3個大類47個小類(圖1)。參與生物學過程(biological processes)的基因主要為鹽脅迫應(yīng)答(response to salt stress)、鎘離子應(yīng)答(response to cadmium ion)、損傷應(yīng)答(response to wounding)、冷脅迫應(yīng)答(response to cold)等相關(guān)基因，這些基因可能與鹽穗木耐鹽密切相關(guān)(圖1A)。參與細胞組分(cellular components)的基因在細胞核類別(nucleus)所占比例最高，其次為質(zhì)膜類別(plasma membrane)和葉綠體類別(chloroplast)(圖1B)。在分子功能(molecular functions)分類中，蛋白質(zhì)結(jié)合類別(protein binding)所占比例最高，其次為轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity)、ATP結(jié)合(ATP binding)和DNA結(jié)合(DNA binding)類別(圖1C)。

圖1 鹽穗木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)GO分類注釋圖 A.生物學過程；B.細胞組分；C.分子功能Fig.1 Gene ontology classification annotation of transcriptome of H.caspica A.Biological process；B.Cellular component；C.Molecular function

2.3 KEGG通路注釋結(jié)果

將unigenes比對到KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫并注釋信息，得到了unigenes的Pathway注釋。再結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫, 對鹽穗木的unigenes可能參與或涉及的代謝途徑進行了統(tǒng)計分析。結(jié)果表明9 128條unigenes富集到118個代謝通路中，其中富集前15的通路 (top 15 pathways)如圖2所示，富集最多unigenes的通路為代謝通路(Metabolic pathways)，共有2 339個unigenes表達，其次為次生代謝物的生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites)，富集到的unigenes有1 212個。

2.4 鹽穗木響應(yīng)鹽脅迫的差異表達基因(DEG)分析

對樣本cluster后的unigene進行差異表達基因分析。同化枝中300 mmol·L-1NaCl脅迫組與對照組相比差異基因共4 432個，上調(diào)表達的基因有1 343個，下調(diào)表達基因有3 089個；而500 mmol·L-1NaCl脅迫組與對照相比差異基因則有2 580個，上調(diào)基因有859個，下調(diào)表達基因有1 721個。在同化枝中兩個鹽脅迫處理組的共差異基因共1 245個(圖3A)，其中共上調(diào)基因307個(圖3B)，共下調(diào)基因934個(圖3C)。短期鹽脅迫下，無論是在高鹽還是低鹽濃度下，下調(diào)unigenes的數(shù)量都明顯高于上調(diào)unigenes的數(shù)量。

為深入了解共差異基因的功能，用WEGO在線軟件對共差異基因進行功能聚類分析，共差異基因可聚為3個大類40個小類，上調(diào)基因和下調(diào)基因均在細胞(cell)、細胞部分(cell part)、細胞器(organelle)、結(jié)合(binding)、催化(catalytic)、細胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)和響應(yīng)刺激(response to stimulus)等類別中的基因所占比例較高(圖5)。分析結(jié)果表明上調(diào)基因還在電子載體(electron carrier)、結(jié)構(gòu)分子(structural molecule)等聚類中富集；而下調(diào)基因則在死亡(death)中富集。

圖2 鹽穗木轉(zhuǎn)錄組的KEGG通路分析Fig.2 KEGG pathway analysis of transcriptome of H.caspica

圖3 鹽脅迫下鹽穗木差異表達基因的維恩圖Fig.3 Venn diagram of the differentially expressed unigenes in H.caspica at salt stress

圖4 共差異基因的GO功能聚類注釋圖Fig.4 Gene Ontology classification annotation of co-differentially expressed genes

2.4.1 鹽脅迫下滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因的差異表達

在高鹽脅迫的條件下，植物細胞中的離子平衡被打破，造成高滲損傷。為了緩解細胞受到的傷害，大多數(shù)植物會在體內(nèi)合成和累積滲透保護劑或滲調(diào)劑的小分子化合物，提高細胞的抗逆能力。滲調(diào)劑主要有三類：糖類如海藻糖；甜菜堿及其衍生物；醇類及各種氨基酸，如脯氨酸[10～11]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析篩選出海藻糖、甜菜堿以及脯氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶基因。低鹽脅迫下，篩選出3個上調(diào)的滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因，都與海藻糖合成相關(guān)，而高鹽脅迫下，篩選出6個滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因，1個海藻糖合成關(guān)鍵酶基因和5個甜菜堿合成的關(guān)鍵酶基因(表2)。

圖5 DEGs的qRT-PCR驗證Fig.5 Verification of DEGs using qRT-PCR

2.4.2 鹽脅迫下活性氧清除相關(guān)基因的差異表達

鹽對植物生長的影響，大多是由于氧自由基破壞了生物膜的結(jié)構(gòu)，使其喪失功能，從而導致細胞死亡。植物能夠通過酶促反應(yīng)清除系統(tǒng)清除體內(nèi)的活性氧。本研究選擇部分活性氧清除的相關(guān)酶，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、硫氧還蛋白(Trx)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和過氧化氫酶(CAT)等進行分析。在300 mmol·L-1NaCl脅迫下，篩選了13個活性氧清除的相關(guān)酶基因，大部分為上調(diào)基因，而在500 mmol·L-1NaCl脅迫下，只篩選出7個活性氧清除相關(guān)基因，4個上調(diào)基因，3個下調(diào)基因(表2)。

表2 短期鹽脅迫響應(yīng)的基因

2.5 實時熒光定量PCR驗證高鹽脅迫下基因的表達變化

隨機選取5個篩選獲得的基因 (高鹽脅迫下3個上調(diào)基因和2個下調(diào)基因)，利用實時熒光定量PCR進行對照組和高鹽脅迫組基因的表達變化分析。結(jié)果顯示，實時熒光定量PCR與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果在基因表達變幅上有一定的差異，但基因的表達趨勢是一致的(圖5)，這說明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果通過驗證是可靠的。

3 討論

生長在荒漠鹽堿地區(qū)的鹽穗木，由于生存逆境的長期適應(yīng)，具有極強的耐鹽能力。利用RNA-Seq技術(shù)，對300和500 mmol·L-1鹽脅迫3 h的鹽穗木以及0 mmol·L-1NaCl對照組的轉(zhuǎn)錄組進行測序，組裝得到153 298條unigenes，被注釋到47個條目中。KEGG分析顯示，這些基因共參與118個通路，其中最顯著富集的通路為代謝通路，主要包括脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝和多糖的生物合成和代謝等。脂質(zhì)和蛋白是植物細胞膜的主要組分，在植物細胞對外界環(huán)境脅迫應(yīng)答中起到主要的防御作用。不同的脅迫因素會擾亂細胞膜上脂質(zhì)和蛋白的共粘連而影響脂質(zhì)的代謝。研究表明歐洲油菜中脂質(zhì)含量會隨著NaCl水平的升高而降低[12]。增加土壤的鹽濃度會嚴重影響脂質(zhì)的生物合成，低不飽和脂肪的程度限制了細胞膜的流動性，從而影響了Na+和Cl-的滲透性[13～14]。而多糖作為另外一種重要的代謝物質(zhì)，其生物合成代謝不僅為植物的生長提供的能量，同時分解產(chǎn)生的小分子單糖可以調(diào)控植物細胞的滲透壓以抵抗鹽脅迫。次生代謝物的生物合成途徑，包括生物堿、帖類化合物和黃酮類化合物等在抵御病原物的入侵方面也發(fā)揮著重要的作用，通常還可以作為信號物質(zhì)參與植物抗脅迫相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導[15～17]。

共差異基因的GO分析顯示，短期鹽脅迫下，無論是在高鹽(500 mmol·L-1)還是低鹽(300 mmol·L-1)濃度下，下調(diào)unigenes的數(shù)量都明顯高于上調(diào)的數(shù)量。差異表達基因在細胞過程、代謝過程和響應(yīng)刺激等類別中的基因所占比例較高。這與趙航等人用600 mmol·L-1處理鹽穗木12和24 h得到的結(jié)果類似[18]。

滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)逆境脅迫的重要反應(yīng)。植物的主要滲調(diào)劑包括兩類：一類是外源的無機離子，通過細胞膜上的離子泵調(diào)節(jié)胞內(nèi)外的離子濃度，維持細胞的滲透壓；另一類是植物自身合成的小分子有機溶質(zhì)，包括糖類、甜菜堿及其衍生物、醇類及各種氨基酸。在鹽脅迫下的鹽離子存在，使植物對部分無機元素的吸收受到影響，因此小分子有機物就起到維持細胞的滲透勢和降低鹽離子對生物膜損傷的作用[19～23]。本研究從300 mmol·L-1NaCl處理鹽穗木早期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，篩選出3個滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因，且均為海藻糖合成的關(guān)鍵酶基因，說明海藻糖在低鹽脅迫鹽穗木早期起關(guān)鍵作用。而在高鹽脅迫鹽穗木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出了6個滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因，其中4個磷酸乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PEAMT)基因均上調(diào)，而PEAMT的主要作用是催化磷酸乙醇胺發(fā)生三次甲基化，最終生成膽堿，膽堿又可以經(jīng)過催化生成甜菜堿。已有的研究表明，當土壤微生物枯草芽孢桿菌(GB03)與擬南芥共培養(yǎng)，擬南芥的膽堿和甘氨酸甜菜堿的合成提高2～5倍，從而提高甘露醇對擬南芥造成的滲透脅迫的抵抗能力，而GB03與peamt突變體擬南芥共培養(yǎng)時，擬南芥的抗旱能力消失，說明PEAMT是合成膽堿的關(guān)鍵酶，在植物的抗旱中起重要作用[24]。意味著海藻糖和甜菜堿分別在鹽穗木低鹽和高鹽脅迫早期的滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

高濃度的鹽對植物體產(chǎn)生滲透脅迫的同時，也可使植物體積累過量的活性氧，產(chǎn)生氧化脅迫，使細胞的正常代謝受到抑制，最終導致細胞產(chǎn)生氧化損傷甚至死亡[25～26]。為快速有效地清除細胞內(nèi)堆積的大量活性氧，植物在受到鹽脅迫后，就會產(chǎn)生一系列的抗氧化酶類來清除活性氧[27]。Chen等人的研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫后楊樹的超氧化物歧化酶、抗壞血酸過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶的活性都提高了8～10倍[28]。Vaidyanathan等人發(fā)現(xiàn)鹽耐受型水稻相比于鹽敏感型水稻，其幼苗在用100 mmol·L-1NaCl和300 mmol·L-1NaCl處理后，表現(xiàn)出了更高的活性氧(ROS)清除能力，過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸(ASC)和谷胱甘肽(GSH)等抗氧化劑的水平顯著增強，盡管超氧化物歧化酶(SOD)的活性稍低，但在細胞膜損傷程度和細胞內(nèi)H2O2含量方面都表現(xiàn)出了優(yōu)勢[29]。本研究篩選了活性氧清除的相關(guān)酶，包括SOD、POD、Trx、GST和CAT。在低鹽處理鹽穗木早期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出13個，且大部分都是上調(diào)基因，而在高鹽脅迫下，篩選出7個ROS清除相關(guān)基因，4個上調(diào)基因，3個下調(diào)基因。在低鹽脅迫下，植物可能通過合成大量的ROS清除相關(guān)的酶類，來降低植物受到的氧化損傷，而高鹽可能破壞了植物的活性氧清除相關(guān)體系，所以只有少數(shù)基因能夠響應(yīng)鹽脅迫。

4 結(jié)論

利用RNA-Seq技術(shù)短期高鹽和低鹽脅迫的鹽穗木進行轉(zhuǎn)錄組測序，分析了在低鹽和高鹽的脅迫下差異表達基因和共差異基因，表明差異表達基因主要富集在細胞過程、代謝過程和響應(yīng)刺激等類別中。而篩選的滲透調(diào)節(jié)和活性氧清除的相關(guān)基因多為上調(diào)基因，證明鹽穗木能夠通過促進滲透調(diào)節(jié)和增強活性氧清除提高短期的鹽脅迫適應(yīng)能力。該研究為進一步探討鹽穗木耐鹽分子機制和挖掘耐鹽關(guān)鍵基因奠定了理論基礎(chǔ)。

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Supported by Special Funds of Xinjiang Key Laboratory(2014KL001)

introduction：ZHANG Li-Li(1993—),female,master student,mainly engages in research of molecular biology of plant.

date:2017-05-08

TranscriptomicAnalysisoftheHalostachyscaspicainResponsetoShort-termSaltStress

ZHANG Li-Li1,2ZHANG Fu-Chun1,2*

(1.College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046；2.Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering,Urumqi 830046)

As a halophyte with strong salt tolerance,Halostachyscaspicawidely distributes in desert saline-alkali land. In order to reveal the genomic changes of gene expression under salt stress, transcriptome sequencing ofH.caspicaassimilating branches with treatments of 300 and 500 mmol·L-1NaCl for 3 h was performed. A total of 153 298 unigenes with an average length of 643 bp were obtained with clean reads assembled. The 47 subclasses and 118 KEGG pathways were enriched in the GO terms and KEGG pathways, respectively. Differentially expressed genes analysis showed that there were 4 432 and 2 580 unigenes in response to low salt (300 mmol·L-1) and high salt (500 mmol·L-1) in short-term stress, respectively. The 1 245 unigenes were the common differentially expressed genes in the two salt stresses. They were mainly enriched in cellular process, metabolic process and response to stimulus. The osmotic regulation and reactive oxygen species (ROS) scavenging genes were screened out, and most of them were up-regulated. Therefore,H.caspicacould improve short-term salt stress adaptation by enhancing the osmotic adjustment and ROS scavenging.

Halostachyscaspica;salt stress;transcriptome;differentially expressed genes;osmotic adjustment;reactive oxygen species

新疆重點實驗室專項資金資助項目(2014KL001)

張麗麗(1993—)，女，碩士研究生，主要從事植物分子生物學研究。

* 通信作者：E-mail:zfcxju@xju.edu.cn

2017-05-08

* Corresponding author：E-mail:zfcxju@xju.edu.cn

S687

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2018.01.011