王亞婷 石春蕊 武奕 師蓓 熊瀟 周蘭霞

730000蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院蘭州大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科

慢性自發(fā)性蕁麻疹患者外周血Treg細胞比例和白細胞介素17A、27水平及意義

王亞婷 石春蕊 武奕 師蓓 熊瀟 周蘭霞

730000蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院蘭州大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科

目的探討外周血中CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T（Treg）細胞、白細胞介素17A（IL?17A）和IL?27在慢性自發(fā)性蕁麻疹發(fā)病機制中的作用。方法收集37例慢性自發(fā)性蕁麻疹患者和40例健康對照外周血標本。采用流式細胞儀檢測外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中IL?17A和IL?27水平。結(jié)果慢性自發(fā)性蕁麻疹患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例（5.99%±2.72%）明顯低于健康對照組（9.07%±3.44%，t=4.325，P＜ 0.01），IL?27水平［（20.54 ± 7.65）ng/L］亦低于健康對照組［（26.63± 9.72）ng/L，t=3.039，P=0.003］，IL?17A表達水平與健康對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.529）。慢性自發(fā)性蕁麻疹患者IL?17A表達水平與CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例呈負相關(guān)（r=-0.359，P=0.029），IL?17A、IL?27、CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例與UAS評分均無顯著相關(guān)性（r值分別為-0.076、-0.083、-0.053，均P＞0.05）。結(jié)論慢性自發(fā)性蕁麻疹患者外周血中可能存在Th17/Treg細胞失衡，且IL?27可能參與慢性自發(fā)性蕁麻疹的發(fā)病過程。

蕁麻疹；白細胞介素17；T淋巴細胞，調(diào)節(jié)性；白細胞介素27

研究表明，慢性自發(fā)性蕁麻疹（chronic spontaneous urticaria，CSU）患者體內(nèi)存在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞和Th17細胞間的失衡，可能是其發(fā)病的機制之一［1］。白細胞介素17A（IL?17A）是主要由Th17細胞分泌的一類促炎因子，參與自身免疫、炎癥反應(yīng)，起免疫監(jiān)視作用。IL?27是對Th17/Treg細胞有調(diào)節(jié)作用的細胞因子，促進Treg細胞分化，阻止Th17細胞分化［2］。Th17/Treg細胞軸及其相關(guān)細胞因子在CSU中的調(diào)節(jié)機制尚不完全清楚，且IL?27在CSU病理過程中對Th17/Treg細胞軸的影響也不清楚。我們檢測CSU患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例，測定IL?17A及IL?27表達，分析CD4+CD25+CD127lowTreg細胞、IL?17A 和IL?27之間的相關(guān)性，探討其在CSU發(fā)病中的作用。

一、對象與方法

1.研究對象：CSU患者37例，來自2016年1-6月蘭州大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科門診，均符合CSU診斷標準［3］。其中男19例，女18例，年齡（40.41±15.33）歲，平均病程16.4個月（3個月至10年）。對照組40例，其中男21例，女19例，年齡（41.85±14.44）歲，均為本院健康體檢者。兩組受試者性別（P=0.551）及年齡（P=0.672）分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.試劑和儀器：人IL?17A ELISA試劑盒（編號GR213356?6）來自英國abcam公司，人IL?27 ELISA試劑盒來自武漢華美生物工程有限公司（編號：W23010221）。鼠抗人CD4異硫氰酸熒光素?zé)晒饪贵w、CD25別藻藍蛋白熒光抗體、CD127藻紅蛋白熒光抗體均來自美國BD公司。全自動酶標儀（型號Victor2）產(chǎn)自芬蘭珀金埃爾默公司。流式細胞儀（型號FACSCANTOⅡ）產(chǎn)自美國BD公司。

3.標本的收集與檢測：抽取受試者外周血8 ml，分為抗凝血4 ml和促凝血4 ml。將抗凝血在4 h內(nèi)進行流式細胞儀分析；用促凝血分離血清，-80℃冰箱保存待測，采用ELISA雙抗體夾心法測定血清IL?17A、IL?27濃度。

（1）流式細胞儀檢測Treg細胞：按照試劑盒說明書進行。將100 μl抗凝血樣品加入到流式管，分別加入CD4抗體、CD25抗體、CD127抗體，室溫避光孵育20 min；將450 μl紅細胞裂解液加入流式管中，室溫避光孵育10 min；離心5 min，棄上清液；PBS清洗后重懸細胞，2 h內(nèi)使用流式細胞儀檢測，用軟件BD FACSDiva 7.0對檢測數(shù)據(jù)加以分析。

（2）ELISA檢測血清IL?27、IL?17A濃度：分別按照試劑盒說明書進行。最后于酶標儀上450 nm波長處檢測每孔的吸光度，并計算IL?27和IL?17A濃度。

4.疾病評分判定標準：根據(jù)EAACI/GA2LEN/EDF/WAO制定的蕁麻疹活動性評分（UAS）［3］評估。瘙癢：0分為無癥狀，1分為輕微癥狀，2分為中度癥狀對生活存在一定影響，3分為嚴重癥狀不能忍受。風(fēng)團數(shù)目：0分為無風(fēng)團，1分為新發(fā)風(fēng)團1～19個/24 h，2分為20～50個/24 h，3分為＞50個/24 h。風(fēng)團與瘙癢評分之和為UAS總分。

5.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料在方差齊性檢驗后進行t檢驗，相關(guān)性分析使用Spearman相關(guān)檢驗，顯著性檢驗水平為0.05。

二、結(jié)果

CSU患者組CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例（圖1）和血清IL?27水平均低于對照組（P＜ 0.01）；血清IL?17A水平兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.529），見表1。CSU患者CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例與血清IL?17A水平呈負相關(guān)（r=-0.359，P=0.029），與IL?27無顯著相關(guān)性（r=-0.141，P=0.404），IL?17A與IL?27亦無顯著相關(guān)性（r=0.053，P=0.754）；CSU患者UAS評分與IL?17A水平、IL?27水平、CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例均無顯著相關(guān)性（r值分別為-0.076、-0.083、-0.053，均P＞ 0.05）。

三、討論

Treg細胞是一類具有免疫抑制性的T細胞亞群，在維持機體免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)中具有重要作用［4］。轉(zhuǎn)錄因子叉頭狀/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子 3（forkhead or winged helix transcription factor 3，F(xiàn)oxp3）是人細胞的特異性標志，是Treg細胞分化、發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［5］，既往研究常使用CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例反映Treg細胞水平，但使用Foxp3標記時，處理標本需要固定、打孔等步驟，導(dǎo)致細胞損傷，使Treg細胞檢出率與實際水平相差較大。最近研究發(fā)現(xiàn)，使用CD4+CD25+CD127low標記Treg細胞時可以避免Foxp3標記過程中導(dǎo)致的細胞損傷，保證Treg細胞更好的活性和完整性，更準確地反映實際水平，故本研究使用CD4+CD25+CD127low細胞比例反映Treg細胞水平是目前較為理想的檢測指標［6］。我們發(fā)現(xiàn)CSU患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞百分比及IL?27水平均明顯低于健康對照組，與既往結(jié)果一致［2，7］。Arshi等［7］認為慢性蕁麻疹的免疫失調(diào)由Treg細胞比例下降引起，慢性蕁麻疹中Th17/Treg比例失衡，并且其相關(guān)細胞因子及趨化因子在CSU發(fā)病中具有重要作用，但Th17/Treg細胞如何發(fā)揮作用目前并未闡明。本研究顯示，IL?17A水平在CSU患者及健康對照組之間并無明顯差異，這與Arshi等［7］研究一致，但與國內(nèi)部分學(xué)者的研究結(jié)果并不一致［2，8］，我們推測可能與實驗人群所在區(qū)域的地理及人文環(huán)境不同有關(guān)。李潤祥等［8］認為，IL?17A經(jīng)血液循環(huán)到達皮膚和黏膜，釋放更多炎癥因子，促進機體全身和局部免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)是造成CSU發(fā)病的重要機制。IL?27可以通過STAT1途徑抑制IL?17A產(chǎn)生，抑制Th17細胞生成［9］，同時對Treg細胞具有雙向調(diào)節(jié)作用［10］，但在CSU發(fā)病中的作用尚不知曉。我們研究發(fā)現(xiàn)IL?27在CSU發(fā)病中，可能對Treg細胞具有正性調(diào)節(jié)作用，但對Th17細胞的作用與IL?27的生理作用不一致，這可能是由于IL?27僅是影響Th17細胞分化途徑中的一個方面，還有更多的未知因素影響CSU發(fā)病機制中Th17細胞分化途徑。作為調(diào)節(jié)Th17細胞及Treg細胞的關(guān)鍵細胞因子，IL?27降低可能是CSU患者Th17/Treg細胞失衡的重要原因。

CSU患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例及IL?27水平均明顯低于健康對照組，但兩者之間無明顯相關(guān)性，CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例與IL?17A水平之間呈負相關(guān)。由此我們推測Treg細胞比例降低，可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重，同時IL?17A促炎作用進一步加重炎癥反應(yīng)；CSU患者體內(nèi)IL?27水平降低可能會導(dǎo)致CSU患者T細胞亞群比例失調(diào)，且可能使Treg分泌IL?10減少，負性調(diào)節(jié)作用減弱。因此筆者認為在CSU患者體內(nèi)存在Th17細胞與Treg細胞之間的失衡。本研究未發(fā)現(xiàn)IL?27與CD4+CD25+CD127lowTreg細胞之間存在相關(guān)性，二者之間的聯(lián)系及作用機制尚需進一步研究；Treg細胞比例、IL?17A和IL?27水平與UAS評分無明顯相關(guān)性，推測三者可能只參與CSU發(fā)病及調(diào)節(jié)過程，不能反映其嚴重程度。今后應(yīng)對CSU患者體內(nèi)Th17/Treg細胞軸及其相關(guān)因子的功能和調(diào)節(jié)途徑進行深入研究。

圖1 流式細胞儀檢測外周血CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例

表1 慢性自發(fā)性蕁麻疹患者CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例、IL?17A和IL?27水平（±s）

表1 慢性自發(fā)性蕁麻疹患者CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例、IL?17A和IL?27水平（±s）

注：IL，白細胞介素

CD4+CD25+CD127low Treg（%）5.99±2.72 9.07±3.44 4.325 0.000組別患者組對照組t值P值例數(shù)37 40 IL?27（ng/L）20.54±7.65 26.63±9.72 3.039 0.003 IL?17A（ng/L）53.81±8.55 52.82±4.35 0.633 0.529

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Proportion of regulatory T cells and expression of interleukin?17A and ?27 in the peripheral blood of patients with chronic spontaneous urticaria and their significance

Wang Yating,Shi Chunrui,Wu Yi,Shi Bei,Xiong Xiao,Zhou Lanxia
Department of Dermatology and Venereology,The First Hospital of Lanzhou University,The First Clinical Medical College of Lanzhou University,Lanzhou 730000,China

Shi Chunrui,Email:stone7207@126.com

ObjectiveTo explore the role of peripheral blood CD4+CD25+CD127lowTreg cells,interleukin?17A（IL?17A）and IL?27 in the pathogenesis of chronic spontaneous urticaria（CSU）.MethodsPeripheral blood samples were obtained from 37 patients with CSU（CSU group）and 40 healthy controls（control group）.Flow cytometry was performed to determine the percentage of CD4+CD25+CD127lowTreg cells in the peripheral blood,and enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）to detect the serum levels of IL?17A and IL?27.ResultsThe percentage of CD4+CD25+CD127lowTreg cells in the peripheral blood（5.99%±2.72%vs.9.07%±3.44%,t=4.325,P＜0.01）and the serum level of IL?27（20.54±7.65 ng/Lvs.26.63±9.72 ng/L,t=3.039,P=0.003）were both significantly lower in the CSU group than in the control group.However,there was no significant difference in the serum level of IL?17A between the 2 groups（P=0.529）.Among the patients with CSU,the level of IL?17A was negatively correlated with the percentage of CD4+CD25+CD127lowTreg cells（r=-0.359,P=0.029）,while the urticaria activity score（UAS）was uncorrelated with the levels of IL?17A and IL?27 as well as the percentage of CD4+CD25+CD127lowTreg cells（r=-0.076,-0.083,-0.053 respectively,allP＞ 0.05）.ConclusionThere may be Th17/Treg imbalance in the peripheral blood of patients with CSU,and IL?27 may be involved in the occurrence of CSU.

Urticaria;Interleukin?17;T?lymphocytes,regulatory;Interleukin?27

Fund program:Health Industry Research Project of Gansu Province（GWGL2014?60）

石春蕊，Email：stone7207@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.12.014

甘肅省衛(wèi)生行業(yè)科研計劃管理項目（GWGL2014?60）

2016?12?11）

尚淑賢）