陳 燏，劉洪吉,2，尤倩倩，袁靖琳，宋 奇，郝 丹，劉 棟，蘭海靜，李全陽,*

（1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004；2.潔翼流體技術（上海）有限公司，上海 201404）

活性肽-N對D-半乳糖致衰老小鼠的作用效果

陳 燏1，劉洪吉1,2，尤倩倩1，袁靖琳1，宋 奇1，郝 丹1，劉 棟1，蘭海靜1，李全陽1,*

（1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004；2.潔翼流體技術（上海）有限公司，上海 201404）

為了探討一種新型抗衰老活性因子——活性肽-N食用后的抗衰老作用，本研究通過給小鼠連續(xù)皮下注射D-半乳糖（200 mg/（kg·d），以體質量計，下同）建立衰老模型，造模的同時開始灌胃2.5、25.0、125.0 μg/（kg·d）活性肽-N復乳，連續(xù)9 周。分別采用曠場實驗和Morris水迷宮實驗檢測小鼠的運動探究能力和學習記憶能力。上述行為學實驗后，對小鼠血清中谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及腦組織中的乙酰膽堿酯酶（acetyl cholinesterase，AChE）活力進行測定。結果表明，與衰老模型組相比，活性肽-N復乳高劑量組能顯著提高衰老小鼠的運動探究能力，改善其學習記憶能力，提高血清中的GSH-Px活力28.38%（P＜0.05），降低MDA含量26.19%（P＜0.05），同時降低腦組織中的AChE活力23.26%（P＜0.05）。綜合結果表明該活性肽-N對D-半乳糖致衰老小鼠具有明顯的抗衰老作用。

活性肽-N復乳；D-半乳糖；抗衰老；學習記憶

人的衰老是一種高度復雜的自然現(xiàn)象。它不僅受到遺傳因素的影響[1]，也受到飲食的重要影響，而且后者的比重更大[2]。人的飲食極其復雜，而衰老又是一個漫長的過程，因此研究飲食與衰老之間的關系非常困難，但又無法回避，所以從重要的影響因子入手，探索飲食與衰老的關系或許是一條有效途徑。而生物活性肽作為飲食中的功能性因子，具有成分明確、用量小等優(yōu)點，在機體的抗衰老制劑開發(fā)上具有良好前景[3-4]。目前研究已經發(fā)現(xiàn)了一系列生物活性肽，如抗氧化肽、細胞調節(jié)肽、神經保護肽[5-7]。

活性肽-N是8 個氨基酸組成的寡肽（Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln），是活性依賴性神經保護蛋白中的活性片段[8]。該活性肽的發(fā)現(xiàn)源于對人體活性腸肽的研究[9]，它是血管活性腸肽刺激神經膠質細胞產生的一種神經營養(yǎng)因子，由于其具有很強的神經保護作用而受到重視。由于它的分子質量較小，目前該活性肽樣品皆由生物合成。一系列研究表明，活性肽-N對神經損傷的治療上具有廣闊的應用前景[10-12]。在肌萎縮性脊髓側索硬化小鼠模型中，皮下注射活性肽-N能減少tau蛋白的異常過度磷酸化，保護軸突轉運免受損害[11]。腦麻痹新生小鼠模型通過腹腔注射活性肽-N能顯著減少其神經元凋亡數(shù)量[12]。在不可逆的局灶性腦缺血大鼠模型中，靜脈注射活性肽-N能有效減少其腦部梗死面積[13]。近期的研究表明，活性肽-N在急性回腸炎小鼠模型中還具有顯著的全身性抗炎作用[14]。目前國外關于活性肽-N的研究很多，國內則比較少見，它作為一種天然的神經保護肽，具有無毒副作用、安全性高的特點[12]。在大部分研究中，活性肽-N均是通過注射的方式使用的，現(xiàn)有報道資料中還鮮見有關活性肽-N口服抗衰老活性的研究報道。與注射給藥這種方式相比，口服更易被接受，它不僅服用方便，還能大大減輕生理痛苦，增加安全性，也更像是一種食品。因此，對活性肽-N口服制劑的抗衰老作用進行探索十分必要。

肽類物質直接口服在胃腸道內易被各種消化酶降解、失活導致生物利用度變差[15]。而W/O/W型復乳具有多重乳膜結構，可提高多肽類藥物的穩(wěn)定性，在避免其在胃腸道中因分解而失活的同時，還可以促進腸上皮細胞對多肽類藥物的透過性?；钚噪?N已經是活性依賴神經保護因子上的最小活性片段，Pappenheimer等[16]已經證明八肽可以直接通過腸道上皮細胞，其吸收機制可能與旁路轉運吸收途徑有關。故本實驗首先將活性肽-N制備成W/O/W型復乳，再將其作用于D-半乳糖致衰老小鼠模型，探索該種因子的抗衰老作用，以期為下一步新型抗衰老食品的研發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

12 周齡SPF級昆明小鼠，雌雄各半，體質量（33±3） g（實驗動物生產許可證號：SCXK（桂）2014-002），購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，飼養(yǎng)溫度控制在（24±2） ℃，相對濕度（60±10）%，12 h晝夜交替，自由飲食飲水。所有小鼠均統(tǒng)一飼喂小鼠維持飼料，飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，飼料符合GB 13078—2001《飼料衛(wèi)生標準》和GB 14924.3—2010《實驗動物配合飼料營養(yǎng)成分》。

W/O/W型活性肽-N復乳由廣西大學食品與科學工程實驗室自制；活性肽-N（純度＞95%）由某公司合成，氨基酸序列Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln，分子質量824.9 Da。

D-半乳糖 美國Sigma公司；吡拉西坦片（一種促思維記憶藥） 湖南迪諾制藥有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、乙酰膽堿酯酶（acetyl cholinesterase，AChE）試劑盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Morris DMS-2型水迷宮 中國醫(yī)學科學院；曠場測試系統(tǒng) 西班牙Panlab公司；Pico17低溫冷凍離心機美國Thermo公司；JY92-IIN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；METASH UV-5200紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；TG16W微量高速離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；JRA-2數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋 金壇市科杰儀器廠；WGL-125B電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 W/O/W型活性肽-N復乳的制備

參照李麗娜[17]的兩步法制備，并稍作改進。首先將油相（V（液體石蠟）∶V（司盤-80）=1∶1）和內水相（活性肽-N溶于0.5 g/100 mL海藻酸鈉）分別在水浴中加熱至40 ℃，邊攪拌邊往油相中緩緩加入內水相，經磁力攪拌30 min得W/O初乳。進一步將外水相（1.0 g/100 mL殼聚糖、5.0 g/100 mL吐溫-80和0.2 g/100 mL CaCl2溶液）同樣在水浴中加熱至40 ℃，邊攪拌邊將W/O初乳緩緩加入外水相中，經磁力攪拌30 min后，再用超聲波細胞破碎機超聲30 min，即得W/O/W型活性肽-N復乳。

1.3.2 動物分組及處理

72 只小鼠隨機分為6 組，每組12 只，雌雄各半，分為年輕對照組、衰老模型組、吡拉西坦組、活性肽-N復乳低、中、高劑量組。除年輕對照組外，其他5 組每日上午頸背部皮下注射200 mg/kg D-半乳糖（以體質量計，下同），年輕對照組每日注射等體積的生理鹽水。造模同時各組開始給予相應處理，每天在注射結束1 h之后進行灌胃，參考李軍等[18]的方法進行，以吡拉西坦組作為陽性對照組，灌胃劑量為600 mg/（kg·d），活性肽-N復乳低、中、高劑量組灌胃劑量分別為2.5、25.0、125.0 μg/（kg·d），年輕對照組和衰老模型組每日灌胃等體積的蒸餾水，連續(xù)給藥9 周。每周稱量體質量1 次。

1.3.3 曠場實驗

曠場實驗于造模的第9周開始進行。使用一開口的黑色塑膠制測試箱（100 cm×100 cm×30 cm），箱底被等分成25 個正方形的方格（20 cm×20 cm），小鼠先被放進測試箱中適應環(huán)境3 min后開始實驗，每只小鼠進行1 次測試。參照文獻[19]，將小鼠放入曠場行為測試箱的中心位置，讓其在曠場中自由探索環(huán)境5 min，記錄其在5 min內跨越的方格總數(shù)和后肢直立數(shù)，每一次實驗之后，用75%乙醇及時清理干凈曠場測試箱中糞便及尿液，以避免之前小鼠所留下的氣味對后續(xù)實驗造成影響。

1.3.4 Morris水迷宮實驗

曠場實驗結束后第二天開始進行Morris水迷宮實驗，方法參照文獻[20]進行。實驗連續(xù)進行6 d，前5 d為定位航行實驗，第6天為空間探索實驗。定位航行實驗方法：每天訓練4 次，每次將小鼠分別從不同的入水點面向池壁放入水中，同時開始計時，記錄小鼠從入水到找到水下隱藏平臺所需的時間，即逃避潛伏期。如果60 s內未成功找到平臺，則將小鼠引導到平臺上，并讓其在臺上站立10 s，此時逃避潛伏期記為60 s。空間探索實驗方法：第6天撤去水中平臺，固定水池中任一象限的一個位置作為入水點，讓小鼠在池內游泳60 s找尋平臺，并記錄小鼠60 s內的逃避潛伏期、穿越原平臺所在位置總次數(shù)、在原平臺所在象限的游泳時間及游泳速度。

1.3.5 標本采集處理與生化指標的檢測

行為學實驗之后，所有小鼠禁食、禁水12 h，然后稱量體質量，摘除眼球取血，所采集血液于4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液分裝，凍存于-80 ℃。

取血后，小鼠迅速脫頸處死，冰上取出腦組織，迅速凍存于-80 ℃。檢測當日取出腦組織，稱量質量，加入其質量9 倍體積的生理鹽水，使用玻璃勻漿器在冰水浴中進行勻漿，獲得10%腦組織勻漿，將勻漿液于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取勻漿上清液進行檢測。

按照試劑盒說明書，分別對血清中的GSH-Px活力、MDA含量、腦組織中的AChE活力和蛋白含量進行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，結果表示為±s，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 活性肽-N復乳對小鼠體質量的影響

表1 活性肽-N復乳對D-半乳糖致衰老小鼠體質量的影響（n＝12）Table 1 Effect of active peptide-N multiple emulsion on body weight of D-galactose-induced aging mice (n= 12)

小鼠體質量的增長情況是反映其生長發(fā)育狀況的重要指標之一[21]。由表1可知，各組小鼠之間的初始體質量并無明顯差別（P＞0.05）。而灌胃活性肽-N復乳后，小鼠的體質量分析結果表明，長期注射D-半乳糖對小鼠的體質量增長無顯著作用。與年輕對照組和衰老模型組相比，活性肽-N復乳各劑量組的體質量差別不顯著（P＞0.05）。Magen等[22]的研究證明滴鼻給予每只Thy1-aSyn小鼠15 μg活性肽-N不會對它們的體質量增長產生不良影響。本研究發(fā)現(xiàn)活性肽-N復乳在2.5～125.0 μg/（kg·d）的灌胃劑量范圍內也未對D-半乳糖致衰老小鼠的體質量增長產生影響，說明活性肽-N復乳對D-半乳糖致衰老小鼠的生長發(fā)育無不良影響。

2.2 曠場實驗結果分析

表2 活性肽-N復乳對D-半乳糖致衰老小鼠運動探究能力的影響（n＝12）Table 2 Effect of active peptide-N multiple emulsion on exploration ability D-galactose-induced aging mice (n= 12)

曠場實驗主要是檢測小鼠在新環(huán)境中的自主行為和運動探究能力[23]。由表2可知，衰老模型組與年輕對照組相比，小鼠穿越方格數(shù)和后肢直立次數(shù)均極顯著減少（P＜0.01），說明D-半乳糖致衰老小鼠模型的運動探究能力受到嚴重損害。與衰老模型組相比，吡拉西坦組、活性肽-N復乳中、高劑量組穿越方格數(shù)均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），說明活性肽-N復乳能減輕致衰老因子的傷害，促進衰老小鼠的自主運動能力。同時，各實驗組的后肢直立次數(shù)較衰老模型組均有所增加，其中活性肽-N復乳中、高劑量組與衰老模型組的差異達到顯著水平（P＜0.05，P＜0.01），說明活性肽-N復乳能夠在一定程度上提高衰老小鼠的探究能力。Merenlenger-Wagner等[10]的研究表明鼻飼活性肽-N能降低精神分裂癥小鼠的自主活動，具有抗焦慮作用。目前尚鮮見關于活性肽-N復乳對衰老模型小鼠運動能力的影響方面的研究，本研究發(fā)現(xiàn)活性肽-N復乳能顯著抵消甚至逆轉衰老所致實驗小鼠運動探究能力的下降。

2.3 Morris水迷宮結果分析

2.3.1 定位航行實驗

表3 活性肽-N復乳對D-半乳糖衰老小鼠在水迷宮中逃避潛伏期的影響（n＝12）Table 3 Effect of active peptide-N multiple emulsion on escape latency of D-galactose-induced aging mice in water maze test (n= 12)

Morris水迷宮實驗主要是通過定位航行實驗和空間探索實驗來評估小鼠的空間學習記憶能力[24]。

表3反映了在5 d的定位航行實驗中各組小鼠逃避潛伏期的變化情況，隨著訓練時間的延長，各組小鼠的逃避潛伏期均有下降，其中年輕對照組總體表現(xiàn)最佳；從第2天開始，衰老模型組小鼠的逃避潛伏期極顯著長于年輕對照組（P＜0.01），說明衰老模型組小鼠學習記憶能力衰退嚴重。而吡拉西坦組和活性肽-N復乳中、高劑量組與衰老模型組相比，其逃避潛伏期從第2天到第5天均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），特別在訓練的第3天，活性肽-N復乳中、高劑量組的表現(xiàn)甚至略微優(yōu)于年輕對照組。Alcalay等[25]的研究結果表明老年小鼠經過長期滴鼻活性肽-N，其逃避潛伏期在實驗的最后2 d才表現(xiàn)出顯著的下降，而本研究中活性肽-N復乳中劑量組和高劑量組的逃避潛伏期均顯著低于衰老模型組（P＜0.05，P＜0.01），對學習記憶損傷的修復效果更優(yōu)，說明中劑量組和高劑量組的活性肽-N復乳對D-半乳糖致衰老小鼠的空間學習記憶力減退具有良好的逆轉能力。

2.3.2 空間探索實驗

圖1 活性肽-N復乳對D-半乳糖衰老小鼠在水迷宮中逃避潛伏期（A）、穿越平臺次數(shù)（B）、目標象限停留時間（C）、游泳速度（D）的影響（n＝12）Fig. 1 Effect of active peptide-N multiple emulsion on escape latency (A),the number of times crossing the platform (B), time spent in target quadrant (C) and swimming speed (D) of D-galactose-induced aging mice in water maze test (n = 12)

由圖1可以看出，各組小鼠游泳速度無明顯區(qū)別。衰老模型組小鼠的逃避潛伏期極顯著長于年輕對照組（P＜0.01），穿越平臺次數(shù)和目標象限停留時間較年輕對照組均極顯著減少（P＜0.01）。而吡拉西坦組、活性肽-N復乳中、高劑量組與衰老模型組相比，其逃避潛伏期極顯著下降（P＜0.01），活性肽-N低劑量組也有一定程度的下降，但差異不顯著（P＞0.05）。同時吡拉西坦組、活性肽-N復乳中、高劑量組的穿越平臺次數(shù)和目標象限停留時間較衰老模型組均顯著增加和延長（P＜0.05，P＜0.01），且與年輕對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

在水迷宮實驗中，各組小鼠的游泳速度無明顯差別，而逃避潛伏期、目標象限停留時間和穿越平臺次數(shù)卻出現(xiàn)了顯著的組間差異，表明長期注射大劑量的D-半乳糖會損害小鼠的空間學習記憶能力，而服用活性肽-N復乳后能有效改善這種損傷，且高劑量組的作用效果與吡拉西坦組差異不明顯，這說明活性肽-N復乳對減緩衰老所致學習記憶衰退具有很好的效果。有研究表明滴鼻給予神經保護肽活性肽-N能緩解缺氧致局部缺血新生大鼠模型的學習記憶損傷，具有神經保護作用[26]。但是目前尚鮮見有關活性肽-N對D-半乳糖致衰老小鼠模型學習記憶作用效果的評價，本研究發(fā)現(xiàn)了活性肽-N復乳能減緩D-半乳糖所致的學習記憶障礙。

2.4 活性肽-N復乳對小鼠血清中GSH-Px活力、MDA含量的影響

表4 活性肽-N復乳對D-半乳糖衰老小鼠血清中GSH-Px活力、MDA含量的影響（n＝8）Table 4 Effect of active peptide-N multiple emulsion on serum GSH-Px activity and MDA level in D-galactose-induced aging mice (n= 8)

機體氧化應激程度的加劇是衰老發(fā)生的重要原因之一，而氧化應激的程度和氧化與抗氧化體系的平衡緊密相關[27]。GSH-Px是體內重要的一類自由基清除劑和抗氧化酶，能有效緩解機體內的氧化損傷，它在H2O2的分解代謝和內源性代謝的過氧化物和氫過氧化物的解毒方面起著關鍵作用[28]，其活力大小是衡量機體抗氧化能力的重要指標。由表4可知，與年輕對照組相比，衰老模型組小鼠血清中GSH-Px活力降低30.12%（P＜0.01），說明D-半乳糖致衰老模型的抗氧化能力受到損傷。而與衰老模型組相比，吡拉西坦組和活性肽-N復乳各劑量組血清GSH-Px活力都有所增加，特別是吡拉西坦組與活性肽-N復乳高劑量組的GSH-Px活力的增加幅度分別達到了31.33%和28.38%（P＜0.05）。因此，本研究結果表明攝入一定量的活性肽-N復乳能有效提高機體內GSH-Px活力，幫助機體減緩氧化損傷，尤以高劑量組效果最佳，效果接近吡拉西坦組。

MDA是體內脂質過氧化產物，體內產生的自由基會攻擊脂質，導致脂質過氧化，從而生成MDA，MDA含量的多少可直接反映機體脂質過氧化水平[29]。因此進一步探究活性肽-N復乳對D-半乳糖致衰老小鼠體內MDA含量變化的影響。由表4可知，衰老模型組血清中MDA含量與年輕對照組相比升高了52.73%（P＜0.01），進一步表明衰老模型造模成功。對比衰老模型組，吡拉西坦組和活性肽-N復乳各劑量組的MDA含量均有所降低，特別是吡拉西坦組和活性肽-N復乳高劑量組的MDA含量顯著低于衰老模型組，其下降幅度分別為42.50%和26.19%（P＜0.05，P＜0.01）。因而，本研究結果進一步說明了活性肽-N復乳能提高機體的抗氧化能力。Sethy等[30]的研究表明滴鼻給予活性肽-N對低壓缺氧大鼠模型及缺血性新生大鼠模型造成的氧化損傷具有保護作用，而本研究表明活性肽-N復乳能緩解D-半乳糖致衰老模型所造成的氧化損傷，說明活性肽-N復乳具有良好的抗氧化能力。同時，相較于其他研究發(fā)現(xiàn)的抗衰老多肽對氧化應激的保護作用所用劑量而言[5]，本研究所用的活性肽-N復乳在相當?shù)偷膭┝肯拢湍軐ρ趸瘬p傷起到較好的保護作用。

2.5 活性肽-N復乳對小鼠腦組織中AChE活力的影響

表5 活性肽-N復乳對D-半乳糖衰老小鼠腦組織中AChE活力的影響（n＝8）Table 5 Effect of active peptide-N multiple emulsion on brain AChE activity of D-galactose-induced aging mice (n= 8)

由表5可知，與年輕對照組相比，衰老模型組的AChE活力極顯著上升（P＜0.01）。與衰老模型組相比，各實驗組AChE活力均有所降低，特別是吡拉西坦組、活性肽-N復乳高劑量組的AChE活性顯著降低，兩組的下降幅度均為23.26%（P＜0.05），說明活性肽-N復乳高劑量組與吡拉西坦組對抑制衰老小鼠腦組織內AChE活力的效果相當。雖然活性肽-N復乳低、中劑量組的AChE活力與衰老模型組相比，差異未達顯著性（P＞0.05），但其AChE活力的下降幅度也分別達到了13.95%、16.28%。

中樞膽堿能系統(tǒng)與學習記憶密切相關，其功能的紊亂往往被認為與學習記憶功能的衰退有著直接聯(lián)系[31]。AChE作為中樞膽堿能系統(tǒng)的重要代表物之一，其功能是分解與學習記憶相關的重要的神經遞質乙酰膽堿（acetylcholine，ACh），通過檢測其活力的高低可以間接推測出腦內ACh含量的高低，同時它也是膽堿能神經系統(tǒng)活性的間接指標[32]，因此D-半乳糖致衰老小鼠模型腦組織的中樞膽堿能系統(tǒng)功能下降，主要表現(xiàn)在AChE活力的上升，ACh合成、利用障礙，進而影響小鼠空間學習記憶能力。李婧煒[33]研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射TGN-NP/NAP對阿爾茲海默病小鼠模型的海馬和皮層AChE活力均有明顯的抑制作用，而本研究則發(fā)現(xiàn)，給非病態(tài)小鼠灌胃高劑量活性肽-N復乳后，也能顯著抑制D-半乳糖致衰老小鼠全腦中的AChE活力，表明活性肽-N復乳對衰老小鼠中樞膽堿能系統(tǒng)有一定的保護作用。此外，大量研究表明提高中樞膽堿能系統(tǒng)的功能是改善D-半乳糖致衰老模型小鼠學習記憶能力的基礎[34]。因此，在本研究中，活性肽-N復乳可能是通過對中樞膽堿能系統(tǒng)的保護作用來改善衰老模型小鼠學習記憶損傷的。

綜上所述，本研究在固定其他飲食成分的情況下添加活性肽-N復乳，檢測其抗衰老活性，以促思維記憶藥吡拉西坦作為陽性對照，發(fā)現(xiàn)活性肽-N復乳高劑量組（125.0 μg/（kg·d））和吡拉西坦組（600 mg/（kg·d））均能明顯提高D-半乳糖致衰老小鼠的學習記憶、運動探究及抗氧化能力（P＜0.05，P＜0.01），且兩者的作用效果均相差不大（P＞0.05），但吡拉西坦所用劑量是活性肽-N復乳所用劑量的4 800 倍，提示活性肽-N復乳在極低的劑量下就能具備良好的延緩衰老的作用。Sokolowska等[12]的研究表明活性肽-N對小鼠興奮毒性腦白質損傷的保護作用具有劑量-效應關系。而在本研究中，曠場實驗和Morris水迷宮實驗結果顯示，活性肽-N復乳3 個劑量組的運動探究能力和學習記憶能力均得到了一定程度的提高，但中、高劑量組表現(xiàn)更佳，而在對血清中GSH-Px活力、MDA含量及腦組織中AChE活力檢測時，結果也表明是活性肽-N復乳高劑量組的效果最好，說明活性肽-N復乳對衰老的延緩作用同樣具有劑量-效應關系。

3 結 論

本研究利用D-半乳糖致衰老模型對活性肽-N復乳的抗衰老作用進行評價，發(fā)現(xiàn)活性肽-N復乳對小鼠生長發(fā)育無不良影響，中劑量和高劑量的活性肽-N復乳能明顯提高D-半乳糖致衰老小鼠的運動探究能力，改善其學習記憶能力（P＜0.05，P＜0.01），高劑量的活性肽-N復乳能顯著緩解機體的氧化應激水平（降低血清中MDA含量，提高GSH-Px活力）（P＜0.05），降低腦組織的AChE活力（P＜0.05）。以上結果表明活性肽-N口服制劑對D-半乳糖致衰老小鼠具有明顯的抗衰老作用，同時說明活性肽-N復乳在新型抗衰老食品的開發(fā)方面具有良好的應用前景。

[1] GOGELE M, PATTARO C, FUCHSBERGER C, et al. Heritability analysis of life span in a semi-isolated population followed across four centuries reveals the presence of pleiotropy between life span and reproduction[J]. The Journals of Gerontology, 2010, 66(1): 26-37.DOI:10.1093/gerona/glq163.

[2] DAVINELLI S, WILLCOX D C, SCAPAGNINI G. Extending healthy ageing: nutrient sensitive pathway and centenarian population[J].Immunity & Ageing, 2012, 9(1): 1-7. DOI:10.1186/1742-4933-9-9.

[3] KORHONEN H, PIHLANTO A. Bioactive peptides: production and functionality[J]. International Dairy Journal, 2006, 16(9): 945-960.DOI:10.1016/j.idairyj.2005.10.015.

[4] KORHONEN H. Milk-derived bioactive peptides: from science to applications[J]. Journal of Functional Foods, 2009, 1(2): 177-187.DOI:10.1016/j.jff.2009.01.007.

[5] 王常青, 任海偉, 王海鳳, 等. 黑豆多肽對D-半乳糖衰老小鼠抗氧化能力的影響[J]. 食品科學, 2010, 31(3): 262-266.

[6] ROJAS-RONQUILO R, CRUZ-GUERRERO A, FLORES-NAJERA A,et al. Antithrombotic and angiotensin-converting enzyme inhibitory properties of peptides released from bovine casein by Lactobacillus casei Shirota[J]. International Dairy Journal, 2012, 26(2): 147-154.DOI:10.1016/j.idairyj.2012.05.002.

[7] JAVITT D C, BUCHANAN R W, KEEFE R S E, et al. Effect of the neuroprotective peptide davunetide (AL-108) on cognition and functional capacity in schizophrenia[J]. Schizophrenia Research, 2012,136(1/2/3): 25-31. DOI:10.1016/j.schres.2011.11.001.

[8] BASSAN M, ZAMOSTIANO R, DAVIDSON A, et al. Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activitydependent neuroprotective peptide[J]. Journal of Neurochemistry,1999, 72(3): 1283-1293. DOI:10.1046/j.1471-4159.1999.0721283.x.

[9] GOZES I, BRENNEMAN D E. A new concept in the pharmacology of neuroprotection[J]. Journal of Molecular Neuroscience, 2000, 14(1/2):61-68. DOI:10.1385/JMN:14:1-2:01.

[10] MERENLENDER-WAGNER A, PIKMAN R, GILADI E, et al. NAP(davunetide) enhances cognitive behavior in the STOP heterozygous mouse: a microtubule-def i cient model of schizophrenia[J]. Peptides,2010, 31(7): 1368-1373. DOI:10.1016/j.peptides.2010.04.011.

[11] JOUROUKHIN Y, OSTRITSKY R, ASSAF Y, et al. NAP(davunetide) modifies disease progression in a mouse model of severe neurodegeneration: protection against impairments in axonal transport[J]. Neurobiology of Disease, 2013, 56: 79-94. DOI:10.1016/j.nbd.2013.04.012.

[12] SOKOLOWSKA P, PASSEMARD S, MOK A, et al. Neuroprotective effects of NAP against excitotoxic brain damage in the newborn mice:implications for cerebral palsy[J]. Neuroscience, 2011, 173: 156-168.DOI:10.1016/j.neuroscience.2010.10.074.

[13] LEKER R R, TEICHNER A, GRIGORIADIS N, et al. NAP, a femtomolar-acting peptide, protects the brain against ischemic injury by reducing apoptotic death[J]. Stroke, 2002, 33(4): 1085-1092.DOI:10.1161/01.STR.0000014207.05597.D7.

[14] HEIMESAAT M M, FISCHER A, KUHL A A, et al. Antiinf l ammatory properties of NAP in acute toxoplasma gondii-induced ileitis in mice[J]. European Journal of Microbiology and Immunology,2015, 5(3): 210-220. DOI:10.1556/1886.2015.00025.

[15] LEE H J. Protein drug oral delivery: the recent progress[J].Archives Pharmacal Research, 2002, 25(5): 572-584. DOI:10.1007/BF02976925.

[16] PAPPENHEIMER J R, DAHL C E, KAMOVSKY M L, et al.Intestinal absorption and excretion of octapeptides composed of D amino acids[J]. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, 1994, 91(5): 1942-1945. DOI:10.1073/pnas.91.5.1942.

[17] 李麗娜. 擔載胰島素的凝膠新型W/O/W多重乳液的制備[D]. 大連:大連理工大學, 2006: 16-43.

[18] 李軍, 林麗文, 辛勤, 等. 綠茶多酚抗衰老作用研究[J]. 食品與藥品,2013, 15(2): 106-109.

[19] LIN X, ZHANG S, HUANG R, et al. Protective effect of madecassoside against cognitive impairment induced by D-galactose in mice[J]. Pharmacology Biochemistry and Behavior, 2014, 124: 434-442. DOI:10.1016/j.pbb.2014.07.014.

[20] ZHANG X L, JIANG B, LI Z B, et al. Catalpol ameliorates cognition def i cits and attenuates oxidative damage in the brain of senescent mice induced by D-galactose[J]. Pharmacology Biochemistry and Behavior,2007, 88(1): 64-72. DOI:10.1016/j.pbb.2007.07.004.

[21] 劉貴珊, 楊博, 張澤生, 等. 白藜蘆醇對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力和腦組織抗氧化能力的影響[J]. 食品科學, 2014, 35(5): 204-207. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201405040.

[22] MAGEN I, OSTRITSKY R, RICHTER F, et al. Intranasal NAP(davunetide) decreases tau hyperphosphorylation and moderately improves behavioral deficits in mice overexpressing α-synuclein[J].Pharmacology Research & Perspectives, 2014, 2(5): 1-21.DOI:10.1002/prp2.65.

[23] 常艷芬, 宮文霞, 鄭艷紅, 等. 黃芩醇提物干預D-半乳糖致衰老大鼠的尿液代謝組學研究[J]. 藥學學報, 2016, 51(1): 86-92.DOI:10.16438/j.0513-4870.2015-0597.

[24] SOUZA L C, ANTUNES M S, FILHO C B, et al. Flavonoid chrysin prevents age-related cognitive decline via attenuation of oxidative stress and modulation of BDNF levels in aged mouse brain[J].Pharmacology Biochemistry and Behavior, 2015, 134: 22-30.DOI:10.1016/j.pbb.2015.04.010.

[25] ALCALAY R N, GILADI E, PICK C G, et al. Intranasal administration of NAP, a neuroprotective peptide, decreases anxietylike behavior in aging mice in the elevated plus maze[J]. Neuroscience Letters, 2004, 361(1/2/3): 128-131. DOI:10.1016/j.neulet.2003.12.005.

[26] GREGGIO S, DE PAULA S, DE OLIVEIRA I M, et al. NAP prevents acute cerebral oxidative stress and protects against longterm brain injury and cognitive impairment in a model of neonatal hypoxia-ischemia[J]. Neurobiology of Disease, 2011, 44(1): 152-159.DOI:10.1016/j.nbd.2011.06.018.

[27] 徐成, 盧虹玉, 章超樺, 等. 牡蠣酶解提取物對D-半乳糖致衰小鼠學習記憶的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(2): 347-351.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.062.

[28] PENG X Y, KONG B H, YU H Y, et al. Protective effect of whey protein hydrolysates against oxidative stress in D-galactose-induced ageing rats[J]. International Dairy Journal, 2014, 34(1): 80-85.DOI:10.1016/j.idairyj.2013.08.004.

[29] 萬全, 王艷梅, 林琳, 等. 黃緣盒龜多肽對D-半乳糖致亞急性衰老小鼠抗氧化能力的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2013, 29(9): 2075-2080.DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2013.09.004.

[30] SETHY N K, SHARMA N K, DAS M, et al. Protein prof i ling reveals antioxidant and signaling activities of NAP (davunetide) in rodent hippocampus exposed to hypobaric hypoxia[J]. Journal of Molecular Neuroscience, 2014, 54(3): 414-429. DOI:10.1007/s12031-014-0381-9.

[31] ZHANG X L, JIN C Z, LI Y C, et al. Catalpol improves cholinergic function and reduces inflammatory cytokines in the senescent mice induced by D-galactose[J]. Food and Chemical Toxicology, 2013, 58:50-55. DOI:10.1016/j.fct.2013.04.006.

[32] RUAN Q W, HU X N, AO H F, et al. The neurovascular protective effects of huperzine A on D-galactose-induced inf l ammatory damage in the rat hippocampus[J]. Gerontology, 2014, 60(5): 424-439.DOI:10.1159/000358235.

[33] 李婧煒. 噬菌體展示技術篩選腦靶向功能肽及其修飾納米粒的腦內遞藥研究[D]. 上海: 復旦大學, 2012: 143-145.

[34] QU Z, YANG H G, ZHANG J Z, et al. Cerebralcare granule?, a Chinese herb compound preparation, attenuates D-galactose induced memory impairment in mice[J]. Neurochemical Research, 2016, 41(9):2199-2214. DOI:10.1007/s11064-016-1934-9.

Protective Effect of Active Peptide-N on D-Galactose-Induced Aging in Mice

CHEN Yu1, LIU Hongji1,2, YOU Qianqian1, YUAN Jinglin1, SONG Qi1, HAO Dan1, LIU Dong1, LAN Haijing1, LI Quanyang1,*
(1. College of Light Industry and Food Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China;2. JE Flow Tech (Shanghai) Co. Ltd., Shanghai 201404, China)

Herein, we evaluated the effect of active peptide-N as a new anti-aging agent on aging model mice. For this purpose, an aging model was established by subcutaneously injecting mice with D-galactose (200 mg/(kg·d)) once daily for nine weeks. Thereafter, the mice was separately orally administered with multiple emulsion containing active peptide-N at doses of 2.5, 25.0 and 125.0 μg/ (kg·d). The open field and the Morris water maze test were used to evaluate the locomotor activity and learning and memory ability of mice. Furthermore, glutathione peroxidase (GSH-Px) activity and malondialdehyde (MDA) content in the serum, and acetyl cholinesterase (AChE) activity in the brain tissue of mice were measured. The results showed that active peptide-N multiple emulsion could signif i cantly improve the locomotor activity and learning and memory ability of D-galactose-induced aging mice. The activity of serum GSH-Px was improved by 28.38%(P ＜ 0.05), the concentration of serum MDA was decreased by 26.19% (P ＜ 0.05), and the brain AChE activity was increased by 23.26% in the treated groups (P ＜ 0.05) compared with the aging model group. These results demonstrate that active peptide-N multiple emulsion has an obvious anti-aging effect in D-galactose-induced aging mice.

active peptide-N multiple emulsion; D-galactose; anti-aging; learning and memory

10.7506/spkx1002-6630-201801027

R151.4

A

1002-6630（2018）01-0178-07

陳燏, 劉洪吉, 尤倩倩, 等. 活性肽-N對D-半乳糖致衰老小鼠的作用效果[J]. 食品科學, 2018, 39(1): 178-184.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801027. http://www.spkx.net.cn

CHEN Yu, LIU Hongji, YOU Qianqian, et al. Protective effect of active peptide-N on D-galactose-induced aging in mice[J]. Food Science, 2018, 39(1): 178-184. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201801027.http://www.spkx.net.cn

2016-10-12

國家自然科學基金面上項目（31371762）

陳燏（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)與健康。E-mail：124166715@qq.com

*通信作者簡介：李全陽（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與功能性食品。E-mail：liquanyang@gxu.edu.cn