黃新新 何 苗 何宇平 楊 娟郭德華 蔡 強(qiáng)吳頔

（1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局 上海 200135；2.清華大學(xué)；3.浙江清華長三角研究院）

1 前言

近些年隨著水環(huán)境狀況的惡化，我國城市的飲用水水源普遍存在有機(jī)物污染。污染物進(jìn)入環(huán)境及食品后，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)在各級(jí)生物學(xué)水平上產(chǎn)生不良影響[1]。由于水中有機(jī)化合物常與混合方式聯(lián)合作用于人體，其遺傳毒性與致癌性之間存在一定的相關(guān)性，因此在目前水資源極其短缺的情況下，對(duì)水中有機(jī)污染物進(jìn)行調(diào)查并對(duì)其遺傳毒性的研究已迫在眉睫，而利用生物效應(yīng)的原理檢測(cè)環(huán)境污染物的毒性效應(yīng)對(duì)水環(huán)境及食品質(zhì)量的評(píng)價(jià)具有重要的價(jià)值。

魚類、水蚤類、藻類等生物毒性測(cè)試方法，檢測(cè)周期長，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)時(shí)間都在24 h以上，不適用于毒性的快速檢測(cè)和評(píng)估。而微生物法，尤其是發(fā)光細(xì)菌法，因其快速、靈敏、簡(jiǎn)便、廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)，受到越來越多的關(guān)注。

本研究基于基因工程技術(shù)，以含有發(fā)光基因LuxC、LuxD、LuxA、LuxB、LuxE 為 基 礎(chǔ) 的 PUCD615構(gòu)建誘導(dǎo)型重組工程菌。Lux作為一種新的報(bào)告基因，具有快速、靈敏以及簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。誘導(dǎo)型重組菌的特色表現(xiàn)為對(duì)特定化合物或誘導(dǎo)物的存在作出響應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)單一化合物或一類化合物的特異靈敏檢測(cè)。

N′-甲基-N′-硝基亞硝基胍（MNNG）是一種在環(huán)境中廣泛存在的化學(xué)誘變劑和致癌劑，屬于可直接與DNA作用的遺傳毒物，通過直接靶定DNA而誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生遺傳毒性應(yīng)激；絲裂霉素C（MMC）則可使細(xì)胞的DNA解聚，同時(shí)阻礙DNA的復(fù)制。本研究探討構(gòu)建的兩種對(duì)DNA損傷污染物敏感的誘導(dǎo)型重組發(fā)光菌THSH1711、THSH1712（含pUCD-uvrA、pUCD-alkA載體），對(duì)MNNG及 MMC有特異響應(yīng)作用。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

質(zhì)粒pUCD615[2]（含有無啟動(dòng)子的luxCDABE全基因盒，Amp+、Kan+）：美國 Tennessee 大學(xué) Sayler教授惠贈(zèng)；E coli W3110[3]、E.coli DH5α：本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌RFM443[4]：美國DuPont研究與發(fā)展實(shí)驗(yàn)中心Saari教授惠贈(zèng)；EcoR I、BamH I限制性內(nèi)切酶：購自寶生物工程（大連）公司；MMC、MNNG：購自Roche公司；氨芐青霉素、卡那霉素及CaCl2：購自上海生工生物工程有限公司。

2.1.2 儀器

PCR儀：Bio-Rad公司；水質(zhì)毒性快速檢測(cè)儀：型號(hào)BHP9511，北京濱松光子技術(shù)股份有限公司；高速冷凍離心機(jī)、恒溫金屬?。旱聡鳨ppendorf公司。

2.2 方法

2.2.1 pUCD-uvrA、pUCD-alkA重組發(fā)光菌載體構(gòu)建

取1.5 mL E coli W3110菌液，用DNA抽提試劑盒提取細(xì)菌總DNA。以此DNA為模板，擴(kuò)增uvrA、alkA基因。將測(cè)序鑒定正確的uvrA、alkA片段由 EcoR I、BamH I酶切，與同樣經(jīng)雙酶切的PUCD615連接，電轉(zhuǎn)化入JM109菌株。挑取克隆，酶切及測(cè)序鑒定插入片段的正確性[5]。

2.2.2 THSH1711、THSH1712重組發(fā)光菌構(gòu)建

2.2.2.1 RFM443菌種復(fù)蘇

用無菌鉑絲蘸取-20℃甘油肉湯保存的RFM443大腸桿菌接種于LB肉湯，37℃振蕩培養(yǎng)過夜后取少量菌液在LB瓊脂平板上分區(qū)劃線；倒扣平皿37℃培養(yǎng)過夜，形成單個(gè)菌落。

2.2.2.2 制備RFM443感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化質(zhì)粒

挑取上述RFM443單菌落轉(zhuǎn)移到2 mL LB培養(yǎng)液中，37℃搖菌培養(yǎng)過夜；按常規(guī)化學(xué)法用CaCl2制作感受態(tài)細(xì)胞；轉(zhuǎn)化時(shí)各加1 μL PUCD-uvrA、PUCD-alkA質(zhì)粒，取100 μL菌液均勻涂布于氨芐青霉素和卡那霉素雙抗性的LB培養(yǎng)皿表面；轉(zhuǎn)化入PUCD-uvrA、PUCD-alkA質(zhì)粒的重組發(fā)光菌分別命名為 THSH1711，THSH1712。

2.2.3 毒性測(cè)試

平板挑取單克隆THSH1711、THSH1712菌落，加入 LB 肉湯培養(yǎng)基（Amp+、Kan+，25 μg/mL），26℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，取1 mL培養(yǎng)液加入1 mL新鮮肉湯，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2～3 h，加入相應(yīng)濃度梯度的污染物待測(cè)。

將水質(zhì)毒性快速檢測(cè)儀BHP9511預(yù)熱30 min，取1 mL待測(cè)液加入測(cè)試管中，依次放入儀器內(nèi)，第一管為不加毒性污染物的重組發(fā)光菌對(duì)照；每隔一段時(shí)間檢測(cè)菌液的發(fā)光強(qiáng)度，檢測(cè)溫度在26℃左右；保存紀(jì)錄，輸出數(shù)據(jù)，整理結(jié)果。樣品讀出的結(jié)果為相對(duì)于對(duì)照的百分?jǐn)?shù)。

3 結(jié)果

3.1 PUCD615載體及uvrA、alkA PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

PUCD615質(zhì)粒由EcoR I、BamH I雙酶切后出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，表明已經(jīng)切開。

uvrA、alkA PCR產(chǎn)物擴(kuò)增片段經(jīng) EcoR I、BamH I雙酶切后兩端出現(xiàn)平直現(xiàn)象。

3.2 pUCD-uvrA、pUCD-alkA重組發(fā)光菌載體測(cè)序結(jié)果

pUCD-uvrA、pUCD-alkA重組載體測(cè)序結(jié)果與GenBank中的uvrA、alkA 序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，同源性為100%，表明擴(kuò)增序列正確。經(jīng)比對(duì)，序列的上下游正確出現(xiàn)相關(guān)的酶切位點(diǎn)，表明uvrA、alkA基因已正確地插入到pUCD615的多克隆位點(diǎn)，方向和讀碼框正確，重組發(fā)光菌載體構(gòu)建成功。

3.3 THSH1711，THSH1712重組發(fā)光菌對(duì)毒性污染物的響應(yīng)作用

3.3.1 THSH1711、THSH1712重組發(fā)光菌對(duì)MNNG的響應(yīng)作用

THSH1711重組發(fā)光菌對(duì)MNNG的響應(yīng)作用結(jié)果見圖1。

圖1 THSH1711重組發(fā)光菌對(duì)MNNG的響應(yīng)作用

圖1顯示，除了在0.1 mg/L濃度時(shí)THSH1711菌株對(duì)MNNG的響應(yīng)不明顯外，其余隨著時(shí)間的延長及濃度的遞增，逐漸上升。MNNG在5～50 mg/L范圍時(shí)，THSH1711菌株對(duì)其響應(yīng)在5.5 h時(shí)達(dá)到高峰，以后趨于平穩(wěn)或逐漸下降；MNNG超過50 mg/L后，隨著濃度上升THSH1711菌株對(duì)其響應(yīng)則會(huì)開始下降，但依舊隨著作用時(shí)間的延長響應(yīng)值逐步上升，直至22 h響應(yīng)值才明顯下降（結(jié)果未顯示）。

THSH1712重組發(fā)光菌對(duì)MNNG的響應(yīng)作用結(jié)果見圖2。

圖2 THSH1712重組發(fā)光菌對(duì)MNNG的響應(yīng)作用

圖2顯示，THSH1712菌株在MNNG濃度為0.1 mg/L和1 mg/L時(shí)幾乎沒有響應(yīng)，相對(duì)吸光值在125左右。而在濃度為5 mg/L以上時(shí)，作用0.5 h即有明顯響應(yīng)，在作用至3.5 h及4 h時(shí)達(dá)到高峰；對(duì)MNNG的最佳響應(yīng)濃度為50 mg/L，超過該濃度則開始下降。各濃度在5 h以后基本趨于平穩(wěn)。

3.3.2 THSH1711、THSH1712重組發(fā)光菌對(duì) MMC的響應(yīng)作用

THSH1711重組菌對(duì)MMC的響應(yīng)作用呈現(xiàn)很好的濃度及時(shí)間線性關(guān)系。當(dāng)MMC濃度在0.1～5 mg/L之間時(shí)，THSH1711在2 h后對(duì)其響應(yīng)隨著濃度及時(shí)間明顯上升；在MMC濃度為5 mg/L、作用3 h時(shí)為最佳響應(yīng)，隨后逐漸下降（圖3）。

圖3 THSH1711重組發(fā)光菌對(duì)MMC的響應(yīng)作用

THSH1712重組發(fā)光菌對(duì)MMC沒有特別明顯的響應(yīng)作用，MMC濃度在0.1～5 mg/L之間時(shí)，相對(duì)吸光值幾乎沒有變化；只有在MMC達(dá)到10 mg/L以上時(shí)，作用3 h后出現(xiàn)較大響應(yīng)（圖4）。

圖4 THSH1712重組發(fā)光菌對(duì)MMC的響應(yīng)作用

4 討論

目前國內(nèi)對(duì)發(fā)光細(xì)菌的研究仍局限于篩選天然菌株進(jìn)行毒性檢測(cè)，而構(gòu)建基因工程菌有如下優(yōu)勢(shì)：測(cè)試條件更溫和，可應(yīng)用于傳感器，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)連續(xù)、在線監(jiān)測(cè)；對(duì)毒性的響應(yīng)更靈敏；構(gòu)建不同的菌株，實(shí)現(xiàn)不同要求的毒性評(píng)價(jià)。除了能實(shí)現(xiàn)水質(zhì)毒性的連續(xù)在線及自動(dòng)化檢測(cè)，也可攜帶至野外的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)水質(zhì)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[6]。

本研究構(gòu)建的重組發(fā)光菌THSH1711及THSH1712經(jīng)測(cè)試能對(duì)DNA損傷污染物MNNG、MMC有特異性響應(yīng)，而對(duì)其余非DNA損傷污染物或重金屬等未有響應(yīng)。構(gòu)建的重組發(fā)光菌測(cè)試線性范圍寬，對(duì)MNNG的響應(yīng)濃度為5～200 mg/L，對(duì)MMC的響應(yīng)濃度為0.1～10 mg/L，并能在響應(yīng)高峰維持相當(dāng)長的時(shí)間，將水樣進(jìn)行一定程度的處理濃縮即可快速、穩(wěn)定測(cè)定毒性效應(yīng)。THSH1711對(duì)MMC的響應(yīng)只需0.1 mg/L，并在3 h時(shí)達(dá)到反應(yīng)高峰。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的另一株含PUCD-recA載體的重組發(fā)光菌對(duì)MMC的響應(yīng)的靈敏度達(dá)到了0.01 mg/L[7]，高于其他用天然發(fā)光菌檢測(cè)靈敏度達(dá)1 mg/L的毒性檢測(cè)儀[8]。THSH1712對(duì)MNNG的響應(yīng)作用非常明顯，雖然發(fā)生響應(yīng)需該試劑濃度達(dá)到5 mg/L，但作用0.5 h即有很高的相對(duì)吸光值6949，作用4 h時(shí)最高峰時(shí)更是達(dá)到了43 294，上升了6倍之多，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了對(duì)MMC或其他重組發(fā)光菌對(duì)MNNG及MMC的響應(yīng)作用。

除了測(cè)試條件及具有特異性響應(yīng)特點(diǎn)以外，重組發(fā)光菌響應(yīng)原理是基于轉(zhuǎn)化的重組發(fā)光載體對(duì)特異污染物的反應(yīng)作用，載體無論在保存還是運(yùn)輸過程中，都相當(dāng)穩(wěn)定。相比于天然發(fā)光菌極易受冷凍或運(yùn)輸途中保存不當(dāng)而影響光強(qiáng)，重組發(fā)光菌在操作的便利性方面具有很大優(yōu)勢(shì)，更適用于生物毒性在線監(jiān)測(cè)。而且其克服了理化檢測(cè)的局限性和連續(xù)取樣的繁瑣性，快速獲得水質(zhì)毒性資料，達(dá)到早期預(yù)警目的，發(fā)展前景廣闊。

5 結(jié)論

成功構(gòu)建了兩種重組發(fā)光載體pUCD-uvrA、pUCD-alkA，轉(zhuǎn)化入RFM443菌株后能對(duì)DNA損傷污染物有很好的特異響應(yīng)作用。此方法在操作便捷性及實(shí)驗(yàn)經(jīng)濟(jì)性方面具有較大優(yōu)勢(shì)，更適合生物毒性的實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)。

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