羅榮利 朱再生 張春霆

前列腺癌中Shh Ptc的表達(dá)與前列腺癌臨床病理的關(guān)系

羅榮利 朱再生 張春霆

目的 檢測(cè)前列腺癌（Prostate Carcinoma）、癌旁前列腺組織中Shh、Ptc基因的表達(dá)，分析其與前列腺癌臨床病理的關(guān)系。方法 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse anscription Polymerase Chain Reaction RT-PCR）法檢測(cè)32例前列腺癌及正常前列腺組織中Shh、PtcmRNA的表達(dá)，分析其表達(dá)與前列腺癌的臨床病理關(guān)系。結(jié)果 前列腺癌組織中Shh、Ptc mRNA的表達(dá)均高于正常前列腺組織，在前列腺癌組織中Shh、Ptc的陽(yáng)性表達(dá)率分別為90.62%和93.75%，癌旁前列腺組織中分別為40.63%和43.75%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Shh、Ptc mRNA異常增高表達(dá)與前列腺癌Gleason分級(jí)及臨床分期相關(guān)；Shh與Ptc的異常表達(dá)在前列腺癌中呈正相關(guān)。結(jié)論 Shh、PtcmRNA在前列腺癌中呈現(xiàn)異常增高表達(dá)，其異常增高表達(dá)與前列腺癌臨床病理相關(guān)，Shh、Ptc增高表達(dá)在前列腺癌中呈現(xiàn)正相關(guān)，兩者可能協(xié)同參與前列腺癌發(fā)生、進(jìn)展。

前列腺腫瘤 Shh Ptc

1980年由Nusslein-Vollhard等［1］研究果蠅時(shí)發(fā)現(xiàn)Hedgehog（Hh）基因，在哺乳動(dòng)物中Hedgehog信號(hào)分子與膜受體Patched（Ptch）受體結(jié)合，形成復(fù)合物后發(fā)揮生物學(xué)作用，研究發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)通路在前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲中具有重要作用［2］。Hedgehog與Ptch和Smo兩種受體結(jié)合，Ptch對(duì)Hedgehog起負(fù)調(diào)控作用，通過(guò)抑制細(xì)胞膜上Smo蛋白而影響信號(hào)轉(zhuǎn)換，當(dāng)Hh蛋白與Ptch受體結(jié)合時(shí)，Ptch對(duì)Smo的抑制作用解除，但Hh信號(hào)通路相關(guān)基因在前列腺癌中的表達(dá)狀況及其與前列腺癌臨床病理是否相關(guān)，報(bào)道較少，作者采用RT-PCR方法，檢測(cè)Hh通路成員Shh、Ptc在前列腺癌與癌旁前列腺組織中mRNA的表達(dá)，探討其與前列腺癌臨床病理的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2010年1月至2013年12月本院前列腺癌標(biāo)本32例，所有患者術(shù)前均未行放療、化療及內(nèi)分泌治療。行根治性前列腺切除后標(biāo)本立即行-80℃液氮凍存。年齡63～87歲，平均年齡75歲。病理分級(jí)：Gleason分級(jí)≤6分5例、7分12例、8～9分15例。TMN分期：T1～T2期13例、T3～T4期19例。對(duì)照組為癌旁前列腺組織標(biāo)本。

1.2 方法 （1）試劑及儀器：引物（Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）、核酸分子量DNA Marker（MBI Fermentas公司），TaqDNA酶（其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。PCR擴(kuò)增儀（ABI公司）、電泳儀、Image Master VDS凝膠掃描儀及圖像分析系統(tǒng)（Pharmacia Biotech公司），PCR基因擴(kuò)增儀PE9600（PE公司）。（2）RT-PCR檢測(cè)：①總RNA提?。喝龃鏄?biāo)本50～100mg，加1ml Trizol（TaKaRa）進(jìn)行勻漿，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行制備總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280值在1.8～2.0。分別取各組總RNA 2μl，在MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下于37℃合成cDNA。②應(yīng)用Premier primer 5.0軟件設(shè)計(jì)Shh、Ptch引物序列，由Invitrogen公司合成及純化。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為96℃10s，58℃20s，72℃ 25s，30個(gè)循環(huán)。1.5%瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物，RTPCR引物序列Shh：5'-GGAGTGAAACTGCGGGTGA-3'5'-GCGGTCCAGGAAAGTGAGG-3'Product：379（bp）；Ptc：5'-TCCCAAGCAAATGTACGCA-3'5'-TGAGTGGAGTTCTGTGCGACAC-3' Product：144（bp）；β-actin：5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'5'-GGGCACGAGGGCTCATCATT-3'，Product：285（bp）。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示；用方差分析，相關(guān)性分析用Speamon相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織和癌旁前列腺組織中Shh、Ptc的表達(dá)情況 32例前列腺癌組織中Shh、Ptc的陽(yáng)性表達(dá)數(shù)分別為29例（90.62%）和30例（93.75%），癌旁前列腺組織中分別為13例（40.63%）和14例（43.75%）。前列腺癌組織中Shh、Ptc的表達(dá)均高于癌旁正常組織，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 前列腺癌組織及癌旁正常組織中Shh、Ptc的表達(dá)

2.2 前列腺癌中Shh 、Ptc的表達(dá)程度與臨床分期、Gleason分級(jí)的關(guān)系 32例前列腺癌組織中臨床分期越晚，Gleason 評(píng)分越高，則Shh 、Ptc的表達(dá)越強(qiáng)（見(jiàn)表1）。前列腺癌中Shh mRNA水平較癌旁正常前列腺升高2.1倍，PtcmRNA水平升高2.3倍（見(jiàn)圖1）。

表1 Shh 、Ptc基因在前列腺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量（x±s）

2.3 前列腺癌組織中Shh 、Ptc表達(dá)的相關(guān)性 前列腺癌組織中Shh與Ptc的表達(dá)呈現(xiàn)相關(guān)性，在前列腺癌組織中，Shh表達(dá)增強(qiáng)，Ptc表達(dá)也增強(qiáng)，相關(guān)性分析顯示Shh與Ptc的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=1.23。見(jiàn)圖2。

圖2 在前列腺癌中，Shh與Ptc的表達(dá)率呈現(xiàn)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=1.23

3 討論

前列腺癌是歐美國(guó)家最常見(jiàn)惡性腫瘤之一。隨著生活方式的改變和人口的老齡化及PSA普查的開(kāi)展，我國(guó)前列腺癌的發(fā)生率明顯上升。然而前列腺癌早期起病隱匿，一旦進(jìn)展發(fā)展較快，早期診斷及預(yù)測(cè)前列腺癌的進(jìn)展尤為重要。雖然近來(lái)多種基因研究顯示與前列腺癌有關(guān)，臨床中也有患者前列腺癌進(jìn)展，但檢測(cè)指標(biāo)正常范圍［3］。因此，尋找有效預(yù)測(cè)前列腺癌標(biāo)記物對(duì)前列腺癌早期診斷及治療十分必要。

Hh信號(hào)通路是一個(gè)高度保守的調(diào)控胚胎發(fā)育的信號(hào)通路，對(duì)胚胎發(fā)育及胚胎形成后細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化都有重要調(diào)控作用，研究表明多種惡性腫瘤與Hh信號(hào)通路的異常激活有關(guān)，其在腦、肺、胃腸及皮膚等部位產(chǎn)生惡性腫瘤中異常表達(dá)，細(xì)胞學(xué)研究顯示選擇性地阻斷這一通路可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)［4-6］。其中最重要的Shh基因，其被認(rèn)為可能與腦、脊髓中軸骨骼、肺、皮膚、四肢、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及淋巴發(fā)育等眾多組織原始發(fā)育過(guò)程有關(guān)［7］。

Hh信號(hào)通路通過(guò)其膜受體Patched（Ptc）及Smoothened（Smo），作用于核轉(zhuǎn)錄因子Gli1引起靶基因的表達(dá)，發(fā)揮其生理作用。該通路中受體Ptc由腫瘤抑制基因Patched 編碼，由12個(gè)跨膜區(qū)的單一肽鏈構(gòu)成，能與配體直接結(jié)合，對(duì)Hh信號(hào)通路起負(fù)調(diào)控作用［8］。受體Smo由原癌基因Smoothened 編碼，與G蛋白偶聯(lián)受體同源，功能受Ptc的影響，在缺少Hh 配體時(shí)，Ptc抑制Smo的功能；Hh 配體存在時(shí)，Ptc與Hh 結(jié)合，從而解除Ptc對(duì)Smo的抑制，引起下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。Ptc既是Hh的細(xì)胞膜受體，又是Hh的轉(zhuǎn)錄性目標(biāo)［9-10］。因此，Ptc表達(dá)既可以提示細(xì)胞對(duì)Hh配體具有反應(yīng)性，又提示Hh信號(hào)通路的激活。本資料中對(duì)32例前列腺癌組織中Shh的陽(yáng)性表達(dá)為29例（90.62%），癌旁正常前列腺組織中Shh的陽(yáng)性表達(dá)為13例（40.63%）；前列腺癌組織中Shh的表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05），表明前列腺癌中存在Hh信號(hào)通路過(guò)度激活現(xiàn)象。前列腺癌中Shh mRNA水平較癌旁正常前列腺升高2.1倍，PtcmRNA水平升高2.3倍，本資料結(jié)果顯示前列腺癌組織中Shh與Ptc的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05），即Shh表達(dá)越強(qiáng)，Ptc的表達(dá)也越強(qiáng)；提示前列腺癌中存在Hh信號(hào)通路的激活，在前列腺癌中可能存在某種相互激活機(jī)制，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，在前列腺癌組織中，Shh、Ptc的表達(dá)均高于癌旁正常組織，Shh和Ptc是Hh通路的中間效應(yīng)蛋白；表明在前列腺癌中可能有Shh和Ptc信號(hào)通路的過(guò)度激活狀態(tài)。兩個(gè)基因在前列腺癌組織中的異常表達(dá)提示其在前列腺癌發(fā)病機(jī)制中可能起到重要的作用，積極探討Hh信號(hào)通路對(duì)前列腺癌的診斷和治療有深遠(yuǎn)意義。

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Objective To detect the expressions of Shh and Ptc genes in prostate cancer and adjacent tissues，and to analyze the relationship between the expression of Shh and Ptc gene and clinicopathological features of prostate cancer. Methods The expressions of Shh and PtcmRNA were detected by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）in 32 cases with prostate cancer and normal prostate tissue，and the relationship and clinicopathological features of prostate cancer were analyzed. Results The positive rates of Shh and Ptc in prostate cancer tissues were 90.62%（29/32）and 93.75%（30/32）respectively，and the positive rates of Shh and Ptc mRNA in prostate cancer tissues were signif i cantly higher than those in normal prostate tissues 43.75%（14/32）. There was signif i cant difference between the two groups（P＜0.05）. The abnormal expression of Shh and Ptc mRNA was correlated with Gleason grade and clinical stage of prostate cancer. Abnormal expression of Shh and Ptc was positively correlated with prostate cancer. Conclusion The expression of Shh and PtcmRNA is abnormally high in prostate cancer. The abnormal expression of Shh and Ptc is correlated with the clinicopathological features of prostatic cancer. The expression of Shh and Ptc is positively correlated with prostate cancer，which may be involved in the progression of prostate cancer.

Prostatic neoplasms Shh Ptc

321000 浙江大學(xué)金華醫(yī)院