杜海江

摘要 目前所生產(chǎn)的新城疫LaSota株疫苗的病毒效價(jià)仍有一定的提高空間，而病毒效價(jià)可極大地影響疫苗本身的質(zhì)量。針對(duì)這一問(wèn)題，本文利用正交試驗(yàn)原理，對(duì)影響疫苗效價(jià)的后孵化溫度、后孵化濕度、照蛋時(shí)間間隔等3個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。結(jié)果表明，溫度為36 ℃、濕度為55%、照蛋間隔時(shí)間2 h為最佳生產(chǎn)方案，該方案能有效提高疫苗效價(jià)，從而提高疫苗的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞 新城疫LaSota株；疫苗效價(jià)；后孵化溫度；后孵化濕度；照蛋時(shí)間間隔

中圖分類(lèi)號(hào) S852.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2018）20-0213-02

新城疫LaSota株是副黏病毒屬的一個(gè)代表病毒，直徑為100～250 nm，有囊膜，通常呈圓形，但常因囊膜破損而變得不規(guī)則，也常見(jiàn)橫斷面100 nm左右的不同長(zhǎng)度的細(xì)絲，呈現(xiàn)出多形性病毒粒子[1]，在10～12日齡雞胚的絨毛尿囊膜或尿囊腔中生長(zhǎng)，接種24～36 h病毒滴度可達(dá)到1010 EID50/mL。雞胚經(jīng)24～72 h死亡，出現(xiàn)血性病變和腦炎[2]。LaSota亦即L系苗，在新城疫弱毒疫苗中毒力最強(qiáng)，易感雛雞，在接種后反應(yīng)較重，一般不能用于2周齡以下的小雞免疫[3]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如牛和豬的腎細(xì)胞）也可以培育此病毒，但病毒免疫原性差且滴度低于接種病毒。因此，雞胚接種是目前最常用的方法。雞胚苗中滴度>108 EID50/mL的可作活疫苗，滴度>107 EID50/mL的只可制作滅活苗，制成滅活苗明顯降低了產(chǎn)品利潤(rùn)空間，再者疫苗滴度的高低也是疫苗質(zhì)量好壞的一個(gè)重要指標(biāo)。因此，如何提高疫苗滴度已成為亟待解決的問(wèn)題[4]。本試驗(yàn)采用生物統(tǒng)計(jì)的方法對(duì)影響疫苗效價(jià)的后孵化溫度、后孵化濕度、照蛋時(shí)間間隔等3個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得出最佳的生產(chǎn)方案，有效提高了疫苗的效價(jià)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

種毒為新城疫LaSota株，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，生產(chǎn)前要先進(jìn)行種毒繼代，但不要超過(guò)3代。SPF雞蛋（無(wú)特定病原體雞蛋）由SPF雞舍生產(chǎn)。微量移液器（一道及八道）、微孔板（v型96°）、振蕩器、孵化器由熱電（上海）儀器有限公司生產(chǎn)。0.85%生理鹽水、5%碘酊、阿氏液按《獸用生物制品規(guī)程》（2000版）有關(guān)規(guī)定制備。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 1%雞血紅細(xì)胞配制。消毒取血部位，用一次性5 mL注射器抽取健康公雞的翅下靜脈血，抽3只，每只抽3 mL，然后加入等量阿氏液中混合均勻，用生理鹽水洗滌3次，轉(zhuǎn)速1 500 r/min，離心5 min，每次洗滌后吸棄上清液，包括紅細(xì)胞上的白細(xì)胞層。最后用生理鹽水配成1%雞血紅細(xì)胞（1 mL雞血細(xì)胞加99 mL生理鹽水）。

1.2.2 雞胚前孵化。SPF蛋入孵前先用40～45 ℃含0.1%新潔爾滅的溫水浸泡消毒，并用紗布擦拭雞蛋表面，除去表面污物，同時(shí)挑除沙殼蛋、畸形蛋及破蛋。消毒好的蛋放入孵化器孵化（溫度38℃，濕度65%），翻蛋次數(shù)10次/h。孵化5 d后一照，剔除無(wú)精蛋、破蛋及死胚蛋[5]。孵化10 d后二照，剔除死胚蛋并畫(huà)蛋，在雞胚胎面畫(huà)出氣室邊緣線(xiàn)，在臍帶或雞頭部周?chē)荛_(kāi)大血管畫(huà)出一小圓圈，即接種部位。

1.2.3 雞胚接種及后孵。①接種。用0.1%新潔爾滅對(duì)10日齡雞胚進(jìn)行表面消毒，再用5%碘酊消毒接種部位，5 min后于接種部位打孔，同時(shí)將生產(chǎn)用種毒稀釋5萬(wàn)～10萬(wàn)倍，在萬(wàn)級(jí)下局部百級(jí)的環(huán)境中進(jìn)行接種操作：用帶有5號(hào)針頭的卡介苗注射器沿雞胚長(zhǎng)軸方向與蛋殼面成45°進(jìn)針，每胚接種0.1 mL，接種后用蠟封住接種口。②后孵化。將接種完的1 881枚雞胚隨機(jī)分成9組，每組209枚，分別于以下不同試驗(yàn)條件下后孵化，具體如表1所示。

1.2.4 照蛋。接種60 h后按照不同時(shí)間間隔照蛋，將每一時(shí)期死亡胚體放入專(zhuān)用蛋盤(pán)，置于2～8 ℃中冷藏，96 h后的活胚待冷卻后也放入2～8 ℃冷藏20 h。每組雞胚分開(kāi)放置，60 h以前的死胚棄去。

1.2.5 收苗。于緩沖間內(nèi)用0.1%新潔爾滅擦拭雞蛋表面，然后于萬(wàn)級(jí)下局部百級(jí)環(huán)境中用5%碘酊消毒氣室周?chē)?，小心敲去氣室周?chē)皻?，不要弄破絨毛尿囊膜以免污染，用潔凈注射器收取尿囊液，不要刺破卵黃，不收污染胚。收集每種試驗(yàn)方案的胚液，加入雙抗（青霉素和慶大霉素）混勻，共9份。

1.2.6 測(cè)定病毒血凝價(jià)。每份尿囊液各取20 mL用于血凝試驗(yàn)，將待檢樣品分別用生理鹽水稀釋成1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶600、1∶700、1∶800、1∶900、1∶1 000，1∶1 100。其次用微量移液器依次從每個(gè)稀釋度中移取30 μL到微孔板的第1～11孔中，第12孔加30 μL生理鹽水作空白對(duì)照。搖勻雞血紅細(xì)胞，然后在每孔中各加入30 μL 1%雞血紅細(xì)胞（注意吸取量要準(zhǔn)確，要懸空滴入以免拖帶），并于振蕩器上混勻2 min，最后水平靜置于室溫環(huán)境中，待空白對(duì)照孔發(fā)生完全沉集時(shí)讀取血凝價(jià)，以50%凝聚孔的稀釋度為該樣品的血凝價(jià)，9組試驗(yàn)的血凝價(jià)見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

由表3、4可知，后孵化濕度對(duì)疫苗滴度影響最大，照蛋時(shí)間間隔次之，溫度影響最小。最佳生產(chǎn)方式應(yīng)該是后孵化濕度55%，照蛋時(shí)間間隔2 h，后孵化溫度36 ℃。用該試驗(yàn)方案生產(chǎn)疫苗可使疫苗血凝價(jià)比原來(lái)（1∶256）高很多，并且可達(dá)到制作高效濃縮苗的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)9組死亡雞胚進(jìn)行胚體觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)大部分胚體都出現(xiàn)典型的出血病變，特別是喙部?jī)蓚?cè)、頸部、翅部邊緣、腳部末梢等部位，小部分有腦炎癥狀。

3 結(jié)論與討論

（1）本試驗(yàn)采用簡(jiǎn)便的血凝試驗(yàn)間接驗(yàn)證疫苗的滴度是可行的，因?yàn)樾鲁且卟《镜腍N蛋白能結(jié)合雞血紅細(xì)胞，血凝能力與病毒含量成正比[6]。血凝價(jià)反映的是病毒的含量，而雞胚測(cè)毒反映的是活病毒含量。眾多資料表明，血凝價(jià)與雞胚測(cè)毒測(cè)出的滴度成正相關(guān)關(guān)系[7]。

（2）經(jīng)查閱相關(guān)生產(chǎn)記錄發(fā)現(xiàn)，新城疫病毒在高溫高濕并且沒(méi)有活細(xì)胞可供生長(zhǎng)繁殖的條件下，病毒的自身降解速度很快。因此，縮短照蛋時(shí)間間隔可及時(shí)將死胚挑出，放置在干燥低溫環(huán)境中，能較好保護(hù)病毒的穩(wěn)定性。若后孵化濕度較低，胚體中的水分會(huì)有部分蒸發(fā)，有濃縮病毒的效果，但這樣會(huì)導(dǎo)致胚液量的減少，可能會(huì)影響胚液收獲量。筆者采用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)中的方差分析法得出的結(jié)論與相關(guān)生產(chǎn)記錄相符，但還有一些問(wèn)題如種毒的稀釋倍數(shù)調(diào)節(jié)、蛋的死亡時(shí)間控制等有待進(jìn)一步研究和解決[8]，從而提高疫苗的效價(jià)。

（3）試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種后72 h的死胚及接種后96 h的活胚的血凝價(jià)比其他時(shí)段死胚的血凝價(jià)高，其中原理尚不明確。針對(duì)雞胚接種后雞胚的生長(zhǎng)及病毒的繁殖規(guī)律等問(wèn)題還需作進(jìn)一步研究。

（4）本次試驗(yàn)僅從后孵化溫度、后孵化濕度、照蛋時(shí)間間隔等3個(gè)因素對(duì)提高疫苗效價(jià)從而提高疫苗的質(zhì)量進(jìn)行初步探索，深層次的論證試驗(yàn)有待今后進(jìn)一步進(jìn)行。

4 參考文獻(xiàn)

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