孫少鵬，孔廣起，賢少忠，蔡大偉

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院，北京通州101149)

miR-429過(guò)表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響及機(jī)制

孫少鵬，孔廣起，賢少忠，蔡大偉

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院，北京通州101149)

目的探討miR-429過(guò)表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響及機(jī)制。方法將常規(guī)培養(yǎng)好的膀胱癌細(xì)胞T24隨機(jī)分為對(duì)照組、miR-429組，對(duì)照組轉(zhuǎn)染miR-NC(無(wú)關(guān)序列的mimics)，miR-429組轉(zhuǎn)染插入miR-429的目標(biāo)片段。用劃痕試驗(yàn)檢測(cè)兩組遷移能力，Transwell侵襲試驗(yàn)檢測(cè)其侵襲能力。采用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)T24細(xì)胞內(nèi)E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)及鈣黏附蛋白E(E-cadherin)mRNA表達(dá)，用免疫印跡法檢測(cè)T24細(xì)胞內(nèi)ZEB1、MMP-2及E-cadherin蛋白表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，miR-429組細(xì)胞遷移距離短，遷移細(xì)胞數(shù)少(P均<0.05)，細(xì)胞內(nèi)ZEB1、MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)低，E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)高(P均<0.05)。結(jié)論miR-429b過(guò)表達(dá)可能通過(guò)靶向抑制膀胱癌細(xì)胞內(nèi)ZEB1、MMP-2表達(dá),增強(qiáng)E-cadherin的表達(dá)阻止膀胱癌細(xì)胞遷移、侵襲。

膀胱癌；微小RNA-429；細(xì)胞遷移；細(xì)胞侵襲

膀胱癌是一種惡性腫瘤，占全部惡性腫瘤的1%～2%，其發(fā)病率與病死率均居泌尿系腫瘤的首位，且約50%的患者術(shù)后復(fù)發(fā)[1]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，其表現(xiàn)為上皮鈣黏連蛋白的丟失與上皮鈣黏連蛋白阻遏物表達(dá)的增加[2]。在EMT過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生溶解，是膀胱癌通過(guò)血液和淋巴系統(tǒng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要作用機(jī)制之一[3]，其中起主要作用的酶為基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)。微小RNA(miRNA)是一類(lèi)由18～24個(gè)單核苷酸組成的非編碼RNA[4，5]。miR-200家族可靶向調(diào)控多種參與EMT基因的表達(dá)[6]。miR-200c可抑制膀胱癌細(xì)胞侵襲與增殖[7]，miR-200c與miR-205協(xié)同作用抑制膀胱癌的轉(zhuǎn)移[8]。目前有關(guān)miR-429在膀胱癌中的作用尚未見(jiàn)明確報(bào)道。2015年9月～2016年12月，本研究對(duì)此進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑、儀器及其來(lái)源 膀胱癌細(xì)胞T24由本試驗(yàn)室提供。DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigmag公司；胎牛血清購(gòu)自以色列Biolnd公司；胰蛋白酶購(gòu)自長(zhǎng)沙研科生物科技有限公司；一抗、二抗購(gòu)自武漢三鷹科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Costar公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce Chemical公司，5×SDS蛋白上樣緩沖液、SDS、Tris、甘氨酸、TEMED、30%Acr-Bis(29∶1)、Glycine、Tween20、脫脂奶粉及過(guò)硫酸銨均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；D-Hanks緩沖液由本試驗(yàn)室自行配制。倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Forma公司；恒溫-80 ℃冰箱購(gòu)自中國(guó)海爾(Haier)集團(tuán)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)生物科技公司；板式酶標(biāo)儀購(gòu)自中國(guó)北京新風(fēng)機(jī)電公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 取含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)T24細(xì)胞。用含0.02% EDTA的胰酶消化液消化細(xì)胞，待細(xì)胞傳至第4、5代，選擇增殖旺盛、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。將細(xì)胞接種入6孔板，生長(zhǎng)至50%～60%將其分為對(duì)照組、miR-429組，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，對(duì)照組轉(zhuǎn)染miR-NC(無(wú)關(guān)序列的mimics)，miR-429組轉(zhuǎn)染插入miR-429的目標(biāo)片段5′-TAATACTGTCTGGTAAAACCGT-3′，6 h后換液。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)，其過(guò)表達(dá)效率≥90%，證明轉(zhuǎn)染成功。

1.3 T24細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用劃痕試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度達(dá)90%后，用規(guī)格為10 μL的槍頭在6孔板上分別做橫向、縱向各3條劃痕，分別加入細(xì)胞增殖抑制劑羥基脲，培養(yǎng)48 h，觀察兩組細(xì)胞遷移情況并拍照，測(cè)算細(xì)胞遷移距離。

1.4 T24細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell侵襲試驗(yàn)。于試驗(yàn)前1 d將基質(zhì)膠放置于4 ℃恒溫冰箱中滆化、過(guò)夜。試驗(yàn)前將所用槍頭在冰上預(yù)冷0.5 h，基質(zhì)膠與預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基按1∶7的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)靠准尤胂♂尯蟮幕|(zhì)膠15 μL，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2～3 h；轉(zhuǎn)染1 d后，收集兩組細(xì)胞，用胰酶消化6孔板中的細(xì)胞，用濃度為10%血清培養(yǎng)基終止消化，離心，清除含血清的培養(yǎng)基，加入無(wú)血清培養(yǎng)基并重新懸浮細(xì)胞，細(xì)胞稀釋為5×105/mL，每孔加入細(xì)胞懸液200 μL；24孔板小室下層加入20% FBS血清800 μL，以供細(xì)胞進(jìn)行侵襲；1～2 d后，顯微鏡下觀察到細(xì)胞已侵襲至24孔板底部時(shí)立即終止侵襲試驗(yàn)，棄小室中培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，并用0.1%結(jié)晶紫對(duì)穿過(guò)小室的細(xì)胞染色10 min，清水漂洗3次，用棉簽輕輕擦掉上層未侵襲細(xì)胞。顯微鏡下觀察并拍照。計(jì)算侵襲至小室下層的細(xì)胞數(shù)。

1.5 T24細(xì)胞內(nèi)E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB1)、MMP-2及鈣黏附蛋白E(E-cadherin)mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)。用TRIzol法提取兩組細(xì)胞總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件：42 ℃、60 min，70 ℃、10 min。將cDNA作為模板，用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，U6為內(nèi)參照，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。ZEB1引物：P1：5′-gcacaaccaagtgcagaaga-3′，P2：5′-catttgcagattgaggctga-3′；MMP2引物：P1：5′-gctccaccacctacaactttgagaa-3′；P2:5′-tgtgataggatgtgccctggaa-3′；E-cadherin引物：P1：5′-tacactgcccaggagccaga-3′，P2：5′-tggcaccagtccggatta-3′。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共39個(gè)循環(huán)；然后95 ℃、15 s， 60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳及熔解曲線鑒定qRT-PCR產(chǎn)物，并用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析。

1.6 T24細(xì)胞內(nèi)ZEB1、MMP-2及E-cadherin蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫印跡法。 使用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，總蛋白經(jīng)BCA法測(cè)定濃度后，以30 μg/孔加樣，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，將轉(zhuǎn)印了蛋白的PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉，并培育一抗及相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。使用Quantityone軟件測(cè)定條帶灰度值，蛋白的相對(duì)含量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miR-429過(guò)表達(dá)對(duì)T24細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響 培養(yǎng)48 h，對(duì)照組、miR-429組遷移距離分別為(10.09±0.4)、(5.2±0.23)mm。miR-429組細(xì)胞遷移距離短于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組、miR-429組遷移細(xì)胞數(shù)分別為(102±3)、(36±8)個(gè)。miR-429組遷移細(xì)胞數(shù)少于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2 miR-429過(guò)表達(dá)對(duì)T24細(xì)胞ZEB1、MMP-2、E-cadherin表達(dá)的影響 見(jiàn)表1。

表1 兩組ZEB1、MMP-2、E-cadherin表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

膀胱癌為泌尿系常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，年新增病例38.63萬(wàn)，病死病例15.02萬(wàn)，發(fā)病率在惡性腫瘤中居第9位，致死率列全球男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤第2位。75%的患者為非肌層浸潤(rùn)膀胱癌，5年生存率較高；25%為肌層浸潤(rùn)膀胱癌，在首次積極治療后容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。探尋基于分子網(wǎng)絡(luò)的新型治療模式、早期診斷及預(yù)后標(biāo)志物成為近年研究的熱點(diǎn)。EMT是指具有極性結(jié)構(gòu)的上皮細(xì)胞喪失緊密連接結(jié)構(gòu)的過(guò)程。在該過(guò)程中，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞，獲得了間質(zhì)細(xì)胞的分子標(biāo)記物，且具有更強(qiáng)的侵襲和遷移能力。EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移具有相同的特點(diǎn)，即調(diào)節(jié)因素多、機(jī)制復(fù)雜。

miRNA通過(guò)與其靶mRNA分子3′非編碼區(qū)特異堿基部分完全或不完全配對(duì)結(jié)合，從而導(dǎo)致其發(fā)生降解或翻譯抑制,于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。研究證實(shí)，miRNA可調(diào)控>60%的人類(lèi)蛋白編碼基因，并在多種病理生理進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。miRNA既可作為抑癌基因又可作為原癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。鑒于其疾病/組織特異性表達(dá)圖譜及驚人的調(diào)控潛能，miRNA已成為腫瘤診斷及預(yù)后的標(biāo)志物。miR-429是miR-200家族中具有抑癌作用的成員之一。本研究證實(shí)，miR-429過(guò)表達(dá)對(duì)T24細(xì)胞遷移能力起到了一定的抑制作用，并同時(shí)抑制細(xì)胞侵襲，其主要原因可能為miR-429過(guò)表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生，延緩其進(jìn)程。miR-429能夠抑制ZEB1的表達(dá)同時(shí)恢復(fù)E-cadherin的表達(dá)，從而阻滯膀胱癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。目前研究認(rèn)為，miR-429在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，如膀胱癌[9]、胃癌[10]、腎癌[11]、結(jié)直腸癌[12]和鼻咽癌[13]，在其他腫瘤組織中miR-429的表達(dá)也發(fā)生上調(diào)。miR-200家族可直接靶向ZEB1和ZEB2，進(jìn)而抑制EMT的發(fā)生。過(guò)表達(dá)miR-200c能夠升高E-cadherin的表達(dá)[14]。本研究也發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-429能夠抑制ZEB1的表達(dá)，恢復(fù)E-cadherin的表達(dá)。在miR-429所介導(dǎo)的EMT信號(hào)通路中E-cadherin是十分重要的指標(biāo)，ZEB1與ZEB2在膀胱癌組織中的表達(dá)異常升高[15]，并且ZEB2的高表達(dá)與膀胱癌患者的不良預(yù)后存在相關(guān)性，同時(shí)E-cadherin的丟失也會(huì)導(dǎo)致患者預(yù)后不良。

綜上所述，miR-429能夠通過(guò)靶向抑制ZEB1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)EMT的抑制，從而遏制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。本研究為今后膀胱癌的臨床治療提供了新方向，而miR-429很可能作為膀胱癌臨床治療的新靶點(diǎn)。

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