劉承一,肇爽,白璐,呂喜英,高東奇,李青山

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,河北承德067000)

miR-7-5p靶向調(diào)控EGFR對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖侵襲的影響

劉承一,肇爽,白璐,呂喜英,高東奇,李青山

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,河北承德067000)

目的探討miR-7-5p是否通過調(diào)控表皮生長因子受體(EGFR)的表達(dá)而影響人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體外增殖和侵襲能力。方法通過雙熒光素酶試驗(yàn)證明EGFR為miR-7-5p的下游靶基因，用miR-7-5p(miR-7-5p組)或miR-N.C.(miR-N.C.組)轉(zhuǎn)染NCI-H1975細(xì)胞，并設(shè)立空白對(duì)照組，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)EGFR mRNA，采用Western blotting法檢測(cè)EGFR蛋白的表達(dá)。然后通過比色法、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell小室法檢測(cè)NCI-H1975細(xì)胞體外增殖活力和侵襲能力。結(jié)果miR-7-5p可通過靶向3′UTR發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，降低熒光素酶的表達(dá)活性。miR-7-5p組EGFR mRNA及蛋白表達(dá)量低于miR-N.C.組(P均<0.05)。轉(zhuǎn)染后72 h，miR-7-5p組細(xì)胞增殖活力比miR-N.C.組降低(P<0.05)。與miR-N.C.組相比，miR-7-5p組NCI-H1975細(xì)胞S期所占比例下調(diào)(P<0.05)，而G0/G1期細(xì)胞所占比例增加(P<0.05)。與miR-N.C組相比，miR-7-5p組細(xì)胞侵襲變化率下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論miR-7-5p通過靶向抑制EGFR的表達(dá)而抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

非小細(xì)胞肺癌；微小RNA-7-5p；表皮生長因子受體；細(xì)胞增殖；細(xì)胞侵襲

肺癌中約85%患者為非小細(xì)胞肺癌[1]，隨著人口老齡化增加，65歲以上的老齡肺癌患者占比超過2/3[2]。由于診治不及時(shí)或缺乏有效早期診斷等原因，部分患者已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，因而尋求非手術(shù)治療方法成為惟一選擇。因表皮生長因子受體(EGFR)在實(shí)體腫瘤疾病進(jìn)展中有重要作用[3]，已有針對(duì)EGFR的單克隆抗體研發(fā)，雖在使用過程中顯現(xiàn)出相應(yīng)療效，但其耐藥問題較為突出[4]，因此需要探索更積極有效的靶向EGFR的治療策略。2016年1～12月,本研究擬在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H1975中證實(shí)微小RNA-7-5p (miR-7-5p)對(duì)EGFR的靶向負(fù)性調(diào)控作用，并探討其對(duì)NCI-H1975細(xì)胞增殖活力和侵襲能力的影響，為針對(duì)EGFR的靶向策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 293T細(xì)胞和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H1975購于中國科學(xué)院，NCI-H1975細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM中，其中含有1%鏈霉素、青霉素和10%胎牛血清。293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、100%相對(duì)飽和濕度，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。胎牛血清購于美國Gibco公司,鏈霉素和青霉素、胰蛋白酶購于HyClone公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、細(xì)胞裂解液、MTS細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司，miR-7-5p及其陰性對(duì)照(miR-N.C.)購于上海吉瑪公司；TRIzol試劑、PCR引物和脂質(zhì)體Lipo2000TM購于Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購于TAKARA公司，EGFR抗體及HRP標(biāo)記二抗購于Santa Cruz公司，雙熒光素酶檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)試劑盒購于Promega公司。

1.2 miR-7-5p對(duì)EGFR靶向作用的驗(yàn)證 采用熒光素酶試驗(yàn)。以1×106/孔將293T細(xì)胞鋪板于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，按照以下分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，共轉(zhuǎn)染分組分別為pRL-TK/pMIR-report-3′UTR/miR-7-5p、pRL-TK/pMIR-report-3′UTR/miR-N.C.、pRL-TK/pMIR-report-3′UTRm/miR-7-5p、pRL-TK/pMIR-report-3′UTRm/ miR-N.C.組。pMIR-report-3′UTR為表達(dá)螢火蟲熒光素酶的非突變質(zhì)粒載體，pMIR-report-3′UTRm為其對(duì)照，是不表達(dá)螢火蟲熒光素酶的突變質(zhì)粒載體，pRL-TK質(zhì)粒表達(dá)海腎熒光素酶。293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染48 h后，用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解，按照說明書提示，依次加入stop/glo和LARⅡ，分別用于檢測(cè)海腎熒光素酶活性和螢火蟲熒光素酶活性，所得OD值按照如下公式處理：相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性×100%。

1.3 EGFR mRNA及蛋白的檢測(cè) 以1×106/孔將NCI-H1975細(xì)胞鋪板于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，參照Lipo2000TM說明書進(jìn)行共轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染操作，NCI-H1975細(xì)胞被轉(zhuǎn)染miR-7-5p(miR-7-5p組)或miR-N.C.(miR-N.C.組)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)EGFR mRNA。NCI-H1975細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用TRIzol試劑裂解各組細(xì)胞，提取總mRNA，使用TOYOBO公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，參照說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)，ABI7300設(shè)置條件為：酶激活3 min(95 ℃)，變性2 s(95 ℃)，延伸30 s(60 ℃)，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)后擴(kuò)增終止。用2-ΔΔCt法[5]表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。采用Western blotting法檢測(cè)EGFR蛋白。使用細(xì)胞裂解液提取轉(zhuǎn)染后的NCI-H1975細(xì)胞總蛋白，總蛋白經(jīng)BCA法測(cè)定濃度后，以30 μg/孔加樣，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，將轉(zhuǎn)印了蛋白的聚偏二氟乙烯膜用5%脫脂牛奶封閉，并培育EGFR及相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。使用Quantityone軟件測(cè)定條帶灰度值，蛋白的相對(duì)含量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

1.4 細(xì)胞增殖活力的檢測(cè) 采用細(xì)胞增殖試驗(yàn)(比色法)。將轉(zhuǎn)染了miR-7-5p(miR-7-5p組)或miR- N.C.(miR- N.C.組)48 h后的NCI-H1975細(xì)胞及未處理的NCI-H1975細(xì)胞(空白對(duì)照組)用胰蛋白酶消化、重懸后，在96孔板中按照1 000個(gè)/孔細(xì)胞密度接種，并于鋪板后的4、12、24、48、72 h觀察細(xì)胞增殖情況，在450 nm波長處測(cè)定加入MTS試劑后上清液中的吸光度(A值)。

1.5 細(xì)胞周期的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。將轉(zhuǎn)染了miR-7-5p(miR-7-5p組)或miR- N.C.(miR- N.C.組)48 h后的NCI-H1975細(xì)胞及未處理的NCI-H1975細(xì)胞(空白對(duì)照組)經(jīng)胰蛋白酶消化、重懸后，用70%冰乙醇固定24 h，采用流式細(xì)胞儀對(duì)propidium iodide染色后的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，使用CELL Quest(Version 3.4, 美國B&D公司)軟件分析所得結(jié)果數(shù)據(jù)。

1.6 細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè) 采用Transwell小室法。用胰蛋白酶將轉(zhuǎn)染48 h后的NCI-H1975細(xì)胞消化，并用含0.2%胎牛血清的DMEM重懸，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞存活率為95%以上。以5×105/孔分別將miR-7-5p轉(zhuǎn)染細(xì)胞(miR-7-5p組)、miR-N.C.轉(zhuǎn)染細(xì)胞(miR-N.C.)和未處理細(xì)胞(空白對(duì)照組)接種于Transwell的上室中，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM，培養(yǎng)24 h后，對(duì)侵襲并穿透基質(zhì)膠的NCI-H1975細(xì)胞進(jìn)行染色和脫色，測(cè)定560 nm波長處A值。細(xì)胞侵襲變化率=∣對(duì)照組A值-試驗(yàn)組A值∣/對(duì)照組A值×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用中位數(shù)表示，3組間比較采用Wilcoxon Kruskall-WallisH檢驗(yàn)，2組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻次或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-7-5p對(duì)EGFR靶向作用的驗(yàn)證結(jié)果 miR-7-5p可通過靶向3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，降低熒光素酶的表達(dá)活性，而無功能的miR-N.C.未體現(xiàn)此效應(yīng)(70.6% 比100%，χ2=28.3，P<0.01)。此外，3′UTR調(diào)節(jié)位點(diǎn)突變后的pRL-TK/pMIR-report-3′UTRm，加入miR-7-5p處理后，其相對(duì)熒光素酶活性亦無變化(100%比100%，P>0.05)。

2.2 miR-7-5p對(duì)NCI-H1975細(xì)胞EGFR mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用 miR-7-5p組NCI-H1975細(xì)胞中EGFR mRNA表達(dá)水平為0.22、EGFR 的蛋白水平為0.30， miR-N.C.組的EGFR mRNA表達(dá)水平為1.13，EGFR 蛋白水平為1.08，兩組EGFR mRNA及蛋白比較，P均<0.05。

2.3 miR-7-5p對(duì)NCI-H1975細(xì)胞增殖活力的影響 轉(zhuǎn)染后72 h，miR-7-5p組NCI-H1975細(xì)胞的增殖活力比miR-N.C.組低(P<0.05)。見表1。

表1 不同時(shí)間各組NCI-H1975細(xì)胞增殖活力比較

2.4 miR-7-5p對(duì)NCI-H1975細(xì)胞周期的影響 與miR-N.C.組相比，miR-7-5p組NCI-H1975細(xì)胞S期所占比例下調(diào)(P<0.05)，而G0/G1期細(xì)胞所占比例增加(P<0.05)。見表2。

2.5 miR-7-5p對(duì)NCI-H1975細(xì)胞侵襲能力的影響 空白對(duì)照組細(xì)胞侵襲變化率為99.6%，miR-7-5p組為51.4%，miR-N.C組為99.2%。與miR-N.C組相比，miR-7-5p組細(xì)胞侵襲變化率下調(diào)48.8%(P<0.05)。

表2 各組不同時(shí)期細(xì)胞所占比例比較

3 討論

miRNA是一種天然存在于細(xì)胞內(nèi)的非編碼小RNA分子，由21～24個(gè)核苷酸構(gòu)成。它在翻譯階段，通過不完全堿基配對(duì)方式，靶向識(shí)別并結(jié)合到mRNA上特異的結(jié)合位點(diǎn)，從而引起mRNA降解或翻譯抑制，最終導(dǎo)致功能蛋白表達(dá)減少[6]。miRNA的結(jié)合位點(diǎn)通常位于mRNA的3′UTR，人體中受miRNA調(diào)控的基因約有92%[7]，針對(duì)miRNA在腫瘤進(jìn)展中作用的研究也逐漸成為熱點(diǎn)[8]。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，翻譯表達(dá)EGFR的mRNA上可能存在miR-7-5p的靶向結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)，近年研究顯示，miR-7-5p可靶向抑制腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤[9]和胃癌[10]中EGFR的蛋白表達(dá)。本研究中，我們也觀察到miR-7-5p針對(duì)3′UTR位點(diǎn)的靶向作用，而突變?cè)撐稽c(diǎn)時(shí)，miR-7-5p的負(fù)向調(diào)控效應(yīng)消失；檢測(cè)轉(zhuǎn)染了miR-7-5p的NCI-H1975細(xì)胞中EGFR的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在核酸水平和蛋白水平的表達(dá)均降低。分析其原因，miR-7-5p除了可以抑制EGFR mRNA向蛋白翻譯的進(jìn)程外，對(duì)mRNA本身也起到了降解作用。

我們進(jìn)一步探究了miR-7-5p對(duì)NCI-H1975細(xì)胞增殖活力的影響，發(fā)現(xiàn)隨著miR-7-5p作用時(shí)間的延長，處理后的NCI-H1975細(xì)胞增殖活力逐步減弱，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。目前研究認(rèn)為，原癌基因c-erbB-1的表達(dá)產(chǎn)物之一即為EGFR[11]，EGFR具有酪氨酸激酶活性，當(dāng)其與相應(yīng)受體結(jié)合后，激活胞內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化，通過介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而加快了血管生成、細(xì)胞分化等進(jìn)程[12]，這些細(xì)胞進(jìn)程亦是腫瘤進(jìn)展中的關(guān)鍵推動(dòng)環(huán)節(jié)，可見EGFR在其中發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果反向證實(shí)了這一觀點(diǎn)，當(dāng)miR-7-5p靶向抑制EGFR的表達(dá)時(shí)，NCI-H1975細(xì)胞增殖活力受抑制。由于miR-7-5p可靶向調(diào)節(jié)EGFR的表達(dá)，也可能同時(shí)影響了其他增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮了協(xié)同效應(yīng)。EGFR在體外試驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)喉癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力具有促進(jìn)作用，當(dāng)miR-7-5p靶向下調(diào)EGFR的表達(dá)時(shí)，乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力受到抑制。本研究中，我們也觀察到，用miR-7-5p處理NCI-H1975細(xì)胞后，細(xì)胞的侵襲能力較對(duì)照組下降。惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征之一是腫瘤細(xì)胞向周圍組織的侵襲，這也是腫瘤晚期的事件之一，常導(dǎo)致患者病情惡化、進(jìn)展甚至死亡[13]。

總之，本研究證實(shí)了miR-7-5p可從核酸水平和蛋白水平實(shí)現(xiàn)對(duì)EGFR表達(dá)的抑制，并進(jìn)一步證實(shí)miR-7-5p可抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的增殖活力和侵襲能力，這為針對(duì)EGFR的非小細(xì)胞肺癌基因治療策略提供了參考。

[1] 石遠(yuǎn)凱,孫燕,丁翠敏,等.中國?？颂婺嶂委煼切〖?xì)胞肺癌專家共識(shí) (2015 版) [J].中國肺癌雜志,2015,7(5):397-400.

[2] 闞亮,張萌,何平.LRRC3B在非小細(xì)胞肺癌中下調(diào)并與肺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力相關(guān)[J].中國肺癌雜志,2016,19(4)：177-183.

[3] Phuchareon J, McCormick F, Eisele DW, et al. EGFR inhibition evokes innate drug resistance in lung cancer cells by preventing Akt activity and thus inactivating Ets-1 function[J]. Proc Natl Acad Sci, 2015,112(29):E3855-E3863.

[4] Chen GD, Lin MT, Lee MS. Diagnosis of interstitial pregnancy with sonography[J]. J Clin Ultrasound, 1994，22(7):439-442.

[5] 李燕,楊濤,張培軍,等.同源盒基因在裸鼠多發(fā)性骨髓瘤中的作用[J].中國老年學(xué)雜志,2015,35(13):3532-3534.

[6] Lai JY, Luo J, O′Connor C, et al. MicroRNA-21 in glomerular injury[J]. J Am Soc Nephro, 2015,26(4):805-816.

[7] 唐晴琴,秦保東,仲人前. microRNA調(diào)控 CD4+T淋巴細(xì)胞分化與成熟的機(jī)制研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2016,1(3):125-128.

[8] 楊良,李航宇,劉金鋼.microRNA 調(diào)控腫瘤微環(huán)境的研究進(jìn)展[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2015,22(2):251-255.

[9] 董倫,宿建輝,王曉東,等.膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者外周血中miRNA特異性表達(dá)研究[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2016,5(4): 401-404.

[10] 陳章乾,金楊晟,吳慶,等.胃癌多藥耐藥相關(guān)microRNA的篩選和鑒定[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,14(17):2.

[11] Kong Y, Qu D, Chen X, et al. Self-organizing map (SOM) and support vector machine (SVM) models for the prediction of human epidermal growth factor receptor (EGFR/ErbB-1) inhibitors [J]. Comb Chem High Throughput Screen， 2016，19(5):400-411.

[12] 李妍,王艷梅,陳旭,等.晚期非小細(xì)胞肺癌表皮生長因子受體敏感突變類型與表皮細(xì)胞生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑療效的回顧性研究[J].中華肺部疾病雜志(電子版),2016,9(2):135-139.

[13] Neri S, Hashimoto H, Kii H, et al. Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts [J]. J Cancer Res Clin Oncol， 2016，142(2):437-446.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.011

R734.2

A

1002-266X(2017)45-0036-03

李青山(E-mail:236467677@qq.com)

2017-08-18)