李美儀，徐紅，譚飛非

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530022)

miR-373-3p低表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建及其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖遷移的抑制作用

李美儀，徐紅，譚飛非

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530022)

目的構(gòu)建人miR-373-3p低表達(dá)慢病毒載體，探討miR-373-3p低表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。方法利用PCR擴(kuò)增包含miR-373-3p前體序列的目的基因，經(jīng)酶切后克隆入慢病毒載體GV280中構(gòu)建GV280-pre-miR-373-3p inhibitor表達(dá)載體，通過(guò)與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒的包裝和滴度測(cè)定。分別用空載慢病毒(空載病毒組)及重組慢病毒miR-373-3p(miR-373-3p組)感染HEC-1A細(xì)胞，并設(shè)立空白對(duì)照組。采用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞miR-373-3p mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，CCK-8法檢測(cè)培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)細(xì)胞增殖活力，細(xì)胞劃痕和Transwell小室試驗(yàn)檢測(cè)培養(yǎng)24、48 h時(shí)細(xì)胞遷移能力。結(jié)果成功構(gòu)建了人miR-373-3p低表達(dá)慢病毒載體。與空白對(duì)照組和空載病毒組比較，miR-373-3p組miR-373-3p相對(duì)表達(dá)量低，培養(yǎng)48、72、 96 h HEC-1A細(xì)胞增殖活力均降低 (P均<0.05)，24、48 h HEC-1A細(xì)胞劃痕面積遷移率低， 24 h穿膜細(xì)胞數(shù)少(P均<0.05)。 空載病毒組及空白對(duì)照組各指標(biāo)比較，P均>0.05。結(jié)論成功構(gòu)建了人miR-373-3p低表達(dá)慢病毒載體，miR-373-3p低表達(dá)可抑制人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A的增殖、遷移能力。

子宮內(nèi)膜癌；HEC-1A細(xì)胞；微小RNA;miRNA-373-3p；慢病毒載體；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道三大常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率較高， 嚴(yán)重威脅女性生命健康[1]。目前子宮內(nèi)膜癌的治療以手術(shù)為主, 但臨床預(yù)后差，5年生存率低,尋找有效的早期診斷指標(biāo)成為腫瘤治療的熱點(diǎn)。microRNA(miRNA)是生物體內(nèi)一段長(zhǎng)18～25 nt非編碼小分子單鏈RNA，通過(guò)與目的基因mRNA 的3′端特異性地堿基配對(duì),引起目的 mRNA 的直接降解或抑制其翻譯，從而對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)發(fā)揮重要調(diào)控作用[2]。研究結(jié)果表明，miRNA參與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移形成過(guò)程[3]。miR-373最早由Voorhoeve提出，在睪丸精原細(xì)胞瘤作為癌基因被發(fā)現(xiàn)[4]。miR-373在乳腺癌、食管癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、T細(xì)胞淋巴瘤等腫瘤中均有異常表達(dá)，與癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5～8]，但是有關(guān)miR-373在子宮內(nèi)膜癌中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。2016年9月～2017年6月，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建具有抑制作用的miR-373-3p慢病毒載體，觀察miR-373-3p低表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞增殖和遷移的影響,為進(jìn)一步研究miR-373-3p在人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A中的機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 293T細(xì)胞株、人子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)； 感受態(tài)細(xì)胞DH5α(天根生化科技有限公司)；慢病毒載體GV280和包裝質(zhì)粒pHelper1.0、pHelper2.0 (上海吉?jiǎng)P基因公司)；T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶AgeI、EcoRI (NEB 公司)；TaqDNA聚合酶( Vazyme公司)，DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒(QIAGEN 公司)；Lipofectamine2000(美國(guó)Invitrogen公司)；TRIzol試劑、熒光定量PCR試劑盒(Takara公司)；CCK-8(日本同仁公司)；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)。

1.2 miR-373-3p目的片段的擴(kuò)增 根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)提供的has-miR-373-3p基因序列(MIMAT0000726)，使用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)人pre-miRNA-373-3p inhibitor的PCR引物，引物由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司合成。上游引物(含AgeI 酶切序列)：5′-AATTCAAAAAGAAGTGCTTCGATTTTGGGGTGT-3′,下游引物(含EcoRI 酶切序列)：5′-CCGGACACCCCAAAATCGAAGCACTTCTTTTTg-3′,以含有目的序列的DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:98 ℃ 5 min、98 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán); 72 ℃ 延伸 8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收目的基因片段。

1.3 miR-373-3p慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 將純化回收的 PCR 產(chǎn)物經(jīng)AgeI 和EcoRI雙酶切后再次回收獲得 pre-miRNA-373-3p inhibitor片段，與線性化載體 GV280以2∶1摩爾比例使用T4連接酶4 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸埃希菌 DH5α，挑選的克隆菌落經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子后進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。序列正確的重組慢病毒載體命名為 GV280-pre-miRNA-373-3p inhibitor。

1.4 重組慢病毒的包裝和滴度測(cè)定 胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，以細(xì)胞密度為5×106/15 mL接種于10 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h待細(xì)胞密度達(dá) 70%～80% 時(shí)轉(zhuǎn)染。將慢病毒表達(dá)質(zhì)粒和 pHelper1.0、pHelper2. 0包裝質(zhì)粒在Lipofectamine 2000作用下共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)6 h換液，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞上清液，4 ℃、4 000×g 離心 10 min，除去細(xì)胞碎片，經(jīng)過(guò)濾純化后分裝凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩２捎脽晒夥y(cè)定病毒滴度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293T細(xì)胞接種于96孔板，每孔4×104個(gè)，將慢病毒原液呈10的倍數(shù)稀釋成10個(gè)階梯后感染細(xì)胞。72 h后觀察綠色熒光的表達(dá)情況，根據(jù)細(xì)胞熒光表達(dá)情況計(jì)算病毒滴度。計(jì)算公式：病毒滴度(Tu/mL)=熒光細(xì)胞數(shù) / 病毒原液量。

1.5 HEC-1A細(xì)胞miR-373-3p表達(dá)水平檢測(cè) 采用RT-PCR法。將HEC-1A細(xì)胞懸液按1×105/孔接種于6孔板中，次日待細(xì)胞融合度達(dá)30%時(shí)，將重組慢病毒(miR-373-3p組)及相應(yīng)空載慢病毒(空載病毒組)以感染復(fù)數(shù)(MOI)30感染HEC-1A 細(xì)胞，并設(shè)立空白對(duì)照組，加入5 μL/mL ploybrene增強(qiáng)感染，培養(yǎng)12 h 更換新鮮培養(yǎng)基。72 h后通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況判斷感染效率。收集各組細(xì)胞，使用 TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，按 miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將其反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。以U6為內(nèi)參，RT-PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，重復(fù) 40個(gè)循環(huán)。用 2-ΔΔCt法計(jì)算各組miR-373-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.6 HEC-1A細(xì)胞增殖活力的檢測(cè) 采用CCK-8法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEC-1A細(xì)胞，胰酶消化接種于96孔板,每孔種約3 000個(gè)細(xì)胞(100 μL)，設(shè)置空白對(duì)照組、空載病毒組和miR-373-3p組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h向各孔中加入CCK-8溶液10 μL,37 ℃下孵育1 h,使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度(OD值),并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7 HEC-1A細(xì)胞遷移能力的檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕和Transwell小室試驗(yàn)。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)：取HEC-1A細(xì)胞消化后按5×104/孔接種于96孔板中。過(guò)夜后, 用槍頭比著直尺垂直劃線，用PBS沖洗2遍后, 加入無(wú)血清培養(yǎng)基。分別于0、24、48 h顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞遷移情況。采用image-Pro plus 6.0軟件測(cè)量圖片劃痕區(qū)域的像素并定量分析劃痕面積遷移率，劃痕面積遷移率=(24、48 h劃痕區(qū)域像素-0 h劃痕區(qū)域像素)/0 h劃痕區(qū)域像素。Transwell小室：收集轉(zhuǎn)染miR-373-3p后的細(xì)胞,以1×104/ 孔接種于Tranwell小孔中。小孔上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液200 μL,下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基600 μL。培養(yǎng)24 h后用棉簽輕輕擦去小孔上室內(nèi)細(xì)胞,甲醇固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色30 min。顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)200倍視野并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒表達(dá)載體測(cè)序鑒定 重組慢病毒質(zhì)粒經(jīng) PCR 及測(cè)序鑒定，DNA測(cè)序結(jié)果表明插入的目的片段與miRBase中的序列一致，證實(shí)GV280-pre-miRNA-373-3p inhibitor慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 慢病毒滴度及慢病毒感染HEC-1A細(xì)胞的效率 慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，48 h后熒光顯微鏡下觀察 293T 細(xì)胞可見(jiàn)GFP綠色熒光。慢病毒 GV280-pre-miRNA-373-3p inhibitor病毒滴度約 6×108TU/mL，空載慢病毒滴度約4×108TU/mL。用重組慢病毒和相應(yīng)空載病毒感染 HEC-1A細(xì)胞72 h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染效率達(dá)85%以上。慢病毒成功感染目標(biāo)細(xì)胞。

2.3 各組miR-373-3p的表達(dá) 空白對(duì)照組、空載病毒組、miR-373-3p組的miR-373-3p相對(duì)表達(dá)量分別為1.0±0.04、1.12±0.22、0.28±0.08。與空白對(duì)照組和空載病毒組相比，miR-373-3p組分別下降72%和75%(P均<0.05)，而空白對(duì)照組和空載病毒組比較，P>0.05。

2.4 各組HEC-1A細(xì)胞增殖活力比較 與空白對(duì)照組和空載病毒組相比, miR-373-3p組在培養(yǎng)48、72、 96 h細(xì)胞增殖活力均降低 (P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間細(xì)胞增殖活力比較

2.5 各組細(xì)胞遷移能力比較 轉(zhuǎn)染24 h后，空白對(duì)照組、空載病毒組、miR-373-3p組HEC-1A細(xì)胞劃痕面積遷移率分別為0.19±0.22、0.23±0.01、0.09±0.01，48 h后分別為 0.32±0.03、0.34±0.03、0.16±0.07。24、48 h HEC-1A細(xì)胞劃痕面積遷移率低于空白對(duì)照組和空載病毒組(P均>0.05)，而空白對(duì)照組與空載病毒組比較，P>0.05?？瞻讓?duì)照組、空載病毒組、miR-373-3p組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(79.3±10.50)、(84.7±12.06)、(48.3±9.07)個(gè)/HP, 24 h后 miR-373-3p組穿膜細(xì)胞數(shù)少于空白對(duì)照組、空載病毒組 (P均<0.05) , 空白對(duì)照組與空載病毒組比較，P>0.05。

3討論

miRNAs 是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA片段，在基因表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮重要的分子調(diào)節(jié)作用，參與細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞調(diào)亡及血管生成等生理病理過(guò)程[9～11]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要調(diào)控作用，并與腫瘤的進(jìn)程密切相關(guān)。

miR-373是 miRNAs-371-372-373家族的成員之一，位于染色質(zhì)19q13.42上，作為癌基因或者抑癌基因，在多種腫瘤如乳腺癌、食管癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、T細(xì)胞淋巴瘤等組織中異常表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[5～8]。研究表明，miR-373在食管癌組織高表達(dá)，通過(guò)下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMP3水平促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[6]。在舌鱗狀細(xì)胞癌的研究中也發(fā)現(xiàn)，miR-373-3p通過(guò)抑制DKK1激活Wnt/B蛋白級(jí)聯(lián)信號(hào)通道，誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)了腫瘤轉(zhuǎn)移[12]。在胰腺癌中，血清中miR-373低表達(dá)與臨床預(yù)后不良顯著相關(guān)，且miR-373的表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)、分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此miR-373可能作為新的預(yù)測(cè)腫瘤的有效標(biāo)記物和腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[13]。miR-373也可作為抑癌的miRNA，Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-373作用于Rab22a減弱卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，從而發(fā)揮了抑癌基因的作用。miR-373能下調(diào)功能靶點(diǎn)CD44 與 TGFBR2 的表達(dá)發(fā)揮抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 遷移與侵襲作用，抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生[15]。多項(xiàng)研究表明，miR-373的異常表達(dá)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但是有關(guān)miR-373和子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系尚無(wú)報(bào)道。

我們前期研究用miRNA雜交芯片對(duì)子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行檢測(cè)，并采用qRT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌組織miR-373的表達(dá)較正常子宮內(nèi)膜組織明顯升高，提示miR-373可能是癌基因，與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。為了研究miR-373在子宮內(nèi)膜癌的作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建低表達(dá)miR-373-3p的慢病毒載體，經(jīng)雙酶切鑒定和DNA測(cè)序檢測(cè)正確后進(jìn)行慢病毒包裝及滴度測(cè)定。將構(gòu)建成功的miR-373-3p慢病毒感染HEC-1A細(xì)胞，經(jīng) RT-qPCR檢測(cè)感染后細(xì)胞中miR-373-3p表達(dá)量明顯下降，經(jīng)細(xì)胞生物功能檢測(cè)顯示, 低表達(dá)miR-373-3p明顯抑制了HEC-1A細(xì)胞的增殖和遷移能力。

綜上所述，本研究構(gòu)建的miR-373-3p低表達(dá)慢病毒載體能夠成功抑制子宮內(nèi)膜癌miR-373-3p的表達(dá)，低表達(dá)miR-373-3p的HEC-1A細(xì)胞增殖和遷移能力明顯受到抑制，為進(jìn)一步研究miR-373-3p在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的作用機(jī)制以及探索miR-373可能作為新靶點(diǎn)治療子宮內(nèi)膜癌的臨床新方法奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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ConstructionofmiR-373-3plentiviralvectorwithlowexpressionanditseffectonproliferationandmigrationofendometrialcancercelllineHEC-1A

LIMeiyi,XUHong,TANFeifei

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530022,China)

ObjectiveTo construct the lentiviral vector of human miR-373-3p with low expression and to explore its effects on the proliferation and migration of endometrial carcinoma cell line HEC-1A.MethodsPCR was used to amplify the target gene containing pre-miR-373-3p sequence, and we cloned it into GV280 vector with restriction enzymes to construct the GV280-pre-miR-373-3p inhibitor expression plasmid which was co-transfected with packaging plasmid into 293T cells. After viral packaging, the titer of virus was detected. Empty lentivirus (empty virus group) and recombinant lentivirus harboring miR-373-3p (miR-373-3p group) were employed to infect human HEC-1A cells, respectively, and the control group was set up. RT-PCR was used to determine the expression of miR-373-3p in HEC-1A cells. The cell proliferation was measured by CCK-8 assay at 24, 48, 72, and 96 h after culture, and the cell migration was detected by Scratch test and Transwell assay at 24 and 48 h.ResultsHuman miR-373-3p entiviral vector with lower expression was constructed successfully. Compared with the empty virus group and control group, the expression of miR-373-3p in the HEC-1A cells decreased, and cell migration decreased at 48, 72, and 96 h in the miR- 73-3p group (allP<0.05); HEC-1A cell scratch area mobility decreased, and the number of transmembrane cells decreased at 24 and 48 h (allP<0.05). No significant difference was found in the above parameters between the empty virus group and the control group (allP<0.05).ConclusionThe lentiviral vector containing miR-373-3p with low expression is successfully constructed, and low expression of miR-373-3p inhibits the cell proliferation and migration of endometrial cancer cells HEC-1A.

endometrial carcinoma; HEC-1A cells; microRNA; miRNA-373-3p; lentiviral vector; cell proliferation; cell migration

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.006

R737.33

A

1002-266X(2017)45-0020-04

廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(S201520)。

李美儀(1990-)，女，在讀碩士，主要研究方向?yàn)閶D科腫瘤的基礎(chǔ)研究。E-mail:1096234457@qq.com

徐紅(1961-)，女，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)閶D科疾病和婦科腫瘤診治。E-mail:nnxuhong@163.com

2017-09-19)