李佳佳，朱俊鋒，周黎黎，朱凱，張鳳，孫自敏，張競競

(1蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，安徽蚌埠233000;2安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院)

成人正常核型原發(fā)急性髓系白血病中TET2突變情況及臨床意義

李佳佳1，朱俊鋒1，周黎黎1，朱凱1，張鳳1，孫自敏2，張競競1

(1蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，安徽蚌埠233000;2安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院)

目的探討成人正常核型原發(fā)急性髓系白血病(AML)患者中TET2突變情況及其臨床意義。方法收集98例成人正常核型原發(fā)AML患者的骨髓標本，PCR擴增目的片段，然后進行直接測序檢測TET2突變情況，并探討TET2突變與AML患者臨床特征、療效及生存率的關系。結果23例AML患者出現(xiàn)TET2突變，且突變的白血病類型多為M2、M5型；與TET2野生型AML患者相比，TET2突變患者骨髓原始細胞、白細胞計數(shù)高，血小板計數(shù)低(P均<0.05)，且TET2突變型患者具有較短的總生存期；TET2突變型患者的年齡、性別、血紅蛋白、化療方案、化療療效、危險分層、FLT3-ITD和NPM1 突變與TET2野生型患者相比差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0．05)。結論成人正常核型原發(fā)AML患者中TET2突變發(fā)生率較高，與其預后差有關。

急性髓系白血病；TET2 突變；預后；成年人

急性髓系白血病(AML)是一種生物反應高度異質(zhì)性血液系統(tǒng)腫瘤，它的臨床表現(xiàn)具有較大的差異。預后分層是確定AML治療方案的重要手段。預后中等組大多具有正常核型，占AML患者50%左右。最近，歐洲白血病網(wǎng)絡(ELN)已證實，F(xiàn)LT3、NPM1及 CEBPA突變對預后有顯著影響，并納入風險分層。最新的研究中發(fā)現(xiàn)，如果AML中出現(xiàn)DNMT3A突變、IDH1/2、WT1基因突變、RUNX1基因及KIT突變提示AML預后不良[1～6]。TET2基因已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱門課題，在體內(nèi)可以促進DNA的去甲基化;TET2突變可以促進啟動子的甲基化，從而導致造血干細胞的異常增殖和分化，形成腫瘤[7]?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，TET2突變出現(xiàn)在慢性粒單核細胞白血病、骨髓增生異常綜合征(DMS)等疾病中[7]。但是TET2在AML中的意義尚不明確，因此，在本研究中，我們觀察了98例成人原發(fā)急性AML患者發(fā)生TET2突變的情況，并探討其突變患者的臨床特征、化療敏感度、生存時間等，從而為AML預后分層提供一定的參考意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年8月～2015年5月成人原發(fā)急性AML非M3患者98例，男60例、女44例，年齡18～68歲、平均44歲。患者均經(jīng)過骨髓細胞形態(tài)學(FAB分類標準)、免疫表型、染色體和融合基因檢查確診。染色體檢測為正常核型。

1.2 治療方法 <60歲AML患者進行標準的“3+7”方案的初始誘導治療(柔紅霉素/伊達比星+阿糖胞苷)?！?0歲老年患者，使用CAG(阿糖胞苷+阿糖胞苷+粒細胞集落刺激因子)的預激方案治療。28 d進行骨髓穿刺對化療反應進行評估。所有參與的患者在化療前給予書面知情同意書。療效標準：完全緩解(CR)：①臨床無白血病細胞浸潤所致的癥狀和體征，生活正?；蚪咏?。②血象：Hb≥100 g/L(男)，或≥90 g/L(女)，中性粒細胞絕對值≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L。外周血白細胞分類中無白血病細胞。③骨髓象：原始細胞+幼稚細胞≤5%。部分緩解(PR)：骨髓原始細胞+幼稚細胞>5%～20%；或臨床、血象中有一項未達完全緩解標準者。未緩解(NR)：骨髓原始細胞+幼稚細胞>20%?？偵嫫?OS)是從診斷到任何原因死亡的時間長度。對于無復發(fā)或死亡事件的患者隨訪研究，生存終點均為最后一次隨訪時間。

1.3 TET2基因突變的檢測 DNA抽提：抽取患者骨髓標本提取骨髓單個核細胞1.0×107個,用DNA 抽提試劑盒(上海申友公司產(chǎn)品)提取基因組 DNA。使用紫外分光光度儀測定吸光度A260nm /A280nm 值，確定產(chǎn)物DNA的濃度，然后使用去離子水稀釋基因組 DNA 樣品至 100 ng/μL。于-80 ℃冰箱保存。PCR反應：TET2 野生型PCR 引物序列：F：5′-ACGCTTGGAAGCAGGAGAT-3′；R：5′-CACAAGGCTGCCCTCTAGTT-3′；通過普通 PCR 擴增 TET2基因，PCR反應條件：PCR 體系為 MIX 20 μL，ddH2O 16 μL， 引物 2 μL和 DNA 模板2 μL。PCR 程序為 94 ℃ 預變性 3 min， 然后 94 ℃ 變性 30 s， 58 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸 1 min， 34 個循環(huán)， 最后 72 ℃ 延伸 10 min?；驕y序：將患者PCR 產(chǎn)物直接送至北京海思特臨床檢驗所或者天津血液病研究所進行二代測序，行FLT-3、NPM1、CEBPA、TET2基因突變檢測。用 Chromas 軟件分析測序結果。根據(jù)序列分析結果顯示的TET2 野生型 cDNA (GenBank Accessionnum ,NC_000004.12 )，確定患者TET2突變類型。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以中位數(shù)表示，比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料以頻次或百分比表示，比較采用χ2檢驗。生存曲線繪制采用Kaplan-Meier法，比較采用Log-Rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 原發(fā)急性AML患者中TET2基因的突變率 98例AML患者23例TET2編碼序列出現(xiàn)改變，突變最常出現(xiàn)的是外顯子部位蛋白的突變蛋白，12例突變出現(xiàn)于3號外顯子，3例于6號外顯子，2 例于7 號外顯子，6例于11號外顯子，突變發(fā)生率為23.47%(23/98)。

2.2 TET2突變與原發(fā)急性AML患者臨床和分子生物學特征之間的關系 98例原發(fā)急性AML患者按照TET2是否突變分為TET2突變組和TET2野生組。TET2突變組患者23例，男13例、女10例；<60歲18例，≥60歲5例；白細胞計數(shù)60.26×109/L(0.4×109/L～230×109/L)，血紅蛋白80.48 g/L(37～128 g/L), 血小板計數(shù)55.61×109/L(5×109/L～154×109/L)，骨髓原始細胞67.28%(10%～95%)；同時出現(xiàn)FLT-ITD突變者5例，無FLT-ITD突變者18例；同時出現(xiàn)NPM1突變者7例，無NPM1突變者16例。TET2野生組75例，男43例、女32例；<60歲64例，≥60歲11例；白細胞計數(shù)52.10×109/L(0.69×109/L～364.62×109/L)，血紅蛋白73.87 g/L(35～122 g/L), 血小板計數(shù)52.09×109/L(5×109/L～419×109/L)，骨髓原始細胞63.25%(20%～99%)；同時出現(xiàn)FLT-ITD突變者26例，無FLT-ITD突變者49例；同時出現(xiàn)NPM1突變者28例，無NPM1突變者47例。兩組年齡、血紅蛋白數(shù)、FLT-ITP突變、NPM1突變等比較，P均>0.05。與TET2野生組相比，TET2突變組骨髓原始細胞、白細胞計數(shù)高，血小板計數(shù)低(P均<0.05)，TET2突變組男性患者比例高于TET2野生組(P<0.01)。FAB分類中，TET2突變多發(fā)生在M2(7/23，30.53%)及M5(10/23,43.48%)。

2.3 TET2突變與原發(fā)AML患者化療療效之間的關系 隨訪終點為2015年5月31日或患者死亡時，中位隨訪時間 354 d(生存時間為13～1 632 d)。TET2突變組使用IA方案化療12例，DA方案化療6例，CAG方案化療5例；化療后CR 8例,PR 12例,NR 3例；OS均值為552 d。TET2野生組使用IA方案化療41例，DA方案化療23例，CAG方案化療11例；化療后CR 39例,PR 23例,NR 13例；OS均值396 d。兩組化療方案選擇及化療療效比較，P均>0.05。與TET2野生組相比，TET2突變組患者具有較短的OS(P=0.04)，但CR率高。

圖1 TET2野生型與突變型患者的生存曲線

2.4 TET2突變與AML患者NCCN預后危險分組之間的關系 根據(jù)AML患者的細胞遺傳學危險分層標準[1]，可以將AML分為預后良好、預后中等、預后不良三組；伴有inv(16)/t(16;16), t(8;21) 及 t(15;17)的AML為預后良好組；復雜核型, t(6;9), inv(3)/t(3;3),-5/del(5q)及-7/del(7q)視為預后不良組，其他為預后中等組。根據(jù)NCCN危險分組，98例AML患者中，低危組35例，CR 28例，OS 746 d；中危組31例，CR 11例，OS 463 d；高危組32例，CR 8例，OS 263 d。原發(fā)AML患者在低危組具有更長的OS，更高的CR率(P均<0.05)。98例原發(fā)AML患者中，低危組35例，TET2突變?yōu)?例；中危組31例，TET2突變?yōu)?0例；高危組32例，TET2突變?yōu)?例。3組TET2突變發(fā)生率比較，P>0.05。

3 討論

以往的研究多分析TET2基因突變對MDS、骨髓增殖性腫瘤及繼發(fā)性AML的影響[7,8]。很少報道TET2突變與原發(fā)AML之間的關系及在臨床中的意義。文獻[9,10]報道，原發(fā)性AML患者TET2突變?yōu)?7%和19%。本研究中在原發(fā)AML患者中TET2基因突變發(fā)生率為23.47%，可能與實驗中無68歲以上的AML患者有關，因為在其他試驗中發(fā)現(xiàn)TET2突變更易出現(xiàn)在中年患者。本試驗著眼于原發(fā)AML患者是因為現(xiàn)在越來越多的基因突變被應用于原發(fā)AML預測預后和分層治療[11～15]。我國正常核型的原發(fā)AML病例最為常見，發(fā)病率高達AML患者的45%，因此我們將研究對象定位為正常核型原發(fā)AML。本實驗發(fā)現(xiàn)，TET2基因突變與性別有關，男性TET2突變率更高，與文獻[15]報道一致；并且與高白細胞計數(shù)、低血小板計數(shù)及骨髓原始細胞數(shù)相關，提示TET2突變與預后不良有關。 Nibourel等[9]在研究TET2基因突變對原發(fā)AML患者預后的影響中發(fā)現(xiàn)，AML患者化療達到CR后，預后良好組與預后不良者的患者無病生存期與OS差異無統(tǒng)計學意義。在另一項研究[7]中，原發(fā)性或繼發(fā)性AML患者，出現(xiàn)TET2突變，會出現(xiàn)低OS。隨著越來越多的基因突變在原發(fā)AML被確定，分子遺傳學層面單基因的突變在AML預后預測中變得越來越重要。一個基因突變對于預后的影響可能取決于其他分子標志物存在或缺乏(如NPM1突變是有利的結果，特別FLT-ITD缺乏的情況下)。因此在制定相應的治療方案前進行一系列基因標記的檢測，從而確定危險分層是必不可少的。

按照NCCN分類方法，原發(fā)AML患者被分為三類：低危組(NPM1突變無FLT3-ITD或CEBPA突變)、中危組(所有剩余的CN-AML患者)及高危組(正常細胞遺傳學伴FLT-ITD突變)。為了檢驗TET2基因突變是否可用于這個被廣泛接受的分類方法，我們研究了其在按照NCCN風險分類的原發(fā)AML中的預后評估價值。低危組患者，如果出現(xiàn)TET2基因突變，與野生型TET2患者相比，具有較低的CR率，并有較高的死亡風險。提示TET2(可能WT1)突變可作為CN-AML分類方案的候選標志物。

總之，TET2突變在成人原發(fā)性CN-AML患者的發(fā)生率在20%以上，對于改進遺傳風險的分類方案是有意義的，尤其是預后分類。目前NCCN指南一般不建議預后良好組AML患者在第一次CR后進行骨髓移植治療。本研究結果表明，這些患者若出現(xiàn)TET2突變，如使用傳統(tǒng)的緩解后治療，即按照AML治療指南進行多療程化療可能效果不佳。提示如果患者出現(xiàn)TET2突變盡早應該進行臨床研究及骨髓移植。

本研究中缺乏70歲以上AML患者，此類患者具有骨髓增生低下、疾病發(fā)展相對緩慢、低白細胞的特點，使用地西他濱+CAG方案化療療效好。但是由于本地區(qū)經(jīng)濟相對落后，此類AML患者多不能堅持足療程化療，病例數(shù)較少，希望在以后的工作中能積累更多此類AML患者，研究TET2突變在此群組中的臨床意義。

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TET2mutationanditsclinicalsignificanceinadultnormalkaryotypeacutemyeloidleukemia

LIJiajia1,ZHUJunfeng,ZHOULili,ZHUKai,ZHANGFeng,SUNZimin,ZHANGJingjing

(1TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233000,China)

ObjectiveTo investigate the TET2 mutation and its significance in patients with acute myeloid leukemia (AML).MethodsThe bone marrow samples from 98 patients with newly diagnosed AML were collected. The target fragments were amplified by polymerase chain reaction (PCR). Then, TET2 mutations were detected by direct sequencing, and we explored the relationships between the TET2 mutation and the clinical features, efficacy, and survival rate of AML patients.ResultsTwenty-three patients had TET2 mutations (23.46%). M2 and M5 were the main mutant types.Comparedwith the TET2 wild type group, the number of primitive cells, peripheral blood leukocyte count, and blood platelet count were lower in the TET2 mutant group (allP<0.05), and the TET2 mutant patients had a poor overall survival rate. No significant difference was found in the age, sex, hemoglobin, chemotherapy regimen, chemotherapy efficacy, risk stratification, FLT3-ITD, and NPM1 mutations between the TET2 wild type group and TET2 mutant group (allP>0.05).ConclusionThe incidence rate of TET2 mutation is higher in AML patients, which is related to the poor prognosis of patients.

acute myeloid leukemia; TET2 mutation; prognosis; adults

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.005

R733.7

A

1002-266X(2017)45-0016-04

安徽省高等學校自然科學研究一般項目(KJ2015B88by)；蚌埠醫(yī)學院院級課題基金(BYKY1470)。

李佳佳(1983-)，女，碩士，主要從事血液病的診治研究。E-mail:4119469@qq.com

張競競(1981-)，女，講師，主要從事血液腫瘤學研究。E-mail:zjjahbb@163.com

2017-09-18)