王澤亮, 鄭永琴, 蘇 玲, 劉 青, 余明忠

(1. 四川省林業(yè)科學研究院, 四川 成都 610081; 2. 四川省洪雅縣林場, 四川 洪雅 620364;3.南充市林業(yè)科學研究所，四川 南充 637099；4. 四川省茂縣林業(yè)局, 四川 茂縣 623200)

滇榛(Corylus yunnanensis)SSR引物的篩選

王澤亮1, 鄭永琴2*, 蘇 玲3, 劉 青1, 余明忠4

(1. 四川省林業(yè)科學研究院, 四川 成都 610081; 2. 四川省洪雅縣林場, 四川 洪雅 620364;3.南充市林業(yè)科學研究所，四川 南充 637099；4. 四川省茂縣林業(yè)局, 四川 茂縣 623200)

滇榛是我國西南地區(qū)的一個重要榛屬資源，本文成功篩選到滇榛9個SSR標記，并對滇榛群體遺傳多樣性與遺傳結構進行了初步分析，結果顯示滇榛群體具有中等程度的遺傳多樣性與遺傳分化，這為滇榛遺傳改良研究奠定了基礎，也有助于推動本地區(qū)榛屬資源的保護與可持續(xù)利用。

滇榛；川榛；簡單序列重復；遺傳多樣性

榛屬(CorylusL)植物，屬樺木科(Batulaceae)，為落葉灌木或小喬木，全屬約有20余種。榛子，與核桃、腰果、仁用杏，并稱世界“四大堅果”，含有豐富的微量元素，營養(yǎng)價值高，除了可直接食用外，還廣泛用于巧克力、糖果、奶制品、焙烤食品中。

榛屬植物原產于北溫帶，中國有7個種、3個變種，主要分布于我國東北、華北、西北和西南地區(qū)[1]。其中，滇榛(C.yunnanensis)主要分布于四川西部及西南部、云南中部、西部及西北部、以及貴州西部等地區(qū)海拔 2 000 m～3 700 m的山坡上[1]，由于其根部萌生特性極易形成連片灌叢，是山地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。我國自上世紀70年代開始了歐榛引種選育、平榛良種選育以及平榛與歐榛的種間雜交育種研究，并陸續(xù)選育了一系列優(yōu)良品種，目前已開始在東北、華北以及西北地區(qū)推廣[2～3]。然而，滇榛資源尚未有人工利用的報道。

為了有效的開發(fā)利用滇榛資源，需要明晰其群體遺傳基礎。SSR(Simple Sequence Repeat，簡單重復序列)分子標記由于具有分布廣泛、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定、共顯性、DNA模版用量少、檢測快速、結果分析容易以及適合自動化分析等優(yōu)點，而被廣泛應用于植物群體遺傳多樣性與遺傳結構研究方面[4～7]。榛屬植物研究中使用的SSR(Simple sequence repeat，簡單序列重復)標記是由美國俄勒岡州立大學Mehlenbacher實驗室首先開發(fā)利用的，該實驗室構建了3個歐榛微衛(wèi)星富集文庫(GAA、CA、GA)，在初始的研究中，Bassil等(2003)從文庫中篩選了53個多態(tài)性位點[8]，隨后，2005年又分別有8個、18個、25個位點被鑒定用于歐榛遺傳多樣性分析，并成功進行了榛屬種間的擴增[9～12]。到目前為止，從上述3個富集文庫中，已有超過200個SSR位點被鑒定出來，并廣泛應用于榛子遺傳多樣性、遺傳結構分析及遺傳圖譜構建等。在國內，SSR標記被用于了平榛、毛榛等榛屬種質資源的遺傳多樣性、群體結構及親緣關系研究方面，并指導了進一步的榛子遺傳改良[13～15]。

本研究從歐榛SSR標記中篩選滇榛適用的SSR引物，以期開展滇榛自然群體遺傳多樣性與遺傳結構研究，以進行進一步的滇榛選育與雜交育種。

1 材料與方法

1.1 材料

滇榛材料采集于四川省涼山州，包括冕寧、鹽源、木里、喜徳各5份、總共20份材料。調查時，采集新鮮葉片，變色硅膠干燥保存。

1.2 方法

使用Tiangen植物基因組提取試劑盒(DP305)提取滇榛基因組DNA。SSR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，其中上游引物添加FAM熒光標記。PCR擴增使用Takara Taq 聚合酶(Takara, Dalian, China) ，20 μL反應體系包括： 13.85 μL ddH2O, 2.0 μL 10× buffer, 2.0 μL 2.0 mM dNTP, 0.5 μL of each primer (at 10 μM), 1 μL基因組DNA模版(30 ng～50 ng)， and 0.75 U Taq DNA聚合酶。擴增程序如下: 94 ℃預變性5 min；94 ℃變性20 s，退火溫度退火20 s，72 ℃延伸40 s，25個～30個循環(huán)；72 ℃延長5 min，4 ℃保存。

退火溫度遵循文獻中的數據，若凝膠電泳結果不佳，則再在50℃～60℃范圍進行調整直至擴增得到清晰產物。PCR產物首由北京睿博興科生物技術有限公司進行毛細管熒光電泳分型，采用儀器為ABI 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)，SSR片段長度由軟件GeneMarke version 2.2.0 (SoftGenetics, USA)判讀。

SSR分型數據首先利用Excel2007整理整合，然后采用GenAlEx6.502軟件計算遺傳參數[16]。

2 結果與分析

本文從已發(fā)表文獻中選擇了12對歐榛引物進行滇榛SSR引物的篩選，結果成功獲得9對滇榛適用的SSR引物(表1)。利用這9對引物，初步分析了參與引物篩選的4個滇榛群體的遺傳多樣性，結果見表2、3。

表1 SSR引物序列特征

Tab. 1 Characterization of 9 SSR primers in C. yunnanensis

表2基于SSR位點的遺傳參數

Tab. 2 Genetic statistics of 9 SSR loci in C. yunnanensis populations

注： Na：等位基因數；Ne：有效等位基因數；I：Shannon’s 信息指數；Ho：觀察雜合度；He：期望雜合度；Fis：群體內近交系數；Fit：群體總近交系數； Fst：群體間遺傳分化系數；Nm：基因流

表3滇榛群體遺傳多樣性

Tab. 3 Genetic diversity ofC.yunnanensispopulations

群體NNaNeIHoHeP(%)A冕寧54.0002.9561.0990.6000.56488.89E鹽源53.2222.3270.8970.5780.496100.00F木里53.3332.5740.9580.4670.531100.00G喜徳54.1112.9551.0690.6670.538100.00均值53.6672.7031.0060.5780.53297.22

注： N：群體個體數； P：多態(tài)性位點百分率；其余同表2

在總群體中，9對引物總共篩選到58個等位基因，每個位點平均等位基因數為6.444，平均有效等位基因數為3.314，引物Ch01檢測到的等位基因數最多，為11個，而Ch08與Ch10檢測到的最少，分別為3個。在總群體中，多態(tài)性位點的比率為100%，而在4個分群體中，9個位點在鹽源、木里、喜徳群體中多態(tài)性比率為100%，在冕寧群體中，僅有Ch08為單態(tài)性的位點。

有效等位基因數和雜合度是目前廣泛應用的群體遺傳多樣性指標，同時雜合度也反映群體等位基因分布的豐富度和均勻程度[17]。在檢測的4個群體中，有效等位基因數介于2.327～2.956，均值2.703，觀察雜合度介于0.467～0.667，均值0.578，期望雜合度變動于0.496～0.564之間，平均為0.532。Shannon’s信息指數也是反映遺傳多樣性的綜合性指標，4個群體的Shannon’s信息指數范圍為0.897～1.099，平均為1.006?？傮w來說，檢測的4個滇榛群體的遺傳多樣性處于中等水平，且冕寧群體多樣性水平稍高，而鹽源群體遺傳多樣性水平稍低，但整體差異不大。

遺傳分化系數(Fst)是衡量群體間分化程度的指標，根據表2中9個SSR位點分析結果，滇榛群體Fst均值為0.0871，說明8.71%的遺傳變異存在于群體間，91.29%的遺傳變異存在于群體內，群體內的變異是滇榛遺傳變異的主要來源。根據Wright的建議，FST值為0～0.05、0.05～0.15、0.15～0.25和大于0.25分別代表群體間的遺傳分化很小、中等、較大和很大[18]，基于此，我們認為滇榛群體間的遺傳分化處于中等水平。與群體間遺傳分化程度中等相一致，滇榛群體間的基因流較高，均值為3.6282。通常認為當Nm > 1時，可以防止群體間由于遺傳漂變引起的分化[19]，9個SSR位點在滇榛群體間的基因流值遠大于1，說明群體間的基因流動較多，也表明滇榛群體不易因遺傳漂變而引起遺傳分化。同時從群體平均值上來說，觀察雜合度(Ho=0.578)高于期望雜合度(He=0.532)，也表明滇榛群體雜合子過剩，群體間有足夠的基因交流，而且差值較小，說明群體接近理想狀態(tài)的自由交配。這一點也為哈代-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg)檢測證實，通過卡方檢驗，在4個群體36個位點中有32個位點符合HW平衡狀態(tài)(P>0.05)。

當然目前對滇榛群體的分析，僅僅是基于較少群體與個體，要獲得更準確的結果需要加入更多群體以及每個群體更多的個體。

3 討論

四川是榛子資源的一個重要分布區(qū)，盡管不同文獻記述稍有差異，但國內大部分榛子自然資源在該地區(qū)均有分布，其中可能具有商品開發(fā)價值的包括滇榛、黔榛(C.kweichowensis)、川榛(黔榛、川榛被認為是平榛(C.heterophylla)的兩個變種，而梁維堅等則認為川榛可單獨作為1種)[1,3,20]，分布在阿壩州、涼山州、甘孜州等地區(qū)，由于這些地區(qū)獨特的氣候與地理環(huán)境，很可能孕育了適應于四川地域的優(yōu)良的種質資源，目前國內外僅有少量研究將川榛、滇榛作為試驗材料的一部分[15,21～22]，而黔榛目前還未有涉及，因此為了有效的利用這些資源，需要對其開展系統(tǒng)深入的遺傳基礎研究。另一方面，滇榛、川榛、黔榛分布地區(qū)有重疊，分類地位也有一定爭議，需要進一步研究；同時一般認為滇榛、平榛、川榛與黔榛的重要形態(tài)區(qū)別為小枝、葉柄、葉背、果苞是否被毛、葉片形態(tài)、葉柄長度以及果苞長度等，僅從形態(tài)上進行區(qū)分可能會有差錯，是否可以篩選種或變種特異的分子標記？

本文從歐榛SSR引物中篩選到9對滇榛SSR引物，并成功對滇榛群體遺傳多樣性進行了初步分析，這些標記可有效的用于滇榛群體遺傳多樣性與遺傳結構研究，同時也可深入應用于滇榛、平榛、川榛與黔榛的分類研究與區(qū)分上。通過這些研究，將有助于推動省內榛子種質資源遺傳改良、保護及可持續(xù)利用。

[1] 匡可任, 李沛瓊, 鄭斯緒，等. 中國植物志(21卷)[M]. 北京: 科學出版社, 1979, 46～55.

[2] 王澤亮, 馮桂英, 黃洋，等. 榛屬植物遺傳基礎研究進展[J]. 四川林業(yè)科技, 2014, 35(6): 22～26.

[3] 張宇和,柳鎏,梁維堅，等. 中國果樹志板栗榛子卷[M]. 北京: 中國林業(yè)出版社, 2005, 193～217.

[4] 李永強, 李宏偉, 高麗鋒，等. 基于表達序列標簽的微衛(wèi)星標記 (EST-SSRs) 研究進展[J]. 植物遺傳資源學報, 2004, 5(1): 91～95.

[5] 趙海燕, 渠云芳, 黃晉玲，等. SSR分子標記在棉花遺傳育種中的應用及進展[J]. 中國農學通報, 2009, 25(22): 57～61.

[6] Iwaizumi MG, Tsuda Y, Ohtani M，et al. Recent distribution changes affect geographic clines in genetic diversity and structure ofPinusdensifloranatural populations in Japan[J]. Forest Ecol Manag, 2013, 304: 407～416.

[7] Mandák B, Hadincová V, Mahelka V，et al. European invasion of north AmericanPinusstrobusat large and fine scales: high genetic diversity and fine-scale genetic clustering over time in the adventive range[J]. Plos One, 2013, 8(7): e68514.

[8] Bassil NV, Botta R, Mehlenbacher SA. Microsatellite markers of the european hazelnut[J]. HortScience, 2003, 38(5): 740～741. (Abstr)

[9] Bassil NV, Botta R, Mehlenbacher SA. Microsatellite markers in the hazelnut: isolation, characterization and cross-species amplification inCorylus[J]. J Am Soc Hort Sci, 2005, 130, 543～549.

[10] Boccacci P., Akkak A., Bassil, N.V. et al. Characterization and evaluation of microsatellite loci in European hazelnut (CorylusavellanaL.) and their transferability to otherCorylusspecies[J]. Mol Ecol Notes, 2005, 5: 934～937.

[11] Bassil NV, Botta R, Mehlenbacher SA. Additional microsatellites of the European hazelnut[J]. Acta Horticulturae, 2005, 686: 105～110.

[12] G?kirmak T, Mehlenbacher SA, Bassil NV. Investigation of genetic diversity among European hazelnut (Corylus avellana) cultivars using SSR markers[J]. Acta Horticulturae, 2005, 686: 141～149.

[13] 王艷梅, 劉震, 馬天曉，等. 平榛居群結構與遺傳多樣性的初步分析[J]. 河南農業(yè)大學學報, 2009, 43(5): 497～500, 505.

[14] 李修平, 李秀霞, 王仲，等. 利用歐榛SSR標記分析榛屬親緣關系的研究[J]. 東北農業(yè)大學學報, 2011, (4): 129～136.

[15] 王艷梅, 蘇淑釵, 翟明普，等. 中國榛屬植物遺傳關系的SSR分析[J]. 東北林業(yè)大學學報, 2008, 36(11): 48～51.

[16] Peakall R, Smouse PE. GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research[J]. Mol Ecol Notes, 2006, 6(1): 288～295.

[17] 王滑, 郝俊民, 王寶慶，等. 中國核桃8個天然居群遺傳多樣性分析[J]. 林業(yè)科學, 2007, 43(7): 120～124.

[18] Wright S. Variability within and among natural populations[M]. University of Chicago Press, 1978, 439～459.

[19] Wright S. Evolution in Mendelian populations[J]. Genetics, 1931, 16(2): 97～159.

[20] 四川植物志編輯委員會. 四川植物志(21卷)[M]. 成都: 四川科學技術出版社, 2012, 2～13.

[21] 王艷梅, 翟明普, 馬天曉，等. 榛屬7種植物與虎榛微衛(wèi)星測序及分析[J]. 華中農業(yè)大學學報, 2009, 28(1): 5～10.

[22] 王艷梅, 蘇淑釵, 翟明普，等. 中國榛屬植物SSR反應體系的建立[J]. 華中農業(yè)大學學報, 2007, 26(5): 689～692.

ScreeningofSSRMarkersinCorylusyunnanensis

WANG Ze-liang1ZHENG Yong-qin2*SU Ling3LIU Qing1YU Ming-zhong4

(1. Sichuan Academy of Forestry, Chengdu 610081, Sichuan, China; 2. Hongya Tree Farm, Hongya 620364, Sichuan, China; 3. Nanchong Institute of Forestry,Nanchong 637099,China;4. Forestry Bureau of Maoxian County, Maoxian 623200, Sichuan, China)

C.yunnanensisis an important species of GenusCorylusin southwest China. In this paper, nine SSR markers were successfully characterized and were used to analyze the population genetic diversity and structure ofC.yunnanensis, showing a moderate degree of genetic diversity and differentiation. And all these established the foundation of genetic improvement inC.yunnanensis, and helped to effectively preserve and utilize the germplasm resources of genusCorylus.

C.yunnanensis，C.heterophyllavar.sutchuenensis，SSR，Genetic diversity

2017-07-20

四川省公益性科研院所基本科研項目“榛子優(yōu)良種質資源調查收集與區(qū)域栽培試驗”與“四川榛子種質資源遺傳多樣性研究”。

王澤亮(1978-)，男，博士，副研究員，主要從事林木遺傳育種研究，E-mail：wzl-020304@163.com。

*并列第一作者

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.06.014

S664.4

A

1003-5508(2017)06-0055-04