王曉玲,唐麗萍,范 雨,羅曉波,曾德剛

(1.涼山州勞動職業(yè)技術(shù)學校，四川 西昌 615000；2. 四川師范大學 生命科學學院，四川 成都 610101；3.四川省自然資源科學研究院，四川 成都 610015；4.涼山州農(nóng)業(yè)學校，四川 西昌 615000)

紅顏草莓莖尖組織培養(yǎng)的器官發(fā)生途徑研究

王曉玲1,唐麗萍2,范 雨2,羅曉波3*,曾德剛4

(1.涼山州勞動職業(yè)技術(shù)學校，四川 西昌 615000；2. 四川師范大學 生命科學學院，四川 成都 610101；3.四川省自然資源科學研究院，四川 成都 610015；4.涼山州農(nóng)業(yè)學校，四川 西昌 615000)

為探究紅顏草莓莖尖組培苗器官再生途徑，以其莖尖為外植體進行組織培養(yǎng)，觀察其器官再生過程中的形態(tài)學和解剖學變化特點。結(jié)果表明：紅顏草莓莖尖離體再生的芽原基起源于莖尖形態(tài)學上端表皮層的薄壁細胞，屬外起源；表皮層的薄壁細胞先分化形成芽原基，隨后芽原基周圍的皮層薄壁細胞再分化出葉原基；芽原基和葉原基共同發(fā)育形成不定芽；不定芽再生途徑為器官型。不定芽基部組織受激素誘導于形成層分化出根原基，同時不定芽基部表皮層細胞也可分化出根原基。故不定根外起源方式既有內(nèi)起源也有外起源，但不定根都屬于誘生根原基。不定芽和不定根中的輸導組織將整個組培苗連接成一個整體，形成完整植株。

紅顏；組織培養(yǎng)；器官發(fā)生途徑；解剖學

草莓(Fragariaananassa.Duch)是薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)多年生常綠雙子葉草本植物[1]，其果實富含維生素、類胡蘿卜素、鞣花酸、葉酸、酚類等生物活性物質(zhì)[2,3],常采用無性繁殖方法進行繁殖。但無性繁殖方法存在繁殖速度慢，品種易退化、易感染病毒、易生病蟲害等問題，從而導致草莓產(chǎn)量下降，優(yōu)良品種不易推廣。組織培養(yǎng)技術(shù)可快速、有效繁殖優(yōu)良草莓品種，解決無性繁殖存在的弊端，從而滿足規(guī)?；a(chǎn)需求。目前草莓的組織培養(yǎng)研究主要集中在草莓不同外植體的選擇(包括葉片、莖尖、花藥、離體胚、原生質(zhì)體、體細胞等)、外源激素種類和濃度的選擇，解決褐化、污染、玻璃化等問題方方面[4～6]。很多學者就次此進行了深入研究，并且取得了一定的成果。但目前未發(fā)現(xiàn)有研究者對草莓莖尖離體器官的形態(tài)發(fā)生途徑進行研究。

本研究以草莓莖尖為外植體進行組織培養(yǎng)，并運用形態(tài)學觀察和解剖學方法對草莓組培苗器官發(fā)生途徑進行研究，目的在于揭示草莓莖尖離體培養(yǎng)器官發(fā)生途徑和植株再生規(guī)律；探索草莓植株高效再生的培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件；用于指導草莓種苗生產(chǎn)；同時也為研究出草莓屬植物離體再生規(guī)律提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以草莓品種紅顏莖尖為外植體，紅顏草莓釆自涼山州德昌縣。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒

選取2 cm左右生長良好、健壯、無病蟲害的紅顏草莓匍匐莖的頂芽，先用1%的洗衣粉水清洗一次，再用流動自來水沖洗30 min。在超凈工作臺中，用0.1%Hgcl2消毒4 min～6 min，無菌水沖洗5次，剝?nèi)?.5 cm健康莖尖作為外植體。

1.2.2 紅顏草莓組織培養(yǎng)

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加不同種類和濃度的外源激素，每個配方都添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為6.8。以不定芽培養(yǎng)基誘導不定芽，以生根培養(yǎng)基誘導不定芽生根(見表1)。

表1 紅顏草莓莖尖組織培養(yǎng)配方

注：1/2MS指大量元素減半，其他元素不變。

1.2.3 形態(tài)學和解剖學觀察

從莖尖接入培養(yǎng)基開始,每兩天觀察一次外植體形態(tài)變化，當外植體形態(tài)變化后每天觀察一次。在整個組織培養(yǎng)過程中每隔2 d取相應組織做石蠟切片以研究紅顏草莓莖尖組織培養(yǎng)的器官發(fā)生途徑。切片用Leica DM 3000顯微鏡進行觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導分化不定芽

2.1.1 不定芽形成的形態(tài)學觀察

紅顏草莓莖尖在不定芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d左右開始膨大、增厚，彎曲，表明切口處的細胞已經(jīng)開始增殖分化。繼續(xù)培養(yǎng)，莖尖上可分化出嫩綠色的突起，逐漸形成幼芽(見圖1A)，持續(xù)培養(yǎng)幼芽增多(見圖1B)。將幼芽轉(zhuǎn)接到不定芽培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)15 d左右，少量幼芽快速、大量增殖形成簇狀不定芽(見圖1C)。簇狀不定芽繼續(xù)分株轉(zhuǎn)接到不定芽培養(yǎng)基中，20 d左右可得到高3 cm左右的無根組培苗(見圖1D)。

圖1 誘導莖尖分化不定芽的形態(tài)學變化A：莖尖萌發(fā)；B-C：不定芽；D：組培苗

2.1.2 不定芽形成的解剖學特征

紅顏草莓莖尖形態(tài)學上端的表皮及其內(nèi)側(cè)的幾層薄壁細胞首先脫分化恢復分裂能力，先進行平周分裂增加細胞層數(shù)，再同時進行平周分裂與垂周分裂從而在表皮處分化出芽原基(見圖2A)。芽原基形成后，芽原基周圍的表皮細胞分化出葉原基(見圖2B)。芽原基和葉原基處的細胞染色較深，細胞質(zhì)稠密，細胞形態(tài)無規(guī)則，細胞體積小，細胞核大，無液泡，還可觀察到正在進行有絲分裂的細胞(見圖4A)。芽原基和葉原基可發(fā)育為不定芽，在不定芽“芽體”旁邊還可繼續(xù)分化出新的芽原基和葉原基(見圖2C，圖3：A-B)。

圖2 芽原基分化的顯微結(jié)構(gòu)A：芽原基；B:葉原基；C：不定芽；bp：芽原基；lp：葉原基，ab：不定芽；al：不定葉

不定芽中存在大量的維管組織(見圖4B-C)，這些維管組織為不定芽的快速增殖和生長提供了必須的營養(yǎng)物質(zhì)。正是由于在適宜的條件和外源激素的刺激，才能誘導紅顏草莓莖尖大量形成不定芽，不定芽成簇狀存在(見圖1B-C)。同時也說明紅顏草莓莖尖在誘芽培養(yǎng)基中誘導獲得的不定芽是正常的。

2.2 誘導分化不定根

2.2.1 根形成的形態(tài)學觀察

無根組培苗在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周左右后，在無根組培苗基部的組織塊上可形成突起(見圖5A-B)，培養(yǎng)到25 d左右，組培苗基部形成大量不定根(見圖5C-D)。

圖3 不定芽顯微結(jié)構(gòu)A-B：不定芽；ms：分生組織；al：不定葉bp：芽原基

圖4 芽原基細胞特點和不定芽中的輸導組織A：芽原基細胞特點；B：不定葉中的維管束；C：不定芽中的維管束；pd：表皮；mc：分生細胞，vb：維管束

圖5 不定根發(fā)育過程的形態(tài)學變化

2.2.2 根形成的解剖學特征

從組培苗生根途徑的解剖學觀察可知紅顏組培苗有兩種生根途徑：第1種：組織深處形成層處的細胞脫分化、在分化形成根原基(見圖6A)，根原基處的細胞染色深，細胞體積小,與周圍薄壁細胞差異明顯。繼續(xù)培養(yǎng)，根原基突破表皮形成不定根(見圖6B)。第2種：不定芽基部組織表皮內(nèi)側(cè)的幾層薄壁細胞在激素的刺激下脫分化恢復分裂能力，在表皮處形成分生組織(見圖6C(b))。分生組織發(fā)育為根原基，繼而發(fā)育形成不定根(見圖6C(a)-D)。

不定根上有大量的輸導組織，如不定根上環(huán)紋狀的導管(見圖7A，圖7B(b))，梯紋狀的導管(見圖7B(a))。這些輸導組織與不定芽中的輸導組織連接，使組培苗形成完整植株。這些輸導組織將不定根從土壤里吸收的營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)街仓甑母鱾€部位，從而提高組培苗移栽成活率。

圖6 不定根形成的顯微結(jié)構(gòu)A：內(nèi)起源的根原基，B:內(nèi)起源的不定根；C(a)：外起源的根原基和不定根，C(b)：分生組織；D：外起源的不定根；rp：根原基；ca：形成層；ar：不定根；ms：分生組織

圖7 不定根上的維管組織A:外起源不定根中的維管組織；B:內(nèi)起源不定根中的維管組織；vb:維管束

不定根初生結(jié)構(gòu)包括表皮、皮層和維管柱3個部分(見圖8A)。從初生不定根的橫切面上看，表皮細胞接近長方形，細胞排列緊密，細胞壁染色較深。表皮細胞還向外突起形成根毛原基。皮層由幾層薄壁細胞組成，占初生不定根的大部分。維管柱位于根的中部，由中柱鞘、初生木質(zhì)部、初生韌皮部、髓四個部分組成(見圖8B)。

圖8 不定根橫切A-B：不定根橫切；rp：根毛原基；ep：表皮；co：皮層；vc：維管柱；pe：中柱鞘；px：初生木質(zhì)部；ph：初生韌皮部；Pi：髓

3 討論與結(jié)論

離體條件下植物器官的發(fā)生首先要經(jīng)歷脫分化使外植體上的細胞恢復分生狀態(tài)，經(jīng)再分化形成組織、器官、植株[5]。植株離體再生途徑有兩種:①體細胞胚發(fā)生途徑，②器官發(fā)生途徑[6]。根據(jù)本實驗解剖學分析發(fā)現(xiàn)紅顏草莓莖尖形態(tài)學上端的表皮細胞在適宜的激素刺激和條件培養(yǎng)下脫分化、再分化形成芽原基，芽原基發(fā)育為不定芽，在整個過程中未見愈傷組織。這一實驗結(jié)果表明離體紅顏草莓莖尖發(fā)育的芽為直接不定芽，芽的起源方式為外起源，植株再生方式為器官型。這都表明離體紅顏草莓莖尖形態(tài)學上端在較高水平細胞分裂素的誘導下，可以高效的直接再生獨立的不定芽。這與龍玉娟[7]等對大蒜花序軸離體培養(yǎng)的不定芽發(fā)生途徑結(jié)果一致。

關(guān)于細胞脫分化、再分化先發(fā)育形成芽原基，隨后再形成葉原基；還是先形成葉原基后再形成芽原基；或者芽原基和葉原基同時形成等問題存在爭議。Colby在研究直接誘導離體葡萄葉柄發(fā)育為不定芽過程中發(fā)現(xiàn)原分生組織和不定葉的起始是獨立的[8]。Gaba[9]和蔡潤[10]在研究甜瓜子葉再生時發(fā)現(xiàn)首先形成葉原基，芽原基在不定葉的基部形成。本實驗研究發(fā)現(xiàn)紅顏草莓莖尖離體培養(yǎng)是脫分化、再分化形成芽原基，芽原基周圍的薄壁細胞形成葉原基(見圖2A-B)。形成不定芽后，在不定葉和不定芽芽體之間的基部還可形成新的芽原基(見圖3)，繼而發(fā)育形成新的不定芽。本研究結(jié)果與亞洲百合花絲組織培養(yǎng)、火百合子房薄層培養(yǎng)時的器官發(fā)生方式相似[11]。

形成層、皮層薄壁細胞、韌皮部、髓射線細胞、愈傷組織等出是比較容易誘導產(chǎn)生根原基的部位[12,13]。根原基可以分為潛伏根原基和誘生根原基兩類[14]。通過對離體紅顏草莓莖尖組織培養(yǎng)的解剖學研究發(fā)現(xiàn)，紅顏草莓不定芽中不存在潛伏根原基，不定根是在激素誘導下形成的誘生根原基(見圖6)。有的不定根起源于組織深處的維管形成層，也有的不定根起源于表皮內(nèi)側(cè)的幾層薄壁細胞(見圖6)。李志軍等發(fā)現(xiàn)田旋花不定根也起源于維管形成細胞[15]。很多植物離體培養(yǎng)的根原基都屬于誘生根原基，如鐵線蓮[16]、杏香兔耳風[17]、紫花含笑[18]等。正是由于紅顏草莓不定芽生根方式既存在內(nèi)起源又存在外起源，所以紅顏草莓組培苗的生根率和生根條數(shù)都很高，可提高紅顏草莓莖尖組培苗的移栽成活率。

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OrganogenesisApproachesinTissueCultureofStemTipsofBenihoppeStrawberry(FragariaananasosaDuch.)

WANG Xiao-ling1TANG Li-ping2FAN Yu2LUO Xiao-bo3*ZENG De-gang4

(1.Liangshan Vocational and Technical School, Xichang 615000,China；2. College of Life Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，Sichuan，China；3. Sichuan Academy of Natural Resource Sciences，Chengdu 610015，China；4. Liangshan agricultural school，Xichang 615000,China)

To study the organogenesis approaches in tissue culture of stem tips of Benihoppe strawberry (FragariaananassaDuch.),stem tips were used as explants for tissue culture,aiming to observe the morphological and anatomical changes during organic regeneration.Results showed that the regenerative bud primodium in vitro of Benihoppe Strawberry (F.ananassaDuch.) derived from the parenchyma cells in epidermis on the morphologic apex of stem tips,so it originated in exogenous way;Parenchyma cells in epidermis differentiated to form bud primordium,then the leaf primordium would be differentiated from parenchyma cells in epidermis near it;the bud primordium and leaf primordium grew together to form adventitious shoots;Organogenesis type was the way for the bud primordium to regenerate.The tissue of adventitious shoots base was induced by hormone , which would cause the differentiation of root primordium in cambium , the epidermic cells of adventitious shoots base could form root primordium too.Therefore , the way that adventitious roots originated could be exogenous or endogenous, but the adventitious roots were all the induced root primordia. At last, the conducting tissue in adventitious shoots and roots connected the whole tissue culture seedling into a complete plant.

Benihoppe strawberry，Tissue culture，Organogenesis approaches，Anatomy

2017-10-17

涼山州技術(shù)研究與推廣應用項目(15YYJS0051)優(yōu)質(zhì)草莓品種引進及組培脫毒育苗技術(shù)研究。

王曉玲(1972-),女,重慶市潼南縣人,高級講師,主要從事植物學、森林培育等方面研究。

*通訊作者:羅曉波(1971-),男,四川省射洪縣人,高級工程師,主要從事植物學、生物生態(tài)學、特色作物栽培、資源植物開發(fā)與應用等方面研究。

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.06.010

S723.1

A

1003-5508(2017)06-0040-05