譚清群，何海永，陳小均，陳 文，王莉爽，黃 露，楊學輝

（貴州省植物保護研究所，貴陽 550009）

貴州水稻紋枯病菌對噻呋酰胺和己唑醇的敏感性測定

譚清群，何海永，陳小均，陳 文，王莉爽，黃 露，楊學輝*

（貴州省植物保護研究所，貴陽 550009）

【目的】研究貴州省不同稻區(qū)水稻紋枯病菌對噻呋酰胺和己唑醇的敏感性情況，可為水稻紋枯病的科學防治和藥劑的合理使用提供參考。【方法】從貴州不同水稻產(chǎn)區(qū)采集水稻紋枯病菌標樣，對其進行分離、純化并保存菌株，采用菌絲生長速率法測定38株水稻紋枯病菌對噻呋酰胺和己唑醇的敏感性及其交互抗性?！窘Y果】所有供試菌株對噻呋酰胺的EC50值介于（0.026 4～0.380 2）μg/mL之間，平均 EC50為（0.071 2±0.059 4）μg/mL；所有供試菌株對己唑醇的EC50值介于（0.003 6～0.090 7）μg/mL之間，平均 EC50為（0.025 1±0.015 8）μg/mL。不同地區(qū)菌株對噻呋酰胺和己唑醇的敏感性不同，貴陽的菌株對噻呋酰胺的敏感性最高，銅仁地區(qū)的最低；黔南州的菌株對己唑醇的敏感性最高，黔東南州的最低。供試菌株對噻呋酰胺和己唑醇的敏感性無顯著相關性?！窘Y論】供試菌株對噻呋酰胺和己唑醇具有較高的敏感性，不同地區(qū)菌株間敏感性不同。兩藥劑未產(chǎn)生交互抗性，可以在生產(chǎn)上交替使用。

水稻；紋枯病菌；噻呋酰胺；己唑醇；敏感性

水稻紋枯病是全球普遍發(fā)生的水稻重要病害之一，能侵染水稻葉鞘和葉片引起枯斑，也侵染穗頸、莖稈和葉片，使水稻結實率降低，癟谷率增加，粒重下降，嚴重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，發(fā)病田塊一般減產(chǎn)10%～30%，嚴重時產(chǎn)量損失可達50%，在我國部分地區(qū)，其危害已超過稻瘟病而居首位[1-2]。病原菌無性階段為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）半知菌亞門絲核菌屬，有性階段為瓜亡革菌[Thanatephorus cucumeris（Frank）Donk]，擔子菌亞門亡革菌屬[1]。病菌以菌核或菌絲體在土壤、病稻草和其他寄主殘體上越冬，并在高溫、高濕條件下迅速蔓延，造成紋枯病的大面積發(fā)生。近年來，由于感病品種的大面積種植、氮素化肥用量的增加以及全球氣候條件的變化，水稻紋枯病發(fā)生危害逐年加重，尤其在我國南方稻區(qū)的湖南、廣東、廣西、江西等地，水稻紋枯病已位居水稻三大病害之首[3-4]。目前，水稻紋枯病防治最有效最廣泛的方法依然是使用化學藥劑[5]。井岡霉素是我國用于防治水稻紋枯病應用最廣的微生物源抗生素[6]，但由于單一藥劑的長期使用將會增加病原菌的抗藥性風險[7]。河南、福建等地[8-9]已有井岡霉素抗藥性菌株的報道，使得井岡霉素能否繼續(xù)廣泛可持續(xù)使用受到挑戰(zhàn)。為此，我國近年相繼登記了許多井岡霉素的替代藥劑，如噻呋酰胺和己唑醇等的單劑及其復配制劑，以緩解井岡霉素用量增加、防效降低[10-11]等問題，從而確保水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。噻呋酰胺屬于琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑，具有強內(nèi)吸傳導特性和長持效性，對水稻紋枯病有特效[12]，己唑醇屬于三唑類脫甲基抑制劑，是一類廣譜、高效、內(nèi)吸性殺菌劑，該藥能有效防治子囊菌、擔子菌和半知菌引起的病害，尤其對紋枯病、炭疽病等病害防治效果顯著[13]。田間藥效試驗表明，這些藥劑對水稻紋枯病的防治效果較好[14-16]，但是隨著藥劑使用年限的延長和劑量的提高，病原菌對藥劑的敏感性可能會降低，甚至產(chǎn)生抗藥性菌株或群體，給病害防治帶來巨大困難。因此，檢測水稻紋枯病菌對噻呋酰胺和己唑醇的敏感性，對水稻紋枯病的科學防治和這兩種藥劑的合理使用具有指導意義。國內(nèi)外關于水稻紋枯病菌對噻呋酰胺的敏感性研究較少，魏松紅等測定了吉林省102株水稻紋枯病菌對噻呋酰胺的敏感性，初步確定將多核菌株的 EC50平均值（0.063 0±0.038 8）μg/mL 作為吉林省水稻紋枯病菌對噻呋酰胺藥物的敏感基線[17]；Chen Y等通過菌絲生長速率法對安徽省128株水稻紋枯病菌對噻呋酰胺的敏感性進行測定，結果顯示所有菌株對噻呋酰胺極其敏感，平均EC50值為（0.05±0.012）μg/mL[18]；趙麗靜等測定了不同藥劑對一株水稻紋枯病菌的毒力，結果表明，水稻紋枯病菌對己唑醇的敏感性最高，其EC50值為0.036 1 μg/mL[19]，而水稻紋枯病菌群體對己唑醇的敏感性研究尚未見報道。目前在貴州省實際生產(chǎn)上普遍利用噻呋酰胺和己唑醇及其復配制劑防治水稻紋枯病，但是水稻紋枯病菌對這兩種藥劑的敏感性及藥劑間的交互抗性尚不清楚。從貴州不同水稻產(chǎn)區(qū)采集水稻紋枯病標樣，并對其進行分離鑒定，測定所獲菌株對噻呋酰胺和己唑醇的敏感性，以期為貴州省水稻紋枯病的科學防治與藥劑的規(guī)范使用提供理論依據(jù)，并為農(nóng)藥的減施和少施奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試菌株：供試菌株共38株，全部來自貴州省貴陽市、遵義市、銅仁地區(qū)、安順市、黔東南州和黔南州的17個縣，其中3株于2013年分離，35株于2014年分離，具體見表1。

供試藥劑：96%噻呋酰胺原藥、95%己唑醇原藥均由張家港保稅區(qū)百龍達化學品有限公司提供；丙酮（分析純，重慶川東化工集團有限公司化學試劑廠）。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA），配方為：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂粉12 g，水1 L。

1.2 研究方法

菌株的分離：參照周而勛等[20]（1998）的水瓊脂分離法對2013年9-10月和2014年9-10月在貴州省貴陽市、遵義市、銅仁地區(qū)、安順市、黔東南州和黔南州采集的水稻紋枯病菌標樣進行病原菌的分離和純化，共獲得38株有效菌株，用馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基斜面保存于4℃冰箱中，使用時在含有PSA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上活化。

表1 供試菌株來源、數(shù)量與編號Table 1 The source，quantity and number of all strains

含藥培養(yǎng)基的配置：噻呋酰胺原藥（96%）、己唑醇原藥（95%）用丙酮分別配置成1 000 μg/mL的母液。待完全溶解后向PSA培養(yǎng)基中添加不同體積的噻呋酰胺和己唑醇母液，分別制成質(zhì)量濃度為0.007 8、0.015 6、0.031 3、0.062 5、0.125、0.25、0.5和1 μg/mL的含藥培養(yǎng)基。

水稻紋枯病菌對噻呋酰胺和己唑醇的敏感性測定：采用菌絲生長速率法[21]測定水稻紋枯病菌的敏感性。將保存的供試菌株接種于PSA培養(yǎng)基平板上，28℃避光培養(yǎng)2 d后，用打孔器沿菌落邊緣打取直徑5 mm的菌絲塊，菌絲面朝下接種于含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中央，以不含藥劑的處理為空白對照，每個處理設置 3個重復，28℃下培養(yǎng)48 h，待對照菌落即將長滿培養(yǎng)皿時，采用十字交叉法測量菌落直徑。

統(tǒng)計方法：計算各處理的菌落直徑均值，并按照下列公式計算菌絲生長平均抑制率：菌絲生長平均抑制率（%）=[（對照菌落直徑均值-處理菌落直徑均值）/（對照菌落直徑均值-接種菌餅直徑）]×100%。利用DPS軟件，對各處理藥劑濃度的對數(shù)值（X）和菌絲生長抑制率的概率值（Y）進行回歸分析，計算出噻呋酰胺和己唑醇對水稻紋枯病菌菌絲生長抑制的回歸方程和抑制中濃度（EC50值）[17]。利用DPS軟件的配對T檢驗比較水稻紋枯病菌對噻呋酰胺和己唑醇的敏感性間有無顯著性差異。通過比較兩者EC50對數(shù)值之間的相關系數(shù)和顯著性來判斷噻呋酰胺和己唑醇之間有無交互抗性。

2 結果與分析

2.1 水稻紋枯病菌對噻呋酰胺的敏感性及其頻率分布

采用菌絲生長速率法測定38株水稻紋枯病菌對噻呋酰胺的敏感性，結果顯示（見表2）：供試菌株的 EC50值介于（0.026 4～0.380 2）μg/mL 之間，平均EC50值為0.071 2 μg/mL，其中采自貴陽市修文縣的菌株RS-2014-96-1-1敏感性最高，采自銅仁地區(qū)沿河縣的RS-2014-73-1-1敏感性最低，兩菌株的EC50值相差14.4倍。

在水稻紋枯病菌對噻呋酰胺的敏感性范圍內(nèi)，將所有菌株EC50值等分為幾個階段，以每個階段EC50的中值為橫坐標，統(tǒng)計每階段菌株的頻率，繪制其敏感性頻率分布圖（見圖1），結果顯示81.58%的菌株 EC50值介于 0.026 4～0.097 2 μg/mL 之間，表明大部分紋枯病菌菌株對噻呋酰胺的敏感性較高。

表2 不同水稻紋枯病菌菌株對噻呋酰胺的敏感水平Table 2 The sensitivity of Rhizoctonia solani to thifluzamide

分析不同地區(qū)菌株對噻呋酰胺的敏感性可知（由于安順地區(qū)僅有1個菌株，因此未做比較），不同地區(qū)菌株的平均EC50值間差異明顯（見表3），貴陽地區(qū)的菌株對噻呋酰胺的敏感性最高，平均EC50值為（0.052 6±0.030 1）μg/mL，銅仁地區(qū)菌株對噻呋酰胺的敏感性最低，平均 EC50值為（0.104 1±0.113 9）μg/mL，平均EC50值高于供試菌株平均EC50值的地區(qū)有銅仁地區(qū)和黔南州，而貴陽市、遵義市和黔東南州菌株的平均EC50值略低于供試菌株的平均EC50值。各地區(qū)菌株平均EC50值的大小關系為：銅仁地區(qū)＞黔南州＞黔東南州＞遵義市＞貴陽市。

圖1 噻呋酰胺對水稻紋枯病菌EC50值的頻率分布Figure 1 Frequency of distribution of EC50in Rhizoctonia solania to thifluzamide

表3 不同地區(qū)水稻紋枯病菌對噻呋酰胺的敏感性比較Table 3 Comparison of sensitivity of Rhizoctonia solanito thifluzamide from different regions

2.2 水稻紋枯病菌對己唑醇的敏感性及其頻率分布

采用菌絲生長速率法測定38株水稻紋枯病菌對己唑醇的敏感性，結果顯示各菌株對己唑醇的敏感性有一定差異（表 4）。平均 EC50值為 0.025 1 μg/mL，來自銅仁地區(qū)的菌株RS-2014-101-1-1的EC50值最小，為 0.003 6 μg/mL，EC50值最大（0.090 7 μg/mL）的菌株RS-103-1-1同樣也來自銅仁地區(qū)，兩菌株EC50值相差25.2倍。

在水稻紋枯病菌對己唑醇的敏感性范圍內(nèi)，將所有菌株EC50值等分為幾個階段，以每階段EC50的中值為橫坐標，統(tǒng)計每階段菌株的頻率，繪制其敏感性頻率分布圖，從水稻紋枯病菌對己唑醇的敏感性頻率分布圖可知（見圖2），各菌株的EC50值分布比較集中，其中 EC50值分布于（0.003 6～0.021 1）μg/mL范圍內(nèi)的菌株數(shù)占供試菌株數(shù)的39.47%，EC50值分布于（0.021 1～0.038 6）μg/mL范圍內(nèi)的菌株數(shù)占供試菌株數(shù)的44.74%。

表4 不同水稻紋枯病菌菌株對己唑醇的敏感水平Table 4 The sensitivity of Rhizoctonia solani to hexaconazole

續(xù)表（4）

圖2 己唑醇對水稻紋枯病菌EC50值的頻率分布Figure 2 Frequency of distribution of EC50in Rhizoctonia solani to hexaconazole

比較不同地區(qū)菌株對己唑醇的敏感性（由于安順地區(qū)僅有1個菌株，因此未做比較），發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)菌株對己唑醇的敏感性不同見表5，其中黔南州菌株敏感性最高，平均 EC50值為（0.020 9±0.011 4）μg/mL，黔東南州菌株敏感性最低，平均EC50值為（0.029 0±0.008 4）μg/mL，除黔東南州菌株平均EC50值高于供試菌株平均EC50值外，其余地區(qū)菌株的平均EC50值均低于供試菌株的平均EC50值。各地區(qū)菌株平均EC50值的大小關系為：黔東南州＞銅仁地區(qū)＞遵義市＞貴陽市＞黔南州。

2.3 水稻紋枯病菌對噻呋酰胺和己唑醇的交互抗性

分別將病原菌對噻呋酰胺和己唑醇的EC50值取對數(shù)后計算兩者之間的相關系數(shù)，結果表明（見圖3），兩者數(shù)據(jù)之間無顯著相關性（R=0.426 0，P=0.000 2），即噻呋酰胺與己唑醇之間未產(chǎn)生交互抗性，生產(chǎn)上可交替使用。

表5 不同地區(qū)水稻紋枯病菌對己唑醇的敏感性比較Table 5 Comparison of sensitivity of Rhizoctonia solani to hexaconazole from different regions

圖3 噻呋酰胺和己唑醇的交互抗性Figure 3 Cross-resistance between thifluzamide with hexaconazole

3 討論與結論

本研究對2013年和2014年采自貴州省貴陽市、遵義市、銅仁地區(qū)、黔南州和黔東南州的38個水稻紋枯病菌對噻呋酰胺的敏感性進行了測定，結果表明，供試菌株的 EC50值介于（0.026 4～0.380 2）μg/mL之間，平均 EC50值為（0.071 2±0.059 4）μg/mL。研究測定結果表明，貴州水稻紋枯病菌的平均EC50值高于魏松紅等[17]，Chen Y.等[18]的結果，可能由于不同地區(qū)用藥年限、用藥量、用藥頻次和施藥方式不同所導致，也可能是水稻紋枯病菌敏感性下降的緣故。不同菌株對噻呋酰胺的敏感性差異也較大，最大 EC50值與最小EC50值間相差14.4倍，表明水稻紋枯病菌對噻呋酰胺存在抗藥性風險。因此，應加強水稻紋枯病菌的抗性監(jiān)測，為指導水稻紋枯病的田間用藥奠定基礎。

本研究通過分析貴州省不同水稻種植區(qū)水稻紋枯病菌對己唑醇的敏感性，發(fā)現(xiàn)供試菌株對己唑醇的 EC50值介于（0.003 6～0.090 7）μg/mL 之間，平均EC50為（0.025 1±0.015 8）μg/mL，低于趙麗靜等的測定結果，表明貴州水稻紋枯病菌對己唑醇的敏感性較高，尚未產(chǎn)生抗藥性[19]。生產(chǎn)上可繼續(xù)使用己唑醇單劑或復配制劑防治水稻紋枯病，同時應繼續(xù)多點監(jiān)測水稻紋枯病菌對己唑醇的敏感性。

貴州不同地區(qū)水稻紋枯病菌對噻呋酰胺和己唑醇的敏感性差異明顯，對噻呋酰胺而言，貴陽市菌株敏感性最高，銅仁地區(qū)菌株敏感性最低，而己唑醇則是黔南州菌株對其敏感性最高，黔東南州菌株對其敏感性最低，這可能與各地使用這兩種藥劑的年限和頻次不同有關，可在采樣時對當?shù)剞r(nóng)藥售賣情況和農(nóng)民對水稻紋枯病化學防治習慣進行問詢調(diào)查。

貴州水稻紋枯病菌對噻呋酰胺和己唑醇的敏感性較高，未產(chǎn)生抗藥性，兩藥劑間也未產(chǎn)生交互抗性，因此，這兩種藥劑可在該地區(qū)繼續(xù)輪換使用。但是，為了防止病原菌快速產(chǎn)生抗藥性，生產(chǎn)上除了輪換用藥外，還應合理地減少使用劑量和次數(shù)。

本研究結果表明，所有供試菌株對噻呋酰胺和己唑醇具有較高的敏感性，不同地區(qū)菌株間敏感性不同。噻呋酰胺與己唑醇間未產(chǎn)生交互抗性，可以在生產(chǎn)上交替使用。

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Study on Sensitivity of Rhizoctonia solani of Rice to Thifluzamide and Texaconazole in Guizhou Province

TAN Qing-qun，HE Hai-yong，CHEN Xiao-jun，CHEN Wen，WANG Li-shuang，HUANG Lu，YANG Xue-hui*
（Institute of Plant Protection，Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang 550009，China)

【Objective】In order to to investigate the sensitivity of Rhizoctonia solani to thifluzamide and hexaconazole in Guizhou Province.【Method】The isolates were collected from different regions in Guizhou province，then we separated，purified and saved these isolates.Through mycelial growth rate methods，38 strains were detected the sensitivity and cross-resistance to trifluzamide and hexaconazole.【Results】The results indicated the effective concentration values（EC50） of thifluzamide ranged from 0.026 4 to 0.380 2 μg/mL，with an average value of（0.071 2±0.059 4）μg/mL；And the EC50values of hexaconazole ranged from 0.003 6 to 0.090 7 μg/mL，with a mean of（0.025 1±0.015 8）μg/mL.We found that isolates from different area showed different sensitivities against these two fungicides.The isolates from Guiyang showed the highest sensitivity to thifluzamide while isolates from Tongren was the lowest；The sensitivity of the isolates in Qiannan to hexaconazole was the highest while that in Qiandongnan was the lowest.There was no significiant correlation between the EC50values to thifluzamide and hexaconazole.【Conclusion】The isolates from Guizhou showed high sensitivity against to thifluzamide and hexaconazole and the sensitivity was various in different isolates.Furthermore，no obvious crossresistance observed in these two fungicides，so we can be alternatively used for disease control.

rice；Rhizoctonia solani；thifluzamide；hexaconazole；sensitivity

S432.1 文獻標志碼：A 文章編號：1000-2650（2017）02-0159-08

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.02.004

2016-12-05

貴州省聯(lián)合基金（黔科合J字LKN[2013]08號）。

譚清群，助理研究員，主要從事植物病原物致病機理及病害防控研究，E-mail：tanqingqun123@126.com。*責任作者：楊學輝，博士，研究員，主要從事蔬菜及水稻病害防控研究，E-mail：yxuehui66@163.com。

（本文審稿：段紅平；責任編輯：劉詩航；英文審稿：劉詩航）