陳 暉，肖 穎，方成俊，張東斌，余曉薇

（東山出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建東山 363401）

一起石斑魚(yú)苗病毒性神經(jīng)壞死病的診斷

陳 暉，肖 穎，方成俊，張東斌，余曉薇

（東山出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建東山 363401）

2017年6—7月，福建省東山縣某石斑魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)多批20～60日齡雜交石斑魚(yú)苗發(fā)病，臨床表現(xiàn)為游泳行為改變，致盲、打轉(zhuǎn)，魚(yú)體發(fā)黑，不食，繼而死亡，死亡率高達(dá)90%以上。多次應(yīng)用抗生素治療無(wú)效，寄生蟲(chóng)、細(xì)菌學(xué)檢查為陰性。應(yīng)用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的檢測(cè)引物，采用RT-PCR檢測(cè)方法擴(kuò)增出神經(jīng)壞死病毒（NNV）特異性的421 bp基因片段，以此診斷為病毒性神經(jīng)壞死?。╒NN）。

雜交石斑魚(yú)苗；病毒性神經(jīng)壞死??；寄生蟲(chóng)學(xué)檢查；細(xì)菌學(xué)檢查；RT-PCR

病毒性神經(jīng)壞死?。╒NN）又稱為病毒性腦病和視網(wǎng)膜病（VER），是一種流行于多種海水魚(yú)類的傳染病。該病病原為神經(jīng)壞死病毒（NNV），可導(dǎo)致病魚(yú)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜引發(fā)空泡化病灶，從而引起魚(yú)類大量死亡。該病的死亡率取決于魚(yú)齡大小。一般20～60日齡魚(yú)苗感染后死亡率最高，可達(dá)90%以上，60日齡以上較大魚(yú)的感染率和致死率較低[1]。NNV歸屬于野田村病毒科乙型野田村病毒屬，病毒基因組由2個(gè)分子的單股正鏈RNA1和RNA2組成，分別編碼復(fù)制酶和衣殼蛋白[2-4]。在對(duì)RNA1的T4可變區(qū)域進(jìn)行分子進(jìn)化研究的基礎(chǔ)上，可將乙型野田村病毒分為4個(gè)主要基因型：SJNNV型、TPNNV型（鲀神經(jīng)壞死病毒型）、BFNNV型（鰈神經(jīng)壞死病毒型）和RGNNV型（石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒型）[5]。迄今為止，已知可感染該病的魚(yú)種類達(dá)50余種，主要為海水魚(yú)類，其中受影響最大的是石斑魚(yú)、黃帶擬鲹和鰈魚(yú)等[6]。近幾年，我國(guó)南部省份養(yǎng)殖的各種石斑魚(yú)常常暴發(fā)流行VNN。其致死率非常高，給石斑魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的檢測(cè)方法。采用RT-PCR檢測(cè)方法擴(kuò)增出NNV特異性的421 bp基因片段，是當(dāng)前檢測(cè)本病的最好檢測(cè)方法。該法對(duì)樣品處理的時(shí)間短，操作步驟清楚明了，特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，是快速檢測(cè)NNV的首選方法。

1 發(fā)病情況

福建省東山縣某石斑魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)是一個(gè)新建的，環(huán)境良好、施設(shè)完備的石斑魚(yú)親魚(yú)、苗種繁殖和成魚(yú)養(yǎng)殖的較大型養(yǎng)殖場(chǎng)，養(yǎng)殖有紅斑魚(yú)、龍膽石斑魚(yú)、油斑魚(yú)、青斑魚(yú)親魚(yú)4種魚(yú)類。每年4—10月為繁殖期，5—7月為盛產(chǎn)期。本次發(fā)病魚(yú)苗是紅斑魚(yú)分別與龍膽石斑魚(yú)、油斑魚(yú)雜交的魚(yú)苗，發(fā)病日齡大多在20～60日齡，發(fā)病率和致死率都在90%以上。而單純青斑魚(yú)苗的發(fā)病日齡較遲，發(fā)病率和死亡率較低。

東山縣每年6—7月份的水溫一般保持在24～30 ℃。石斑魚(yú)親魚(yú)一般在受精卵孵化后約20 d，魚(yú)體長(zhǎng)1.5～2 cm，翅未收縮完全時(shí)，開(kāi)始發(fā)病，表現(xiàn)為魚(yú)體游泳行為改變，開(kāi)始打轉(zhuǎn)，魚(yú)體背部開(kāi)始發(fā)黑，但不影響進(jìn)食；繼續(xù)喂養(yǎng)蟯蟲(chóng)類生物餌料3～5 d后，部分魚(yú)苗開(kāi)始死亡，死亡率為50%左右。當(dāng)時(shí)場(chǎng)里采取了緊急應(yīng)對(duì)措施，如將發(fā)病魚(yú)苗與健康魚(yú)苗隔離，降低魚(yú)苗養(yǎng)殖密度，對(duì)發(fā)病魚(yú)池多次使用抗生素（氟苯尼考）藥浴，但無(wú)明顯治療效果。持續(xù)喂養(yǎng)至30～50 d，魚(yú)苗翅收縮完成后，部分健康魚(yú)苗也開(kāi)始發(fā)病，表現(xiàn)為持續(xù)打轉(zhuǎn)，飄浮水面或沉于池底，肚子漲氣，鰓部出血，鰓絲膨脹，不進(jìn)食，處于半昏迷狀態(tài)，甚至出現(xiàn)爛肚、爛鰓并發(fā)癥，最終累記死亡率高達(dá)90%。一般孵化后20～60 d為魚(yú)發(fā)病的危險(xiǎn)期，60 d后魚(yú)體大于10 cm左右時(shí)，魚(yú)進(jìn)入安全期，一般不再發(fā)病。發(fā)病較嚴(yán)重的是紅斑魚(yú)分別與龍膽石斑魚(yú)、油斑魚(yú)雜交的魚(yú)苗。青斑魚(yú)一般發(fā)病1周后即可渡過(guò)危險(xiǎn)期。

2 實(shí)驗(yàn)室檢查

2.1 寄生蟲(chóng)學(xué)檢查

采集多條瀕死病魚(yú)剖檢，取鰓片、眼、腸進(jìn)行壓片，解剖鏡下檢查，未見(jiàn)蟲(chóng)體和蟲(chóng)卵。

2.2 細(xì)菌學(xué)檢查

將孵化后20 d即開(kāi)始發(fā)病的，且未進(jìn)行抗生素治療的瀕死病魚(yú)，取病變明顯的頭、眼等組織進(jìn)行研磨，接種含1%氯化鈉的肉湯培養(yǎng)液，30 ℃培養(yǎng)1 d；待肉湯混濁后，劃線接種TCBS平板，同樣30 ℃培養(yǎng)1 d。TCBS平板上可見(jiàn)少許黃色菌落，經(jīng)鑒定為溶藻弧菌。按常規(guī)辦法，再取上述菌落接種于1%氯化鈉的肉湯培養(yǎng)液，30 ℃培養(yǎng)1 d，再對(duì)健康石斑魚(yú)苗進(jìn)行毒力回歸試驗(yàn)，未出現(xiàn)上述病癥，說(shuō)明溶藻弧菌不是引起上述病癥的病原。

2.3 RT-PCR方法檢測(cè)

2.3.1材料 活體采集發(fā)病后3個(gè)不同時(shí)期（20、35、50 d）游動(dòng)異常、食欲減低、體表色素漸變的瀕死石斑魚(yú)苗，凍存于?80 ℃冰箱備用。試驗(yàn)所用的磁珠法通用型RNA提取試劑盒，為賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司產(chǎn)品；一步法RT-PCR試劑盒，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；所用序列采用OIE 《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》（第3版）推薦的引物。反向引物：5′-CGA GTC AAC ACG GGT GAA GA-3′；正向引物：5′-CGT GTC AGT CAT GTG TCG CT-3′。GeneGreen核酸染料，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

2.3.2方法

2.3.2.1組織樣品處理 取病魚(yú)腦、眼約50 mg，放在1.5 mL滅菌離心管中，用滅菌碾磨棒充分研磨搗爛，加1 mL裂解液。室溫孵育3 min，加200 μL氯仿，即三氯甲烷（Chloroform），小心蓋上蓋子，劇烈震蕩15 s，室溫孵育3 min，4 ℃ 12 000 r/min，離心15 min。取上清400 μL至5連管的第1孔內(nèi)。

2.3.2.2RNA提取 采用磁珠法提取RNA。在5連管內(nèi)分別加入試劑（表1）。提取全過(guò)程在磁珠提取純化系統(tǒng)中自動(dòng)進(jìn)行。

表1 5連管內(nèi)加入的試劑及劑量

2.3.2.3一步RT-PCR法 根據(jù)NNV擴(kuò)增片段大小，設(shè)置RT-PCR反應(yīng)體系：PCR模板5 μL，正、反向引物（40 μmo1）各2 μL，Taq酶（5mol/L）1 μL、10×Taq 酶緩沖液 7 μL、MgCI2（25 mmo1/L）6 μL、dNTP 2 μL、M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（20 U/μL）1 μL、RNA 酶抑制劑（20 U/μL）0.5 μL，加滅菌雙蒸水至50 μL。程序設(shè)定為：首先42 ℃ 30 min、95 ℃5 min，然后 95 ℃ 40 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s循環(huán)30次，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

2.3.2.4PCR擴(kuò)增結(jié)果判定 用TBE電泳緩沖液配制2%的瓊脂糖（加入濃縮的10000×GeneGreen Nucleic Acid Dye，使其在凝膠中的終濃度為1×）進(jìn)行電泳，樣品孔中加入6 μL樣品和2 μL樣品緩沖液（含0.25%溴酚藍(lán)）的混合液，并設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker作對(duì)照。電泳后在紫外檢測(cè)儀上觀察發(fā)現(xiàn)，在瓊脂糖電泳的421 bp位置均出現(xiàn)明顯的亮帶（圖1）。發(fā)病后3個(gè)不同時(shí)期的雜交石斑魚(yú)苗中均檢出NNV。

圖1 瓊脂糖凝膠電腦圖譜

3 結(jié)論

應(yīng)用 OIE推薦的檢測(cè)引物，采用RT-PCR檢測(cè)方法，最終證實(shí)該魚(yú)場(chǎng)石斑魚(yú)苗流行的是VNN，又稱病毒性腦病和視網(wǎng)膜病。

VNN主要影響魚(yú)苗和幼魚(yú)，通常疫病癥狀出現(xiàn)得越早，死亡率越高，魚(yú)苗階段感染后死亡率經(jīng)常高達(dá)100%。反之，育苗期間，該病發(fā)生的越遲，發(fā)病率和致死率越低。而本次流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病較嚴(yán)重的是紅斑魚(yú)分別與龍膽石斑、油斑魚(yú)雜交的魚(yú)苗。而青斑魚(yú)苗對(duì)NNV有較強(qiáng)的抵抗力，一般發(fā)病1周后即可渡過(guò)危險(xiǎn)期，發(fā)病率和致死率較低。

對(duì)VNN，目前無(wú)特效治療藥物，只能從預(yù)防入手。一是引進(jìn)培育對(duì)NNV有較強(qiáng)抗性的魚(yú)種，如青斑魚(yú)作為親本魚(yú)種；二是魚(yú)卵育苗前，可用聚乙烯吡咯烷酮碘（PVP-1）浸??；三是在養(yǎng)殖中，一旦發(fā)現(xiàn)病魚(yú)要及時(shí)撈出并進(jìn)行隔離養(yǎng)殖；四是夏季高溫期，要降低養(yǎng)殖密度，保持水流暢通，投放新鮮餌料。

致謝：

本次實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)得到廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心徐淑菲老師的指導(dǎo)，特此致謝！

[1] 世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）. 水生動(dòng)物診斷試驗(yàn)手冊(cè)[M]. 6版. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2016：465-470.

[2] SCHNEEMANN A，BALL L A，DELSERT C，et al. Eighth report of the international committee on Taxonomy of viruses[M]//FAUQUET C M，MAYO M A，MANILOFF J，et al. Family nodaviridae.in：virus taxonomy. London：Elsevier Academic Press，2005：865-872.

[3] BALL L A. Requirements for the self-directed replication of flock house virus RNA1[J]. Journal of virology，1995，69（2）：720-727.

[4] NAKAI T，NISHIZAWA T. Sequence of the nonstructural protein gene encoded by RNA1 of striped jack nervous necrosis virus [J]. Journal of general virology，1999（80）：3019-3022.

[5] NISHIZAWA T，F(xiàn)URUHASHI M，NAGAI T，et al.Genomic classification of fish nodaviruses by molecular phylogenetic analysis of the coat protein gene[J]. Applied and environmental microbiology，1997（63）：1633-1636.

[6] MUNDAY B L，KWANG J，MOO DY N. Betanodavirus infections of teleost fish：a review[J]. Journal of fish Disease，2002（25）：127-142.

[7] 陳信忠，蘇亞玲，龔艷清，等. 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)5種養(yǎng)殖石斑魚(yú)的神經(jīng)壞死病毒[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2004，11（3）：202-207.

Diagnose on an Outbreak of Viral Nervous Necrosi of Grouper Fry

Chen Hui，Xiao Ying，F(xiàn)ang Chengjun，Zhang Dongbin，Yu Xiaowei

（Dongshan Entry-exit Inspection and Quarantine，Dongshan，F(xiàn)ujian 363401，China）

During the period from June to July in 2017，an outbreak of disease was reported，with clinical symptoms of abnormal swimming behavior，blind，skin darkening，anorexia，and died in many batches of 20-60-day-old hybrid groupers in a fish farm of Dongshan County，F(xiàn)ujian Province. The mortality was over 90%. Parasites and bacteriological tests were negative and repeated antibiotic treatment was ineffective. The detection primer for pathogen of VNN which was recommended by OIE was carried out，the specific 421 bp gene fragment of NNV was amplified by RT-PCR detection，which indicated that VNV was pathogens causing mass mortality of Grouper fry.

Hybrid grouper fry；Viral nervous necrosis；incidence；parasites test；bacteriological test；RT-PCR

S851.34 +7.34

B

1005-944X（2018）01-0104-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2018.01.028

朱迪國(guó)）