王 群，姜 帆，岳志芹，孫 濤，鄭小龍，張曉文，房保海

（山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東青島 266002）

病毒性出血性敗血癥病毒N基因的病毒樣顆粒制備及定值

王 群，姜 帆，岳志芹，孫 濤，鄭小龍，張曉文，房保海

（山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東青島 266002）

為制備含有病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）N基因的RNA病毒樣顆粒標(biāo)準(zhǔn)樣品，通過(guò)RT-RCR擴(kuò)增VHSV的N基因，將其克隆至含有組氨酸標(biāo)簽的pNH-MS2his載體中，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pNHMS2his-N；將重組質(zhì)粒pNH-MS2his-N轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21（DE3），用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、純化；對(duì)病毒樣顆粒進(jìn)行鑒定及穩(wěn)定性試驗(yàn)，使用數(shù)字PCR對(duì)病毒樣顆粒進(jìn)行定值。結(jié)果顯示，該病毒樣顆粒含VHSV N基因序列，并且穩(wěn)定性良好，定值結(jié)果為8×106copies/mL。結(jié)果表明，構(gòu)建的病毒樣顆?？梢宰鳛镽NA病毒檢測(cè)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品使用。

病毒性出血性敗血癥病毒；病毒樣顆粒；N基因；數(shù)字PCR

病毒性出血性敗血癥病毒（Viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV）是魚類彈狀病毒（Fish rhabdovirus）的一種，能引起魚類急性或慢性內(nèi)臟性疾病，導(dǎo)致的死亡率非常高[1-2]。該病毒流行區(qū)域廣泛，在歐洲、美洲，以及亞洲的日本均有流行的報(bào)道[3]。該病毒宿主范圍較大，可感染淡水和海水魚類。目前VHSV的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法是先用細(xì)胞分離病毒，再通過(guò)免疫學(xué)（間接免疫熒光或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）或分子生物學(xué)（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）手段進(jìn)行病原鑒定[4]。最近有研究顯示，熒光PCR技術(shù)同細(xì)胞分離鑒定技術(shù)具有相似的敏感性和特異性[5-6]。

雖然熒光PCR技術(shù)具有靈敏、快速、易操作等特點(diǎn)，但為了確保準(zhǔn)確性，在試驗(yàn)過(guò)程中需要設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照或質(zhì)控品。為了便于熒光PCR方法的使用及推廣，本研究制備了一種含有VHSV N基因的病毒樣顆粒，將其作為試驗(yàn)中的陽(yáng)性質(zhì)控。該病毒樣顆粒既有耐核糖核酸酶降解的優(yōu)點(diǎn)，還可以幫助實(shí)現(xiàn)監(jiān)控病毒提取過(guò)程的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

含有組氨酸標(biāo)簽的假病毒表達(dá)載體pNHMS2his：本實(shí)驗(yàn)室保存；病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）：深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心惠贈(zèng)。E.coli DH5a、BL21（DE3）：購(gòu)自Tiangen；Ex Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒：購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；OneStep RT-PCR Kit、RNeasy Mini Kit、Ni-NTA Fast Start Kit：購(gòu)自QIAGEN；AgPATH-ID One-Step RT-PCR Kit：購(gòu)自 Ambion。

1.2 VHSV-N蛋白基因的擴(kuò)增

按照文獻(xiàn)報(bào)道的VHSV N蛋白基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)的克隆引物、檢測(cè)及定值時(shí)熒光定量RTPCR的引物及探針如下：

克隆引物：

NF：5′-CAA GCT TGC ATG CCT GCA GGT CGA C-3′

NR：5′-GCG GCC GCT CTA GAG ATT GTG TTT A-3′

檢測(cè)及定值引物探針[4]：

VHSV P1：5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGTGTG-CGT-CC-3′

VHSV P2：5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTCAGG-ATG-AA-3′

VHSV Probe：5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTGGTGATC-TTC-TG-TAMRA-3′

按RNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取VHSV總RNA，然后將其作為模板，擴(kuò)增N蛋白基因。RTPCR體系：5×RT-PCR緩沖液5 μL、dNTP 混合液 1 μL、反應(yīng)酶混合液 1 μL、引物NF和NR各1 μL、RNA 模板 5 μL，用 ddH2O 補(bǔ)足至 25 μL。反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃滅火變性10 min，然后 95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用寶生物公司的凝膠回收試劑盒回收N基因片段。

1.3 外源片段與表達(dá)載體的連接及鑒定

用HindⅢ和NotⅠ雙酶切pNH-MS2his和N基因片段，用膠回收試劑盒回收酶切的pNHMS2his和N基因片段，將回收產(chǎn)物16 ℃連接過(guò)夜。連接體系：載體pNH- MS2his和N基因片段分別為 2 μL 和 6 μL，T4 DNA 連接酶 1 μL、10×T4 連接酶緩沖液 1 μL。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞；將涂板后獲得的重組克隆進(jìn)行PCR及酶切鑒定；將鑒定為陽(yáng)性的重組載體命名為pNH-MS2his-N；將陽(yáng)性克隆保種送上海英駿生物公司測(cè)序。

1.4 病毒樣顆粒的表達(dá)及純化

將測(cè)序正確的pNH-MS2his-N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)至菌株BL21（DE3）；將陽(yáng)性克隆菌株接種于氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)6 h，離心收集菌體；在菌體中加入裂解緩沖液重懸，于冰上放置30 min，離心去除菌體碎片；將上清液加入預(yù)裝有Ni-NTA的純化柱中，使液體自然流出；加入3倍柱體積的洗滌緩沖液，洗滌2次，然后加入洗脫緩沖液，將病毒樣顆粒洗脫。

1.5 病毒樣顆粒的鑒定

將純化的100 μL病毒樣顆粒溶液分成2組（實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組）。對(duì)實(shí)驗(yàn)組，使用RNeasy Mini Kit提取病毒樣顆粒包裹的RNA；對(duì)照組不需要做任何處理，即純化后的病毒樣顆粒。將兩組均進(jìn)行100～102倍稀釋后，分別使用熒光RT-PCR和熒光PCR檢測(cè)N基因。

1.6 熒光定量PCR和熒光定量RT-PCR試驗(yàn)

以梯度稀釋后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組為模板，按照表1中所列的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 熒光定量PCR及RT-PCR反應(yīng)參數(shù)

1.7 病毒樣顆粒的定值

將純化的100 μL病毒樣顆粒溶液，使用RNeasy Mini Kit提取病毒樣顆粒包裹的RNA，使用數(shù)字PCR進(jìn)行RNA定值。反應(yīng)體系：反轉(zhuǎn)錄酶2 μL、反應(yīng)混合液 5 μL、300 mmol/L DTT 1 μL、VHSV P1 和 VHSV P1（20 mmol/L） 各 0.8 μL、VHSV Probe（5 mmol/L）0.4 μL、 病 毒 樣 顆 粒RNA 1 μL，用 ddH2O 補(bǔ)足至 20 μL。

將配好的反應(yīng)體系加入到DG8 卡夾中，加入微滴生成油，在微滴生成儀中生成微滴；將生成好的微滴轉(zhuǎn)移到96孔板中進(jìn)行PCR反應(yīng)。條件如下：60 ℃ 30 min；95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃1 min，40個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 min；4 ℃保持。反應(yīng)結(jié)束后在微滴讀取儀上讀取并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 病毒樣顆粒表達(dá)載體制備

使用引物NF和NR，從VHSV的基因組中克隆N基因。擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1 247 bp（圖1）。將擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體pNH-MS2his酶切純化后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化；挑取重組克隆，提取質(zhì)粒，使用PCR和酶切方法進(jìn)行鑒定（圖2），將鑒定正確的重組質(zhì)粒測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，克隆獲得的N基因序列與NCBI中AB672619.1的同源性達(dá)到99%。

圖1 VHSV N基因擴(kuò)增電泳圖

圖2 pNH-MS2his-N重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖

2.2 病毒樣顆粒鑒定

使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用Ni-NTA Fast Start Kit純化表達(dá)后的病毒樣顆粒，對(duì)純化后的病毒樣顆粒進(jìn)行鑒定，分別設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組；使用熒光定量RT-PCR和熒光定量PCR方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示：在熒光定量RT-PCR試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組有擴(kuò)增信號(hào)，對(duì)照組無(wú)擴(kuò)增信號(hào)；在熒光定量PCR試驗(yàn)中，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)（圖3）。

圖3 病毒樣顆粒熒光定量檢測(cè)

2.3 數(shù)字PCR定值

將100 μL病毒樣顆粒提取RNA；對(duì)RNA使用無(wú)RNase的水10倍比系列稀釋至107；使用Bio-RAD QX200系統(tǒng)進(jìn)行定值，發(fā)現(xiàn)最低檢測(cè)限為106稀釋度，在106稀釋度檢測(cè)到拷貝數(shù)為8（圖4）。由此計(jì)算得到病毒樣顆粒的濃度約為8×106copies/μL。

圖4 不同濃度下的病毒樣粒子RNA微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

Armored RNA技術(shù)是根據(jù)早期對(duì)MS2的研究而衍生出來(lái)的。在研究中發(fā)現(xiàn)，MS2噬菌體衣殼蛋白能夠優(yōu)先包裝含有19mer包裝位點(diǎn)的RNA。利用MS2噬菌體的這一特點(diǎn)，將需包裝的RNA克隆至MS2噬菌體的19mer包裝位點(diǎn)后，即可制備由噬菌體衣殼蛋白包被需包裝RNA的假病毒粒子。在以上原理的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)室制備了能夠表達(dá)病毒樣顆粒的表達(dá)載體。將VHSV的N基因序列克隆至表達(dá)載體中，通過(guò)表達(dá)純化可以得到含有VHSV N基因RNA的病毒樣顆粒[7-9]。對(duì)純化的病毒樣顆粒進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中的未處理病毒樣顆粒，在熒光定量RT-PCR試驗(yàn)和熒光定量PCR試驗(yàn)中均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，而試驗(yàn)組病毒樣顆粒經(jīng)過(guò)核酸提取后在熒光定量RT-PCR試驗(yàn)中有擴(kuò)增條帶，在熒光定量PCR試驗(yàn)中無(wú)擴(kuò)增信號(hào)。鑒定結(jié)果說(shuō)明，病毒樣顆粒成功內(nèi)包裹了N基因的RNA。

數(shù)字PCR技術(shù)是一種新型的核酸定量技術(shù)。將標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增反應(yīng)體系分布至一定數(shù)量的微滴或是芯片的小室中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后收集每個(gè)獨(dú)立的微滴或芯片小室的熒光信號(hào)進(jìn)行計(jì)數(shù)。該技術(shù)無(wú)需通過(guò)任何標(biāo)準(zhǔn)物或外標(biāo)，只通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算樣本中的核酸拷貝數(shù)[10-12]。這種方法具有操作方便、檢測(cè)通量高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已成為分子生物學(xué)研究中的重要手段[10]。本研究初步利用數(shù)字PCR，對(duì)含有VHSV N基因的病毒樣顆粒進(jìn)行定值，計(jì)算得到制備的病毒樣顆粒為8×106copies/μL。其定值過(guò)程包含了RNA反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增過(guò)程，定值結(jié)果更加適用于病毒樣顆粒作為標(biāo)準(zhǔn)使用。但數(shù)字PCR的定值也存在反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增效率如何體現(xiàn)到最終定值結(jié)果中的問(wèn)題。這將在以后進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，含有VHSV N基因的病毒樣顆粒具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）在生物安全方面，由于病毒樣顆粒不具備再?gòu)?fù)制增殖的能力和傳染性，因此不會(huì)有散毒風(fēng)險(xiǎn)；（2）病毒樣顆粒具備病毒的結(jié)構(gòu)，需要進(jìn)行核酸提取才能擴(kuò)增，因此可以對(duì)RNA病毒檢測(cè)的全過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控，避免了在核酸抽提過(guò)程中出現(xiàn)假陰性；（3）病毒樣顆粒具有耐RNase的優(yōu)點(diǎn)，由此解決了RNA標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定性的問(wèn)題。因此，本研究所表達(dá)的含有VHSV N蛋白R(shí)NA病毒樣顆粒在未來(lái)的VHSV檢測(cè)中具有很好的應(yīng)用前景。

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Construction and Valuation of Virus-like Particles Containing N Gene of Viral Hemorrhagic Septicemia of Salmonids Virus

Wang Qun，Jiang Fan，Yue Zhiqin，Sun Tao，Zheng Xiaolong，Zhang Xiaowen，F(xiàn)ang Baohai

（Technical Center of Shandong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong 266002，China）

To construct virus-like particles（VLPs）standard sample containing N gene of Viral hemorrhagic septicemia virus（VHSV），the N gene of VHSV was amplified by RT-PCR，then the gene was cloned into vector pNH-MS2his contained MS2phage coat protein，and the recombinant prokaryotic expression vector pNH-MS2his-N was constructed.The recombinant plasmid pNH-MS2his-N transformed into E.coli strain BL21（DE3）was induced to expression and purification with 1 mmol/L IPTG. The VLPs were identified and the stability of VLPs was tested by real-time RT-PCR.The concentration of VLPs was valued by digital PCR. The results showed that the VLPs contained N gene RNA and had good stability. The concentration of VLPs was 8×106copies/mL. The results showed that the VLPs could be used as a standard and quality control in RNA virus detection.

Viral hemorrhagic septicemia virus（VHSV）；virus-like particles（VLPs）；N gene；digital PCR

“十二五”國(guó)家科技支撐項(xiàng)目（2013BAD12B02-03）

S852.65

A

1005-944X（2018）01-0100-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2018.01.027

朱迪國(guó)）