袁向芬，石素婷，呂繼洲，吳紹強(qiáng)

（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動物檢疫研究所，北京 100176）

真鯛虹彩病毒LAMP檢測方法的建立

袁向芬，石素婷，呂繼洲，吳紹強(qiáng)

（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動物檢疫研究所，北京 100176）

為建立一種檢測真鯛虹彩病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）方法，滿足口岸、養(yǎng)殖場對該病的快速監(jiān)測的需求，本研究比對分析了GenBank中公布的真鯛虹彩病毒基因組序列，篩選其主要衣殼蛋白MCP基因保守區(qū)序列，進(jìn)行LAMP引物設(shè)計，建立了真鯛虹彩病毒LAMP檢測方法。對擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件為62 ℃，45 min。靈敏度試驗結(jié)果顯示，該方法最低檢測限為100拷貝/μL目的基因。特異性試驗結(jié)果顯示，該方法不與流行性造血器官壞死病毒（EHNV）、蛙病毒3型（FV3）、甲魚虹彩病毒（STIV）發(fā)生交叉反應(yīng)。結(jié)果表明，本研究建立的LAMP方法具有良好的敏感性和特異性。對5份疑似真鯛虹彩病毒感染的臨床樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果與世界動物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的PCR方法檢測結(jié)果符合率為100%。研究表明，本方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)，以及儀器設(shè)備簡單、操作便捷、結(jié)果直觀等優(yōu)點，非常適合作為初篩手段，應(yīng)用于養(yǎng)殖場、口岸等一線的疫病監(jiān)測。

水生動物疫??；真鯛虹彩病毒；環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增；快速檢測

真鯛虹彩病毒（Red sea bream iridovirus，RSIV）屬于虹彩病毒科（Iridoviridae）、細(xì)胞腫大病毒屬（Megalocytivirus）[1-2]。該病毒于1990年首次在日本四國島的人工養(yǎng)殖患病真鯛中被發(fā)現(xiàn)[3]，主要感染真鯛、花鱸、條石鯛等30余種海水魚類[4-5]?；疾◆~類主要表現(xiàn)為昏睡、嚴(yán)重貧血、鰓上游瘀斑、脾腫大等癥狀。該病大多在自然界突然暴發(fā)，難以治療，致死率高，是目前對各國海水養(yǎng)殖危害最為嚴(yán)重的疾病之一[6-8]。為此，該病被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列入必檢疫病名錄，被我國列為二類疫病。韓國在實施的《水生動物疾病管理法》中要求入境的真鯛、牙鲆、大黃魚、花鱸、條紋鱸等35種魚類必須進(jìn)行RSIV檢驗檢疫[9]。

考慮到RSIV的危害性，建立一種快速、高效、靈敏的現(xiàn)場檢疫檢測方法，對于該病的及時發(fā)現(xiàn)、防治手段的有效實施、疫情的迅速控制而言意義重大。然而目前，RSIV的確診方法，如病毒分離、免疫熒光等[10-11]，由于缺乏合適的細(xì)胞培養(yǎng)系，以及免疫學(xué)檢測范圍窄且存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象，無法被廣泛應(yīng)用。常規(guī)PCR、熒光PCR等分子檢測方法[12-14]，因需要昂貴儀器或電泳分析等后續(xù)操作，無法有效應(yīng)用于口岸快速檢測。鑒于以上不足，本研究以RSIV MCP基因保守區(qū)為模板，建立了一種環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法（Loop-medieated isothermal amplification，LAMP），用于RSIV的檢測。該方法快速、靈敏、特異，在簡單的水浴恒溫環(huán)境下，即可完成對靶基因的大量擴(kuò)增，借助染料即可進(jìn)行結(jié)果的可視化判定。本方法作為一種初篩手段，可大大增加口岸、養(yǎng)殖場的RSIV檢疫效率，降低檢疫工作中人員、時間等成本的投入。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病毒及樣品 真鯛虹彩病毒（RSIV）、流行性造血器官壞死病毒（EHNV）、蛙病毒3型（FV3）、甲魚虹彩病毒（STIV）：深圳出入境檢驗檢疫局劉葒研究員饋贈；真鯛虹彩病毒MCP基因陽性克隆質(zhì)粒、5份疑似RSIV陽性樣品（鱸魚）：本實驗室保存。

1.1.2試劑和儀器 DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取試劑盒：購自凱杰（QIAGEN）生物工程有限公司；環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法DNA擴(kuò)增試劑盒及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增實時濁度儀（LA-320c）：購自北京藍(lán)譜生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1樣品 對RSIV、EHNV、FV3、STIV等4種病毒細(xì)胞培養(yǎng)液及5份疑似RSIV陽性樣品（鱸魚），均按照DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取試劑盒操作手冊，進(jìn)行樣品基因組DNA的提取，完成后置于?20 ℃冰箱備用。將實驗室保存的RSIV MCP基因陽性質(zhì)粒進(jìn)行濃度測定后，10倍倍比稀釋為 1×107、1×106、1×105、……、1×101copies/μL，然后將其作為標(biāo)準(zhǔn)樣品置于?20 ℃冰箱備用。

1.2.2LAMP引物設(shè)計 根據(jù)Genbank中RSIV MCP基因的保守區(qū)序列，進(jìn)行LAMP引物設(shè)計；利用Primer Explorer version 4.0 在線引物設(shè)計軟件，設(shè)計多套LAMP引物。由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行引物合成，并通過預(yù)實驗進(jìn)行比較篩選，最終確定1套LAMP引物（表1）：外引物（RSIV-F3/RSIV-B3）、內(nèi)引物（RSIV-FIP/RSIVBIP）、環(huán)引物（RSIV-LF/RSIV-LB）。

表1 RSIV-LAMP引物設(shè)計

1.2.3RSIV-LAMP檢測方法的建立 為實時監(jiān)測不同反應(yīng)條件下LAMP的進(jìn)展情況，借助環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增實時濁度儀LA-320c，進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化；在Loopamp DNA Ampli-fi cation Kit（RT-LAMP）試 劑 盒（Eiken Chemical Co.，Ltd，Tokyo，Japan）基礎(chǔ)上，主要對反應(yīng)的引物濃度、退火溫度（60～65 ℃）和反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)過一系列優(yōu)化，確定RSIV-LAMP方法的反應(yīng)體系（25 μL）為：RSIV-FIP和 RSIV-BIP各 40 pmol，RSIV-F3和RSIV-B3各5 pmol，RSIV-LF和RSIV-LP各20 pmol，2×Reaction Mix 12.5 μL ﹝ Tris-HCl（pH 8.8）40 mmol/L、KCl 20 mmol/L、MgSO416 mmol/L、（NH4）2SO420 mmol/L、Tween 20 0.2%、Betaine 1.6 mol/L、dNTPs 2.8 mmol/L ﹞，Enzyme 1.0 μL，核酸DNA 2 μL。另外，在反應(yīng)液中加入1 μL熒光試劑 FDR（Eiken Chemical Co.，Ltd，Tokyo，Japan），進(jìn)行反應(yīng)結(jié)果的可視化判定。反應(yīng)程序為：62 ℃恒溫下擴(kuò)增40 min；80 ℃酶滅活5 min。既可在恒溫水浴鍋中進(jìn)行，也可在金屬浴及各種核酸擴(kuò)增儀等儀器中進(jìn)行。反應(yīng)完成后，通過肉眼觀察顏色變化即可判定反應(yīng)陰陽性。

1.2.4特異性及敏感性試驗 用優(yōu)化好的LAMP方法，對提取的RSIV、EHNV、FV3、STIV DNA進(jìn)行檢測，以驗證所建方法的特異性；對10倍系列稀釋的RSIV陽性質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，以驗證所建方法的最低檢測限。

1.2.5樣品檢測 以提取的5份疑似RSIV陽性樣品（鱸魚）DNA為模板，用所建RSIV-LAMP檢測方法與OIE推薦的PCR檢測方法[15]同時進(jìn)行檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗

以 提 取 的 RSIV、EHNV、FV3、STIV DNA為模板，用優(yōu)化好的方法進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果顯示，僅RSIV的擴(kuò)增結(jié)果為陽性，其它3種病毒均未擴(kuò)增，說明該方法具有良好的特異性，不與其它相似或同屬病毒發(fā)生交叉反應(yīng)（圖1）。

圖1 RSIV-LAMP方法特異性試驗

2.2 敏感性試驗

以10倍系列稀釋的RSIV MCP基因陽性克隆質(zhì)粒為模板，用優(yōu)化好的方法進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果顯示，本方法的最低檢測限為1×102copies/μL，可以滿足臨床樣品檢測的需要（圖2）。

圖2 RSIV-LAMP方法敏感度試驗

2.3 樣品檢測

用建立的RSIV-LAMP檢測方法，對實驗室保存的5份疑似RSIV陽性樣品DNA進(jìn)行檢測，同時用OIE推薦的RSIV-PCR方法，對5份樣品進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示，兩種方法檢測結(jié)果的符合率為100%，均檢測到2份陽性樣品、3份陰性樣品（圖3）。

圖3 樣品檢測結(jié)果

3 討論

鑒于RSIV的高致病性、高致死率及分布的廣泛性，世界各地在相關(guān)動物及產(chǎn)品的檢疫中，對其檢疫均較為嚴(yán)格。目前，口岸、養(yǎng)殖場等一線對該病的檢測主要依賴PCR方法。原因在于RSIV血清學(xué)方法所需材料不易獲得，存在交叉反應(yīng)且操作較為冗長繁瑣。而PCR方法僅需提取基因組后直接進(jìn)行擴(kuò)增，并運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳法即可進(jìn)行結(jié)果判定。這大大減少了樣品檢測周期。然而，PCR方法并不能完全滿足在環(huán)境簡單、缺乏專業(yè)人員條件下大量臨床樣品的快檢需求。

LAMP方法自2000年被首次報道后，因其具有靈敏度和特異性高、快速、便捷、易于操作等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于動物疫病檢疫工作中[16-19]。該技術(shù)依賴于能夠識別靶序列上6個特異性區(qū)域的引物和1種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在簡單的等溫條件下即可實現(xiàn)靶序列的高效擴(kuò)增[20-21]，整個過程中，對環(huán)境、儀器等條件的要求均較為簡單，特別適用于動物疫病的現(xiàn)場檢疫。

本研究借助LAMP技術(shù)，以RSIV高度保守的主要衣殼蛋白（MCP）基因為模板，設(shè)計LAMP引物，并通過一系列試驗驗證了本方法的敏感性、特異性及準(zhǔn)確性。本方法可在簡單的恒溫水浴鍋中（62 ℃）進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時間僅需45 min；反應(yīng)前向反應(yīng)液中加入染料，即可直接用肉眼對結(jié)果進(jìn)行快速判定。用OIE推薦的PCR方法同時對樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果與其一致。綜上，運(yùn)用本方法可在75 min內(nèi)完成對樣品的RSIV檢測（包括核酸提取、LAMP擴(kuò)增、結(jié)果同步判定），相比較PCR方法（包括核酸提取、PCR擴(kuò)增、電泳）可節(jié)約時間近3 h。驗證結(jié)果說明，本方法在滿足RSIV臨床檢測的同時，還具備與PCR無法比擬的時間優(yōu)勢，更適用于大量臨床樣品的快速初篩。綜上，運(yùn)用本方法可在75 min內(nèi)完成對樣品的RSIV檢測（包括核酸提取、LAMP擴(kuò)增、結(jié)果同步判定），相比較PCR方法（包括核酸提取、PCR擴(kuò)增、電泳）可節(jié)約時間近3 h。驗證結(jié)果說明，本方法在滿足RSIV臨床檢測的同時，還具備與PCR無法比擬的時間優(yōu)勢，更適用于大量臨床樣品的快速初篩。

4 結(jié)論

本研究通過一系列優(yōu)化，建立了基于RSIV MCP基因的LAMP技術(shù)。該技術(shù)具有良好的敏感性和特異性，最低檢測限可達(dá)102copies/μL，且不與其它同屬常見水生動物病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，在臨床樣品快速初篩方面具有很大優(yōu)勢，可為口岸、養(yǎng)殖場等一線的動物疫病檢測，提供有效的技術(shù)支撐。

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Establishment of LAMP for Detection of Red Sea Bream Iridovirus

Yuan Xiangfen，Shi Suting，Lü Jizhou，Wu Shaoqiang

（Institute of Animal Quarantine，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100176，China）

To develop a Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）method of Red sea bream iridovirus（RSIV）for rapid monitoring of the disease at port of entry and fishery，the RSIV genome sequence published in GenBank was compared and analyzed. The conservative region sequence of the main capsid protein MCP gene was screened out，the LAMP primers were designed，and LAMP for detection of RSIV was established. The conditions of amplification were optimized，and the best reaction condition was 62 ℃，45 min. Sensitivity test results showed that the minimum detection limit for this method was 100 copies/μL. Specific test results showed that this method did not cross reaction with EHNV，F(xiàn)V3 and STIV，with good sensitivity and specificity. By detection of 5 clinical samples，results showed that the coincidence rate of the test results with that of the PCR method recommended by OIE was 100%. This method was a rapid，simple，specific and sensitive assay with simple instruments and visualization results，which was suitable for being used as a screening method for monitoring diseases at ports and fish farms.

aquatic animal diseases；Red sea bream iridovirus；Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）；rapid detection

國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0501100）；國家科技支撐計劃課題（2013BAD12B01）；中國檢驗檢疫科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項目（2015JK003）

吳紹強(qiáng)

S852.65

A

1005-944X（2018）01-0095-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2018.01.026

朱迪國）