王楷宬，王素春，莊青葉，邱 源，侯廣宇

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

G群輪狀病毒鴿群分離株的全基因分析

王楷宬，王素春，莊青葉，邱 源，侯廣宇

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

為分析鴿輪狀病毒中國(guó)分離株的特性，采用高通量測(cè)序方法，測(cè)定從山東省青島市某活禽交易市場(chǎng)采集的肉鴿糞便樣品中分離的輪狀病毒基因組，并對(duì)其進(jìn)行特性分析與比較基因組研究。結(jié)果顯示，G群輪狀病毒鴿群分離株全基因包含11個(gè)節(jié)段，總長(zhǎng)度為17 803 bp，具有與其他輪狀病毒相似的結(jié)構(gòu)和基因順序。與24株輪狀病毒代表性毒株的VP6氨基酸序列進(jìn)化分析結(jié)果，以及其他5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列遺傳進(jìn)化分析結(jié)果均證實(shí)，該病毒屬G群輪狀病毒。該毒株與2011年從香港鴿群中分離的G群輪狀病毒同源性最高，但衣殼糖蛋白VP7的氨基酸序列同源性僅為71.7%，抗原性存在較大差異。

鴿；輪狀病毒；基因組；高通量測(cè)序

輪狀病毒（Rotavirus）是動(dòng)物腹瀉病的重要病原之一，1969年首先在腹瀉的犢牛糞便中被發(fā)現(xiàn)，此后在人、綿羊、豬、馬、犬、貓、兔、鼠、猴和禽中均有發(fā)現(xiàn)，因病毒粒子的電鏡觀察形態(tài)與車輪相似而得名。該病毒顆粒直徑為70 nm，由3層構(gòu)成。完整的病毒顆粒表面光滑，稱光滑型顆粒。外殼自然脫落或經(jīng)化學(xué)處理脫落后，變成直徑50 nm的粗糙型顆粒。粗糙型顆粒進(jìn)一步降解后，輻條脫落而留下約37 nm的病毒核心結(jié)構(gòu)。核心結(jié)構(gòu)呈六角形[1]。輪狀病毒基因組為分節(jié)段的雙鏈RNA，含11個(gè)片段，分別編碼病毒蛋白VP1-4、VP6、VP7和非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1-5。根據(jù)中和試驗(yàn)，該病毒分為A、B、C、D、E、F、G和H群。

禽腹瀉是嚴(yán)重影響禽存活率與生產(chǎn)力的一種常見(jiàn)疾病，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害較嚴(yán)重。研究證實(shí)禽類因腹瀉而死亡的數(shù)量占總死亡數(shù)的50%～70%以上。輪狀病毒、腺病毒、皰疹病毒、細(xì)小病毒、類細(xì)小病毒和副粘病毒，以及大腸桿菌等均可引起禽類腹瀉。其中，禽輪狀病毒是引起禽類病毒性腹瀉的最重要病原之一，臨床上引起禽類拉稀、消瘦、生長(zhǎng)發(fā)育受阻等[2]。至今輪狀病毒A群[3]、D群[4]、G群[5]和F群[6]均能感染禽類。1981年Vindevogel[3]從鴿子糞便中檢測(cè)到A群輪狀病毒。之后又有研究者從鴿子中分離到輪狀病毒，并對(duì)其特性進(jìn)行研究[7-9]。2013年Tung等[10]從鴿群中首次檢測(cè)到G群輪狀病毒，并解析其基因組。2017年P(guān)auly等[11]從尼日利亞的鴿群中分離到D群輪狀病毒。

我國(guó)對(duì)禽群輪狀病毒的研究主要針對(duì)雞群的感染狀況和病原特性。馬洪超等[12]于1989年首次在我國(guó)雞群中分離到A群輪狀病毒。之后，有研究人員對(duì)雞輪狀病毒的特性等進(jìn)行研究[13]。但是我國(guó)對(duì)其他禽類感染的輪狀病毒研究極少，也未見(jiàn)鴿群中檢測(cè)到輪狀病毒的報(bào)道。為了解我國(guó)感染鴿群的輪狀病毒特性，本研究采用高通量測(cè)序方法，對(duì)首次在我國(guó)肉鴿中分離的一株輪狀病毒進(jìn)行測(cè)序，分析該病毒的基因組特性。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

Ion PGM Template OT2 400 Kit、Ion PGM Sequencing 400 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2%Agarose、Ion 316 Chip Kit V2、Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Qubit核酸濃度測(cè)定儀及配套試劑均購(gòu)自Life technologies公司；超凈工作臺(tái)（美國(guó)Forma Scientific）；移液器（Eppendorf）；孵化器（德州誠(chéng)信孵化設(shè)備有限公司）；高速臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Heraeus Biofuge primoR）；PCR擴(kuò)增儀（Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600）。高性能計(jì)算平臺(tái)為Dell T630塔式服務(wù)器，具有2顆Intel（R）Xeon（R）CPU E5-2620 v3 @2.40GHz，內(nèi)存264 G，存儲(chǔ)23 T，操作系統(tǒng)版本CentOS Linux release 7.1.1503（Core）。

1.2 核酸提取

2014年秋季自山東省青島市某活禽交易市場(chǎng)采集的肉鴿糞便樣品中檢測(cè)到鴿輪狀病毒（pigeon/China/10/2014）[14]；將該份樣品充分混勻后，經(jīng)高速離心和過(guò)濾，去除大分子物質(zhì)和細(xì)菌，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen，德國(guó)）提取病毒核酸。

1.3 高通量測(cè)序（NGS）文庫(kù)構(gòu)建

對(duì)提取的病毒核酸，采用中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心報(bào)道的方法[14]進(jìn)行NGS文庫(kù)構(gòu)建。具體 方 法：8 μL 病 毒 RNA 中 加 入 1 μL 100 μmol/L的引物A15N6和2 μL無(wú)核酸酶的水進(jìn)行混合，72 ℃ 5 min；然后將RNA引物混合物放在冰上孵育至少3 min；在混合物中加入4 μL 5×first-strand buffer、1 μL dNTP（100 μmol/L）、2 μL DTT（0.1 mol/L）、1 μL RNaseOUT ? Recombinant Ribonuclease Inhibitor（40 U/μL） 和 1 μL SuperScript? III Reverse Transcriptase（200 U/μL）（Invitrogen，USA），25 ℃反應(yīng) 15 min，42 ℃反應(yīng) 30 min，70 ℃ 15 min，終止反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物中再加入1 μL RNase H（TaKaRa，Japan），37 ℃ 反應(yīng)20 min；采用DynaMag?-2 Magnet 和Agencourt? AMPure? XP Reagent（Beckman Coulter，USA）純化合成第一鏈cDNA；在純化的第一鏈cDNA中加入引物B15N6，70 ℃ 5 min；再加入 1 μL Klenow fragment（5 U）（NEB，USA）、5 μL 10×NEBuffer 2、2 μL dNTP（100 μmol/L） 和1 μL DTT（0.1 mol/L），37 ℃反應(yīng) 30 min；最后采用 1×Phusion High-Fidelity Buffer，10 μmol/L 引 物A30 和B30（表1），0.5 U Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（NEB，USA），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物采用E-Gel? SizeSelect? Agarose Gel進(jìn)行電泳；將篩選和回收的約450 bp擴(kuò)增產(chǎn)物作為NGS文庫(kù)。

表1 引物與引物序列

1.4 NGS測(cè)序

將NGS文庫(kù)稀釋為26p mol/L，應(yīng)用Ion PGM Template OT2 400 Kit對(duì)DNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序前的樣品處理。處理后的樣品加樣至Ion 316 芯片，置于PGM測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

NGS測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后，采用CLC genomics workbench 8.5.1（Qiagen，Germany）， 將 測(cè) 序得到的reads參考GenBank中已發(fā)表的鴿輪狀病毒Pigeon/HK18全基因序列[10]（GenBank登錄號(hào)：NC_019712）進(jìn)行mapping 拼接，并分析拼接完成的基因組中的ORF，注釋后的序列提交GenBank。

1.6 基因組特性分析

已報(bào)道的文獻(xiàn)[15]和病毒分類委員會(huì)第九次分類報(bào)告中均以VP6氨基酸的相似性來(lái)確定輪狀病毒的分群，若相似性大于60%則判為同一個(gè)群。本文采用MEGA 6.0[16]將Pigeon/China/10/2014的VP6氨基酸序列分別與GenBank中輪狀病毒科的代表毒株（表2）的VP6氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和分析，分析該毒株的分類地位。代表毒株中包含雞、火雞、鴿子、人、鼠、牛、羊、豬、兔、馬、犬、貓、獼猴和駱馬等動(dòng)物的輪狀病毒分離株。同時(shí)，將所有禽類感染的已報(bào)道全基因的毒株與部分群的人源毒株的基因進(jìn)行下載（參與VP6分析的毒株只有部分報(bào)道了全基因），應(yīng)用MEGA 6.0[16]分別與Pigeon/China/10/2014其余5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（VP1-4和VP7）的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和分析。將此毒株的所有節(jié)段氨基酸序列與已報(bào)到的所有3株鴿源輪狀病毒進(jìn)行同源性分析。

表2 基因比較分析所使用的輪狀病毒毒株

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組解析

芯片上樣率為73%；測(cè)序文庫(kù)得到質(zhì)量較高的序列數(shù)據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)。CLC genomics workbench 8.5.1拼接得到鴿輪狀病毒所有的11個(gè)節(jié)段，總長(zhǎng)度為17 803 bp；GenBank登錄號(hào)分別為MF768259～MF768269。Pigeon/China/10/2014 基 因組各基因節(jié)段詳細(xì)信息見(jiàn)表3。

表3 Pigeon/China/10/2014基因組各基因節(jié)段的詳細(xì)信息

2.2 基因組比較分析

VP6氨基酸序列分析顯示，該毒株屬于G群輪狀病毒（圖1），且各結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸遺傳進(jìn)化關(guān)系（圖2、圖3、圖4、圖5、圖6）基本一致，均與2011年自香港分離的鴿源輪狀病毒同源性最高。本研究分離的Pigeon/China/10/2014屬G群輪狀病毒，與Pigeon/HK18同源性最高，各基因氨基酸同源性為71.7%～99.0%；而與鴿群分離的A群輪狀病毒PO-13同源性較低，11個(gè)基因氨基酸序列同源性均低于25%（表3）。

3 討論與結(jié)論

輪狀病毒可感染多種宿主。感染禽類宿主的報(bào)道主要集中于雞，其次是火雞和鴿。文中對(duì)所有已報(bào)道全基因的禽源輪狀病毒進(jìn)行基因進(jìn)化分析，綜合已發(fā)表的文獻(xiàn)[11]發(fā)現(xiàn)，雞可感染A、D、F、G群輪狀病毒，鴨、鵝、火雞和鵪鶉可感染A群輪狀病毒，鴿子能感染A、D和G群輪狀病毒。本研究之前共有12株鴿源輪狀病毒被報(bào)道，分別為日本分離的A群輪狀病毒、香港分離的G群輪狀病毒、尼日利亞分離的9株A群和1株D群輪狀病毒（未公布基因序列）。我國(guó)未見(jiàn)其他從鴿群中分離到輪狀病毒的報(bào)道。

圖1 輪狀病毒VP6氨基酸序列進(jìn)化分析

圖2 輪狀病毒VP1氨基酸序列進(jìn)化分析

圖3 輪狀病毒VP2氨基酸序列進(jìn)化分析

圖4 輪狀病毒VP3氨基酸序列進(jìn)化分析

圖5 輪狀病毒VP4氨基酸序列進(jìn)化分析

圖6 輪狀病毒VP7氨基酸序列進(jìn)化分析

本研究采用高通量測(cè)序方法對(duì)一株鴿群分離的輪狀病毒全基因進(jìn)行測(cè)序和分析，通過(guò)VP6的氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)和同源性分析，確定該病毒為G群輪狀病毒。對(duì)此毒株其余結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行分析，也證實(shí)該病毒應(yīng)屬G群。輪狀病毒基因組分為11個(gè)節(jié)段，其中結(jié)構(gòu)蛋白VP1具有依賴RNA的RNA聚合酶作用，VP2構(gòu)成病毒的核心衣殼，VP3作為病毒RNA的加帽酶發(fā)揮作用。另外非結(jié)構(gòu)蛋白主要參與病毒的復(fù)制（NSP2-NSP3）與形態(tài)發(fā)生（NSP4-NSP5），與宿主蛋白相互作用，共同影響發(fā)病機(jī)理及免疫反應(yīng)（NSP1）。VP7和VP4是病毒主要的交叉中和抗原，自然感染時(shí)能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，并且在 RV 的感染過(guò)程中，VP7和VP4能夠相互作用，在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用[17]。

從該病毒與輪狀病毒屬其他毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系來(lái)看，本研究測(cè)序的毒株與2011年香港分離的鴿源輪狀病毒最近，除VP7基因外，其余10個(gè)基因的氨基酸序列同源性均達(dá)到90%以上。VP7基因編碼輪狀病毒的衣殼糖蛋白。該蛋白存在于輪狀病毒表面，是病毒中和抗體的主要結(jié)合位點(diǎn)。這說(shuō)明此次分離的病毒雖與2011年香港分離的鴿源輪狀病毒同屬G群，但其抗原性存在較大差異。香港分離的G群輪狀病毒來(lái)源于野鴿，而青島市分離的此株G群輪狀病毒分離自活禽市場(chǎng)售賣的肉鴿。VP7的差異是否與宿主不同有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究部。

綜上所述，本文報(bào)道了世界上第2株分離自鴿子的G群輪狀病毒全基因，同時(shí)對(duì)禽源的各群輪狀病毒進(jìn)行進(jìn)化分析。研究結(jié)果有利于了解我國(guó)鴿輪狀病毒特性，進(jìn)一步明確其與其他輪狀病毒的進(jìn)化關(guān)系。

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Genome Analysis of the Pigeon Rotavirus Group G Isolated in China

Wang Kaicheng，Wang Suchun，Zhuang Qingye，Qiu Yuan，Hou Guangyu

（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032，China）

To analyze the characterization of the pigeon rotavirus isolated in China，the genome of the pigeon rotavirus isolated from a meat pigeon in a living poultry market of Qingdao City，Shandong Province was sequenced by highthroughput sequencing. The genome of the isolate was analyzed and compared with other rotaviruses. The results showed that 11 genes were included in the genome with a total length of 17 803 bp，of which the genomic organization，structure and gene order were similar to other rotavirus. It was showed that the isolate was rotavirus group G through evolution analysis of VP6 amino acid sequence of 24 rotavirus representative strains and analysis of genetic evolution of other 5 structural protein amino acid sequences. The identity of the isolate and the group G rotavirus from Hongkong's pigeon in 2011 was the highest，while the identity of the capsid glycoprotein VP7 amino acid sequence between the two viruses was only 71.7%. The antigenicity of the two viruses was different.

pigeon；Rotavirus；genome；high-throughput sequencing

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1200500）；中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心創(chuàng)新基金（2015IF-0004FF）

S851.3

A

1005-944X（2018）01-0085-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2018.01.024

朱迪國(guó)）