張 志，郝占武，2，楊旭兵，張美晶，吳發(fā)興，李曉成

（1. 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266019；3. 青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114）

豬圓環(huán)病毒3型半巢式PCR方法的建立和應(yīng)用

張 志1，郝占武1，2，楊旭兵3，張美晶1，吳發(fā)興1，李曉成1

（1. 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266019；3. 青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114）

為建立快速檢測豬圓環(huán)病毒3型（PCV-3）的方法，以GenBank上登陸的我國PCV-3全基因組為參考毒株，設(shè)計(jì)3條引物，建立了 PCV-3半巢式PCR診斷方法。本方法可以擴(kuò)增出大小為249 bp的特異性條帶，與預(yù)期大小一致，而豬圓環(huán)病毒1型和2型、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒等對照樣品均未擴(kuò)增出特異性條帶。將PCV-3的陽性DNA稀釋后作為模板，發(fā)現(xiàn)半巢式PCR的檢測極限可以達(dá)到5×10-3μg/mL。對臨床80份樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)半巢式PCR的陽性檢出率可以達(dá)到27.5%（22/80），而常規(guī)PCR的檢出率僅為6.25%（5/80）。檢測結(jié)果表明，本文建立的半巢式PCR方法較為準(zhǔn)確、特異和敏感，適用于PCV-3的快速檢測和流行病學(xué)調(diào)查。

豬圓環(huán)病毒3型；半巢式-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；快速檢測；流行病學(xué)調(diào)查

圓環(huán)病毒（Circovirus）是目前最小的單鏈環(huán)狀DNA病毒，感染宿主比較廣泛，可感染家禽、豬、狗、狐貍、魚類、昆蟲等多種動(dòng)物[1-4]。據(jù)報(bào)道，感染豬的圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）主要有PCV-1和PCV-2兩個(gè)亞型。其中，PCV-1感染后不引起任何臨床癥狀，PCV-2感染后則會引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥（PMWS）、皮炎性腎病、漸進(jìn)性消瘦、呼吸道癥狀、黃疸、生長發(fā)育不良等[5-8]。PCV-2自1998年在我國首次被發(fā)現(xiàn)以來，在我國豬群中迅速蔓延，呈現(xiàn)出覆蓋面廣、感染率高的特征，已成為危害我國豬群的主要病原之一[9-11]。2016年美國學(xué)者Phan等[12]報(bào)道了一種新豬圓環(huán)病毒亞型（PCV-3）。攜帶該病原的豬呈現(xiàn)生長發(fā)育不良、心臟和多系統(tǒng)炎性浸潤等病理變化。隨后Palinski等[13]也從表現(xiàn)皮炎腎病綜合癥的豬體內(nèi)檢測到了PCV-3。2017年我國首次從發(fā)病豬樣品中檢測到PCV-3，并測定了該毒株的全基因組[14]，然后提交到了GenBank中（PCV3-China/GD2016）。這些研究工作為建立PCV-3的PCR診斷方法提供了借鑒。PCR作為診斷病原最常用的方法，早已在疫病診斷方面被廣泛應(yīng)用，但鑒于PCV-3是一種新發(fā)病原，尚沒有開展PCR方法的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)此序列，以及前期檢測到PCV-3陽性樣品的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建了普通的PCV-3 PCR診斷方法，但是在檢測中又發(fā)現(xiàn)普通PCR 的敏感性難以滿足臨床實(shí)踐需要，因此又進(jìn)一步研發(fā)了半巢氏PCR診斷方法，從而為開展PCV-3在豬群中的流行病學(xué)調(diào)查、檢測和診斷提供了技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 病毒和樣品

PCV-3陽性樣品（SD66）：本實(shí)驗(yàn)室鑒定和保存。80份豬臨床樣品：采集自福建、山東、河南等省份的豬腹瀉樣品或健康組織。PCV-1、PCV-2、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）：中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)畜病監(jiān)測室分離鑒定和保存。

1.2 主要試劑

Premix Ex Taq試劑盒：TaKaRa公司產(chǎn)品；病毒DNA提取試劑盒（DNAzol）：Life公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)和合成

以NCBI 上公開的我國PCV-3全基因組序列（KY418606.1，即PCV3-China/GD2016病毒株）為參考序列，利用DNAStar軟件設(shè)計(jì)3條引物，用于進(jìn)行半巢式PCR反應(yīng)。引物序列由北京睿博生科有限公司合成（表1），其中PCV3-F1/2-582為一擴(kuò)和二擴(kuò)的共同上游引物。

表1 用于半巢氏PCR擴(kuò)增的PCV-3引物

1.4 樣品DNA提取

根據(jù)DNAzol說明書，從豬樣品中提取總基因組DNA，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR方法和巢式PCR方法的建立

1.5.1第1次PCR擴(kuò)增 以從PCV-3陽性樣品中提取的DNA為模板，用設(shè)計(jì)引物PCV3-F1/2-582和PCV3-R1-1158作為上下游引物，進(jìn)行第1次PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：Premix EX-Taq反應(yīng)液12.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL（10 μmol/L），DNA 2 μL，用 ddH2O 補(bǔ)充至 25 μL。反應(yīng)擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s），72 ℃ 10 min 。

1.5.2半巢氏PCR方法的建立 以1.5.1獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以PCV3-F1/2-582和PCV3-R2-830為上下游引物，進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：Premix EX-Taq反應(yīng)液12.5 μL，上游引物和下游引物各 1 μL（10 μmol/L），一擴(kuò)產(chǎn)物 0.5 μL，用ddH2O 補(bǔ)充至25 μL。巢氏擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95 ℃ 20 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s），72 ℃ 10 min。

1.6 靈敏性試驗(yàn)

將檢測為陽性的樣品DNA模板分別進(jìn)行10倍倍比稀釋，從50 μg/mL稀釋到5×10-6μg/mL共8個(gè)稀釋度；以不同稀釋度為模板，進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增；對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，以能檢出清晰特異性的最大稀釋倍數(shù)為本方法的最小檢測極限。

1.7 特異性試驗(yàn)

用已經(jīng)建立好的方法，同時(shí)擴(kuò)增PCV-1、PCV-2、PRV、PPV等DNA模板，觀察巢氏PCR反應(yīng)結(jié)果，確定本方法的特異性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

用所建立的半巢式PCR法，對3份PCV-3陽性樣品分別進(jìn)行5次重復(fù)性試驗(yàn)，檢驗(yàn)該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.9 巢式PCR方法的應(yīng)用

采用建立的半巢式PCR方法檢測臨床采集的豬樣品，評價(jià)本方法的實(shí)際臨床應(yīng)用效果。

2 結(jié)果

2.1 半巢式PCR方法的建立

以PCV-3陽性DNA為模板，進(jìn)行溫度梯度PCR擴(kuò)增。第1次、第2次擴(kuò)增的退火溫度分別為55、54 ℃時(shí)，第2次擴(kuò)增可以擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的249 bp的特異性目的條帶（圖1）。

2.2 半巢式PCR方法的特異性試驗(yàn)

使用半巢式PCR方法，對PCV-1、PCV-2、PPV、PRV進(jìn)行擴(kuò)增，均未擴(kuò)增出特異性條帶，而陽性樣品則可以擴(kuò)增出1條大小為249 bp的特異性條帶，提示該方法有較高的特異性（圖2）。

圖1 PCV-3的半巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 半巢式PCR方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 半巢式PCR方法的敏感性試驗(yàn)

本方法用10倍倍比稀釋遞減的陽性樣品DNA為模板，進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增和電泳，發(fā)現(xiàn)當(dāng)DNA樣品稀釋到5×10-3μg/mL時(shí)，半巢式PCR還能檢測到目的條帶，但當(dāng)DNA樣品繼續(xù)稀釋到5×10-4μg/mL時(shí)，已經(jīng)檢測不到目的條帶，表明本方法的敏感性為5×10-3μg/mL（圖3）。

2.4 半巢式PCR的臨床應(yīng)用檢測

用本文建立的方法，對80份臨床樣品進(jìn)行檢測，從中檢測到22份陽性樣品，PCV-3的感染率為27.5%；從這些特異性條帶中挑取5條比較亮的條帶送去測序和進(jìn)行進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)這些特異性條帶與PCV-3基因組的同源性為95.1%～98.6%。結(jié)果表明，這些條帶均為PCV-3毒株的特異性序列，也表明本方法具有較高的特異性，可用于臨床樣品的檢測（圖4）。

圖3 半巢式PCR方法檢測PCV-3的敏感性

圖4 部分樣品用半巢氏PCR的擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

PCR以及由此衍生的巢式PCR等方法是常用的檢測病原方法。相對于熒光PCR方法，PCR方法操作簡便、容錯(cuò)性高。即使引物上存在少量堿基與靶基因的不同時(shí)問題，PCR方法仍可以擴(kuò)增出靶基因的特異性條帶。因此，這種PCR特性給擴(kuò)增和檢測變異毒株提供了便利。這一特性在新發(fā)病原的檢測中尤其重要。由于新發(fā)病原的背景資料一般較少，其基因組結(jié)構(gòu)往往與已知病原存在一定差異，因此PCR方法在新發(fā)疫病診斷中能夠發(fā)揮其獨(dú)特的作用。本文最初的目的是想建立一種可以在基層推廣使用的PCV-3常規(guī)PCR檢測方法，但用建立的常規(guī)PCR方法進(jìn)行敏感性和臨床檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)其敏感性不高，對臨床樣品的檢出率非常低，如80份臨床樣品，用常規(guī)PCR僅能檢測出5份陽性，陽性率為6.25%（圖5）。

圖5 部分樣品用普通PCR的擴(kuò)增結(jié)果

為了提高靈敏性，在此基礎(chǔ)上又進(jìn)一步研發(fā)了半巢式PCR方法，利用兩次擴(kuò)增檢測病原，大大提供了敏感性。對上述同樣的80份樣品進(jìn)行半巢式PCR檢測，能檢出22份陽性，陽性率提高到27.5%（圖4）。同時(shí)進(jìn)行的敏感性、特異性、重復(fù)性等相關(guān)試驗(yàn)，均取得了滿意效果。隨機(jī)挑選5條比較亮的擴(kuò)增特異性條帶條進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)該序列與已知PCV-3的同源性為95.1%～98.6%，進(jìn)一步表明該方法用于臨床是可行的。

4 結(jié)論

綜上研究表明，本文建立的半巢式PCR檢測方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可以用于豬群PCV-3的流行病學(xué)調(diào)查、檢測和診斷等領(lǐng)域。

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Establishment and Application of Half Nested-PCR for Porcine Circovirus 3

Zhang Zhi1，Hao Zhanwu1，2，Yang Xubing3，Zhang Meijing1，Wu Faxing1，Li Xiaocheng1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032，China；2. Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109，China；3. Qingdao Yebio Biological Engineering Co.，Ltd.，Qingdao，Shandong 266114，China）

In order to establish a method for rapid detection of Porcine circovirus type 3（PCV-3），a new half nested-PCR method was constructed to detect the virus of Porcine circovirus 3（PCV-3）on the base of three primers designed by the conference strain genome from the GenBank. The special band of 249 bp was amplified as the same size as expected. The specific bands were not amplified in the control samples，including PCV-1，PCV-2，PRV and PPV. After series dilution of positive DNA of PCV-3，the available limit of dilution DNA could reach 5×10-3μg/mL to amplify the special band. Meanwhile，application of 80 clinical samples also showed that the positive rate of half nested-PCR could reach 27.5%（22/80），while the detection rate of conventional PCR was only 6.25%（5/80）. The results indicated that the half nested-PCR in this research was accurate，sensitive and special，and was suitable for rapid detection and epidemiology investigation of PCV-3.

Porcine circovirus 3；half nested-PCR；quick detection；epidemiological survey

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2012FY111000）

李曉成

S851.3

B

1005-944X（2018）01-0081-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2018.01.023

朱迪國）