徐志山 王洪一 鐘黎明 回薔 郭冰玉 陶凱

[摘要]目的：研究苦參堿對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡和自噬的影響及其相關(guān)作用機制。方法：通過收集手術(shù)切除的瘢痕疙瘩進行體外培養(yǎng)成纖維細胞，將細胞分為3組，分別加入10μmol/L，20μmol/L的苦參堿以及對照組（0.9% NaCl）進行實驗。MTT實驗檢測細胞增殖情況；流式細胞技術(shù)進行細胞周期分析；Hoechest 33258染色檢測細胞凋亡情況；Western blot實驗檢測苦參堿對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡和自噬相關(guān)調(diào)控蛋白表達的影響。結(jié)果：通過不同濃度的苦參堿處理細胞后，MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)成纖維細胞的增殖受到抑制，抑制作用具有劑量依賴性；細胞周期分析發(fā)現(xiàn)，苦參堿作用后細胞的G1-S期轉(zhuǎn)化受到了不同程度的抑制；Hoechest 33258染色發(fā)現(xiàn)苦參堿可以促進凋亡細胞的增加；Western blot實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦參堿可以抑制CDK4、CDK6、Bcl-2和LC3-I蛋白的表達，促進Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達。結(jié)論：苦參堿對瘢痕疙瘩成纖維細胞具有抑制增殖、促進凋亡的作用，能夠影響細胞增殖、凋亡和自噬相關(guān)調(diào)控蛋白的表達。

[關(guān)鍵詞]苦參堿；成纖維細胞；增殖；凋亡；自噬；細胞周期；瘢痕疙瘩

[中圖分類號]R619+.6 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）10-0137-04

Abstract： Objective To study the effects of Matrine on the proliferation， apoptosis and autophagy of keloid fibroblasts in vitro and its related mechanisms. Methods The fibroblasts were cultured in vitro by collecting surgical excised keloids. The cells were divided into three groups and the 10μmol/L， 20μmol/L matrine and the control group （0.9% NaCl） were added to the experiment. MTT test was used to detect the proliferation of fibroblasts， flow cytometry was used for cell cycle analysis， Hoechest 33258 staining was used to detect cell apoptosis， Western blot was used to detect the effect of Matrine on the proliferation， apoptosis and autophagy related protein expression of keloid fibroblasts. Results After treating cells with different concentrations of matrine， MTT results showed that the proliferation of fibroblasts was inhibited and the inhibitory effect was dose-dependent. The cell cycle analysis showed that the G1-S phase transformation of the cells was inhibited in varying degrees after the action of matrine. Hoechest 33258 staining showed that matrine could lead to a significant increase in apoptosis. The results of Western blot showed that matrine could inhibit the expression of CDK4， CDK6， Bcl-2 and LC3-I protein， and promote the expression of Bax， LC3-Ⅱ and Beclin-1. Conclusion Matrine can inhibit the proliferation and promote apoptosis of keloid fibroblasts， and can affect the cell proliferation， apoptosis and the expression of autophagy related proteins.

Key words：Matrine； fibroblasts； proliferation； apoptosis； autophagy； cell cycle； keloid

瘢痕疙瘩（Keloid）是皮膚創(chuàng)傷后結(jié)締組織過度增殖形成的良性腫塊。其病理組織學特點是成纖維細胞過度增殖以及細胞外基質(zhì)過量的沉積。對于瘢痕疙瘩的治療方法有很多，藥物是瘢痕疙瘩預防和治療的一大類別，包括抗代謝藥、類固醇激素、免疫抑制劑和抗腫瘤藥等[1-2]。而尋找療效確切、副作用小的藥物，對于瘢痕疙瘩的預防和治療具有重要臨床意義。

苦參堿（Matrine，Mat）是從豆科植物苦參的干燥根、植株中提取得到的一種生物堿，歸屬于四環(huán)喹嗪啶類化合物[3]。目前已有報道[4]，苦參類生物堿具有多方面的藥理活性及生物學功能。而我們常用的瘢痕軟化膏的主要活性成分就是苦參類生物堿，其能夠顯著抑制瘢痕的增生，使增生性瘢痕軟化縮小，臨床效果顯著?？鄥A在增生性瘢痕中的作用研究報道較多，但在瘢痕疙瘩中的作用卻尚不十分清楚，而且對于苦參堿在瘢痕疙瘩中的作用機制，需要進一步研究。本次研究通過體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞，利用不同濃度的苦參堿對細胞進行處理，研究苦參堿對細胞增殖、凋亡、自噬等生物功能的影響。希望通過本次實驗能夠為臨床應用苦參堿預防和治療瘢痕疙瘩提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標本和材料：收集了8例沈陽軍區(qū)總醫(yī)院整形外科手術(shù)切除的瘢痕疙瘩。其中男性3例，女性5例；年齡10～42歲；耳廓部位4例，下頜部2例，前胸部2例；瘢痕疙瘩取材標準：凸出于皮膚表面、無破潰和感染、且既往未經(jīng)手術(shù)和激光等治療。標本選取均獲得患者的知情同意，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審批。苦參堿（中國藥品生物制品檢定所提供標準品，使用NaCl配制），四甲基偶氮唑藍[MTT，3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide， Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide]（Sigma，美國）、PI（Propidium Iodide）染料、Hoechest 33258染料（江蘇碧云天生物技術(shù)公司，中國）；DMEM培養(yǎng)基（invitrogen，美國）；胎牛血清（天津灝洋生物制品有限公司，中國）；相關(guān)抗體：CDK4、CDK6、LC3、Beclin-1、Bcl-2、Bax和GAPDH（Santa，美國）。

1.2 方法

1.2.1 瘢痕疙瘩成纖維細胞培養(yǎng)：采用組織貼壁細胞培養(yǎng)法進行成纖維細胞培養(yǎng)。將瘢痕疙瘩標本剪碎成0.5～1mm3的微粒，加入DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、50IU/ml青霉素和50IU/ml鏈霉素），置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當原代細胞成片生長后，加入0.25%的胰蛋白酶進行消化，然后進行傳代培養(yǎng)。每3d更換新鮮培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT實驗檢測成纖維細胞增殖情況：將對數(shù)生長的成纖維細胞接種于96孔板內(nèi)（濃度1×105/ml），終體積200μl進行培養(yǎng)。12h后更換培養(yǎng)基，分別加入10μmol/L，20μmol/L的苦參堿及0.9% NaCl作為對照，每組設3個復孔。于0、12、24、36和48h分別加入10μl的5mg/ml MTT溶液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4h后棄去培養(yǎng)基，各孔中加入200μl DMSO。繼續(xù)培養(yǎng)15min后，在490nm處記錄OD值。

1.2.3 細胞周期分析：將對數(shù)生長期的細胞制成1×106/L濃度的細胞懸液接種于6孔板中，貼壁培養(yǎng)至密度達70%時，繼續(xù)培養(yǎng)24h后PBS洗滌，胰酶進行消化成單細胞懸液。在4℃下用70%的冰乙醇固定1h，PI染液避光染色30min。流式細胞儀測定細胞周期所占百分比。

1.2.4 Hoechest 33258染色檢測細胞凋亡情況：將成纖維細胞懸液（濃度1×106/L）接種于6孔板中，貼壁培養(yǎng)24h后，分別加入10μmol/L，20μmol/L的苦參堿及對照組0.9% NaCl。24h后每孔加入100μl Hoechest 33258孵育染色15min。用熒光顯微鏡10×20倍下觀察細胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot實驗檢測苦參堿對瘢痕疙瘩成纖維細胞CDK4、CDK6、LC3、Beclin-1、Bcl-2、Bax的蛋白表達的影響：將成纖維細胞懸液（濃度1×106/L）接種于6孔板中，貼壁培養(yǎng)24h后，分別加入10μmol/L，20μmol/L的苦參堿及對照組0.9% NaCl。24h后收集細胞，提取蛋白后每個加樣孔上樣40μg蛋白。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2h。TBST洗膜3次后孵育一抗4℃過夜。TBST再次洗膜3次，室溫孵育二抗1h。漂洗后ECL發(fā)光儀發(fā)光。

1.2.6 統(tǒng)計學分析：重復實驗3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x?±s）表示。采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，使用非配對t檢驗比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度苦參堿對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響：采用10μmol/L，20μmol/L的苦參堿分別對瘢痕疙瘩成纖維細胞作用0h，12h，24h，36h和48h后，結(jié)果如圖1所示：苦參堿可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖，各組結(jié)果與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），苦參堿對細胞的增殖抑制作用與劑量和作用時間呈正相關(guān)。

2.2 不同處理組對瘢痕疙瘩成纖維細胞周期的影響：如圖2所示，不同處理因素作用下，瘢痕疙瘩成纖維細胞的G1-S期轉(zhuǎn)化受到了不同程度的抑制。濃度為10μmol/L的苦參堿處理細胞后，G1期和S期的細胞分別比例占59.32%和20.34%，而20μmol/L組的G1期和S期分別占66.15%和14.93%。相比于0.9% NaCl處理細胞后的S期25.93%明顯減低。說明了當苦參堿的濃度越高時細胞周期G1-S期被阻滯的程度越明顯。

2.3 不同濃度苦參堿對瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的影響：如圖3所示，Hoechest 33258染色觀察發(fā)現(xiàn)苦參堿能一定程度上誘導成纖維細胞的凋亡。相比對照組，當苦參堿濃度為10μmol/L時，細胞凋亡的數(shù)量增加；而濃度為20μmol/L時，細胞凋亡的數(shù)量增加更為明顯?？鄥A濃度越高，誘導細胞凋亡的作用越明顯。

2.4 不同處理組對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡、自噬相關(guān)蛋白的影響：在不同濃度的苦參堿作用下，調(diào)控增殖相關(guān)的蛋白CDK4和CDK6表達受到了影響，且苦參堿濃度增高，蛋白表達受到抑制更明顯，表明苦參堿能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖。見圖4。

調(diào)控凋亡相關(guān)的蛋白Bcl-2和Bax表達也受到了影響。當苦參堿濃度增加時，抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達減少，而促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達明顯增加?？鄥A能夠影響凋亡相關(guān)蛋白表達，進而促進瘢痕疙瘩成纖維細胞的凋亡。見圖5。

在不同濃度的苦參堿作用下，調(diào)控自噬相關(guān)的蛋白LC3和Beclin-1表達受到了影響。當苦參堿濃度增加時，抗自噬相關(guān)蛋白LC3-I的表達減少，而促自噬相關(guān)蛋白LC3-II和Beclin-1的表達明顯增加。苦參堿能夠影響自噬相關(guān)蛋白表達，進而促進瘢痕疙瘩成纖維細胞的自噬。見圖6。

3 討論

瘢痕疙瘩是一種能夠向周圍正常組織呈蟹足樣或啞鈴狀生長的腫塊，無自愈傾向，也被認為是一種皮膚的“良性腫瘤”。瘢痕疙瘩中的成纖維細胞表達許多腫瘤有關(guān)的因子，有人提出瘢痕疙瘩的腫瘤源性學說[5-6]。苦參堿在腫瘤中的作用研究較多，其具有抑制細胞增殖、誘導分化的作用。而在瘢痕疙瘩中卻較少研究，因此，本實驗選取苦參堿為實驗對象，研究其對瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖、凋亡和自噬的生物功能的影響。

早有研究報道了苦參堿在體外能明顯抑制增生性瘢痕成纖維細胞的增殖而不引起細胞壞死性改變，對DNA含量無明顯影響。成纖維細胞的過度增殖是瘢痕疙瘩形成和發(fā)展的重要原因，因此應用MTT實驗檢測了苦參堿對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的調(diào)節(jié)作用。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦參堿能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，苦參堿能夠誘導前列腺癌、甲狀腺癌、肝癌和乳腺癌等多種腫瘤細胞細胞周期的進程。在抗纖維化研究中發(fā)現(xiàn)[9-10]，苦參堿能夠作用于腎纖維化、心肌纖維化，也能夠?qū)蛊つw纖維化，抑制肝星狀細胞的增殖，增加細胞的凋亡率。通過流式細胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，苦參堿能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞G1期向S期轉(zhuǎn)化。成纖維細胞的凋亡在創(chuàng)傷后組織修復過程中也發(fā)揮重要作用，研究證明苦參堿處理可以促進成纖維細胞的凋亡數(shù)量的增加。

為了探索苦參堿抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞生長的機制，本實驗又通過Western blot實驗檢測苦參堿對細胞的增殖、凋亡和自噬相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用。實驗檢測發(fā)現(xiàn)了苦參堿能夠抑制增殖相關(guān)蛋白CDK4和CDK6的蛋白表達。已有研究發(fā)現(xiàn)[11-12]苦參堿能夠通過使凋亡相關(guān)調(diào)控蛋白Bax表達上調(diào)，p53、Bcl-2表達下調(diào)，促進兔耳增生性瘢痕成纖維細胞的凋亡。實驗發(fā)現(xiàn)，苦參堿對瘢痕疙瘩成纖維細胞的凋亡作用具有劑量依賴性。當苦參堿濃度增加，抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達減少，而促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達明顯增加。因此，苦參堿能夠通過影響凋亡相關(guān)蛋白表達，進而促進瘢痕疙瘩成纖維細胞的凋亡。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當細胞受到應激源刺激后，自噬相關(guān)蛋白LC3-I能夠轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ。LC3-Ⅱ定位于前自噬體和自噬體膜表面，是自噬體膜的特異性標志物，能夠反映細胞自噬活動的強弱[13-14]。本次研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)苦參堿處理后，成纖維細胞的Beclin-1和LC3-Ⅱ表達增加，說明苦參堿能夠促進瘢痕疙瘩成纖維細胞的自噬功能。

綜上所述，苦參堿對瘢痕疙瘩成纖維細胞具有抑制增殖、促進凋亡的作用，能夠影響細胞增殖、凋亡和自噬相關(guān)調(diào)控蛋白的表達，對瘢痕疙瘩的預防和治療具有一定的生物學作用。

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[收稿日期]2018-07-09 [修回日期]2018-08-10

編輯/朱婉蓉