孫雁霞，羅 倩，時羽杰，李 杰，田計均，唐 媛，鄔曉勇

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106)

PEG 4000/(NH4)2SO4雙水相體系萃取歐李種仁蛋白研究

孫雁霞，羅 倩，時羽杰，李 杰，田計均，唐 媛，鄔曉勇

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106)

利用聚乙二醇(PEG)4000/(NH4)2SO4雙水相體系萃取歐李種仁蛋白.研究了PEG 4000/(NH4)2SO4雙水相體系的體系組成對蛋白分配系數(shù)及回收率的影響，最后確定了最佳的雙水相萃取體系.在18%的(NH4)2SO4與10%的聚乙二醇構(gòu)成的雙水相體系中，蛋白的分配系數(shù)最小為0.495，回收率為92.0%.對體系的最大萃取容量測定結(jié)果表明，雙水相體系易于放大和進行連續(xù)性操作，適用于大規(guī)模生產(chǎn)活性蛋白.

雙水相萃??；PEG 4000/(NH4)2SO4體系；歐李；種仁蛋白

0 引 言

歐李為薔薇科櫻桃屬落葉小灌木，為我國特有的果實和藥食兼用樹種[1].歐李種仁也稱郁李仁，其主要成分包括苦杏仁苷、歐李種仁油與歐李種仁蛋白，歐李種仁蛋白組成中谷氨酸含量很高，有改善神經(jīng)系統(tǒng)的功效[2-3].一般蛋白的提取與分離通常采用硫酸銨鹽析法，但蛋白的活性和構(gòu)象在過高濃度的鹽離子中容易遭到破壞.而雙水相方法則是利用高聚物與無機鹽體系的水溶液所形成的互不相容的兩相，通過構(gòu)建適宜的成相條件，使蛋白質(zhì)等活性生物大分子在兩互不相容的水相中具有不同的分配系數(shù)，從而使蛋白得到分離與純化[4-7].該方法不僅避免了傳統(tǒng)的有機溶劑萃取對蛋白造成的破壞，同時也為生物活性物質(zhì)的純化提供了溫和的水相環(huán)境，而且具有分離高效、成本低廉、高回收率和工業(yè)上易于放大的特點.

目前，在蛋白質(zhì)的分離與分析等方面，科研人員已做了大量的工作，蛋白質(zhì)的分離純化方法相對比較完善[4-6]，但針對歐李種仁蛋白質(zhì)的提取工藝研究相對較少.對此，本研究采用雙水相萃取技術(shù)[7]，通過篩選優(yōu)化提取條件，建立了適宜歐李種仁蛋白的雙水相萃取體系.

1 材料、儀器與方法

1.1 材 料

實驗所用的歐李來自于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院.

實驗所用試劑包括：考馬斯亮藍G-250、標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白、PEG 4000、(NH4)2SO4、石油醚、乙醇、NaCl、95%乙醇等，購于成都科龍化工有限公司，均為分析純.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：精密電子天平(上海速展機電公司)，旋渦混合器(沃信儀器制造有限公司)，Unico紫外可見分光光度計(上海光學(xué)儀器公司).

1.3 方 法

1.3.1 歐李種仁蛋白制備.

成熟的歐李種子，手工去殼后置干燥箱干燥備用.將干燥歐李種仁研磨成粉末，用2倍體積的石油醚脫脂，于通風(fēng)處風(fēng)干后用文獻[4]中的堿提酸沉的方法獲得種仁蛋白，經(jīng)冷凍干燥后備用.

1.3.2 試劑配制.

1)考馬斯亮藍G-250溶液的配制.精確稱取0.1 g考馬斯亮藍G-250，用50 mL 95%的乙醇溶解，之后加入100 mL 85%濃磷酸，然后轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶并用水定容至刻度線，反復(fù)搖勻后靜置24 h，之后過濾置棕色瓶中避光備用.

2)牛血清蛋白原液的配制.精確稱取0.10g牛血清白蛋白，用生理鹽水稀釋并定容至100 mL容量瓶中，混勻，制得濃度為1 mg/mL的牛血清蛋白原液.

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白制定標(biāo)準(zhǔn)曲線.

將牛血清蛋白原液稀釋10倍以后，在7支試管中(一支為空白對照)，分別精確吸取稀釋后的牛血清白蛋白原液0.00 mL(空白調(diào)零)，0.10 mL、0.30 mL、0.50 mL、0.70 mL、0.90 mL、1.00 mL，用生理鹽水全部稀釋至1.0 mL，然后分別加入5.00 mL考馬斯亮藍G-250溶液，混合均勻，立即于波長595 nm條件下比色測定.以試管中標(biāo)準(zhǔn)蛋白的總含量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度值(A)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并作線性回歸，求線性方程.

1.3.4 雙水相體系相圖制備.

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的(NH4)2SO4溶液并測定其密度，將此溶液裝入滴定管備用.

精確稱取0.2 g PEG 4000溶解于0.8 g蒸餾水中，用滴定管緩慢滴加(NH4)2SO4溶液并不斷振蕩使其混合均勻，觀察溶液的澄清程度，直至溶液開始出現(xiàn)渾濁為止.記錄(NH4)2SO4溶液的加量(mL)，并根據(jù)密度值求出質(zhì)量(g).然后再加入固定體積(0.5 mL)的蒸餾水，溶液澄清，繼續(xù)重復(fù)上述操作，直至再次達到渾濁.如此反復(fù)操作10次并計算每次達到渾濁時PEG 4000和(NH4)2SO4在系統(tǒng)中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/g).以PEG 4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，即可得到一條PEG4000和(NH4)2SO4的雙水相相圖.

1.3.5 雙水相體系制備.

1)(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為18%，以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG 4000組成雙水相體系，加入1 mL牛血清白蛋白原液，pH調(diào)至中性，置于4 ℃萃取，待完全分層后，測定各雙水相體系蛋白質(zhì)的上下相的分配系數(shù)、相比以及下相萃取率.加樣情況見表1，選擇分配系數(shù)最小的作為最適PEG 4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

表1 PEG 4000/(NH4)2SO4雙水相體系A(chǔ)組成

2)PEG4 000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為10%，以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的(NH4)2SO4組成雙水相體系，加入牛血清白蛋白原液，pH調(diào)至中性，置于4 ℃萃取，待完全分層后，測定各雙水相體系蛋白質(zhì)的上、下相的分配系數(shù)、相比以及下相萃取率.加樣情況見表2，選擇分配系數(shù)最小的組作為最適的(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù).

表2 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系B組成

3)雙水相體系蛋白質(zhì)的分配系數(shù)、回收率及相比計算公式為，

分配系數(shù)，K=C上/C下

相比，R=V上/V下

回收率(%)，Y上=C上V上/(C上V上+C下V下)

Y下=C下V下/(C上V上+C下V下)

式中，C上、C下分別代表上、下相蛋白質(zhì)濃度；V上、V下分別代表上、下相的體積.

1.3.6 雙水相體系中蛋白質(zhì)最大萃取容量測定.

分別以“1.3.5”項下確定的最佳的PEG 4000和(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)組成雙水相體系，加入稀釋后的歐李種仁蛋白溶液，不斷反復(fù)操作，直至溶液由渾濁變澄清記錄滴加蛋白溶液的量，并計算出下相中蛋白的含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照“1.3.3”項下的方法，在波長595 nm條件下測得各梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的吸光度值.據(jù)吸光度值制作出牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示.回歸方程為，y=5.8767x+0.0992，R2=0.9991，表明蛋白濃度在0.01～0.12 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，可用于后續(xù)蛋白質(zhì)的測定.

圖1牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 PEG/(NH4)2SO4雙水相相圖

精確稱取(NH4)2SO4固體30 g加入70 g蒸餾水溶解，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的(NH4)2SO4溶液.測定其密度為1.1266 g/mL.通過反復(fù)操作，記錄加入(NH4)2SO4溶液的體積(mL)，計算出純(NH4)2SO4的累計量(g)，PEG和(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)，結(jié)果如表3所示.

表3 雙水相相圖制作數(shù)據(jù)記錄表

通過表3中PEG 4000和(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)制作出雙水相相圖如圖2所示.

圖2 PEG 4000/(NH4)2SO4雙水相相圖

2.3 水相中分配系數(shù)、相比計算及最佳條件確定

(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為18%，以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG 4000組成雙水相體系，在595 nm處測得溶液的吸光度，結(jié)果如表4所示.

表4 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系A(chǔ)數(shù)據(jù)

PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為10%，以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的(NH4)2SO4組成雙水相體系，通過分光光度計在595 nm處測得溶液的吸光度值，結(jié)果如表5所示.

表5 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系B數(shù)據(jù)

注：項目1的“/"表示加入蛋白后破壞了雙水相體系兩相的組成使其無法分層，故未統(tǒng)計數(shù)據(jù).

通過表4中溶液上、下相的體積(mL)和溶液的吸光度(A)計算出雙水相體系A(chǔ)中蛋白在兩相中的分配系數(shù)、相比、回收率的數(shù)據(jù)，結(jié)果如表6所示.

表6 雙水相體系A(chǔ)中蛋白質(zhì)K、R、Y的數(shù)據(jù)

通過表5中溶液上、下相的體積(mL)和吸光度(A)計算出雙水相體系B中蛋白在兩相中的的分配系數(shù)、相比、回收率的數(shù)據(jù)，結(jié)果如表7所示.

表7 雙水相體系B蛋白質(zhì)K、R、Y的數(shù)據(jù)

2.3.1 PEG 4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對蛋白萃取的影響.

隨著PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加(見表6)，分配系數(shù)K先下降后上升且變化較大，Y下先增大后減小，并在PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時，K和Y下均達到最佳值.在總體趨勢中，相比R先下降后上升.由于在PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10%時，K最小，為0.496，Y下為91.0%，因此，最佳提取條件的PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%.

2.3.2 (NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對萃取的影響.

當(dāng)固定PEG 4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)量時(見表7)，分配系數(shù)K隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而下降，當(dāng)(NH4)2SO4濃度超過18%時，分配系數(shù)K又逐漸上升.總趨勢相比R先下降后上升，Y下先升高后降低.(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時，分配系數(shù)K最小，為0.495，而Y下最大達92.0%，由此可知，最適萃取條件的(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%.

2.3.3 雙相體系最佳條件確定.

通過上述數(shù)據(jù)的分析，確定該雙相體系下最佳條件為：(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，PEG 4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%.

2.4 雙水相體系最大萃取容量確定

在確定了最佳雙水相體系的組成后，利用(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，PEG 4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%組成雙水相體系.測定體系的總體積為50 mL，通過滴加稀釋的歐李蛋白溶液，記錄滴加蛋白溶液的最大量為18.9 mL.通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求得在本雙水相體系下蛋白質(zhì)的最大容量為1.739 mg.根據(jù)表6和表7中Y下的值估算出下相中蛋白的量為1.600 mg.因此，通過實驗確定的最佳雙水相萃取體系的蛋白萃取率為92.0%.

3 結(jié) 論

據(jù)雙水相分配理論，(NH4)2SO4可影響體系上、下相的電位差，進而影響蛋白的分配系數(shù)和萃取率.而高濃度的(NH4)2SO4導(dǎo)致蛋白發(fā)生鹽析，進而使蛋白萃取率下降，同時還會擾亂雙水相系統(tǒng)，改變體系中成相物質(zhì)的組成和相比[6-7].本實驗利用聚乙二醇(PEG)4000/(NH4)2SO4雙水相體系萃取歐李種仁蛋白,在18%的(NH4)2SO4與10%的聚乙二醇構(gòu)成的雙水相體系中，蛋白的分配系數(shù)最小為0.495，回收率為92.0%.對體系的最大萃取容量測定結(jié)果表明，雙水相體系易于放大和進行連續(xù)性操作，適用于大規(guī)模生產(chǎn)活性蛋白.

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StudyonExtractionofSeedKernelProteinfromPrunusHumilisbyPEG4000/(NH4)2SO4AqueousTwo-phaseSystem

SUNYanxia,LUOQian,SHIYujie,LIJie,TIANJijun,TANGYuan，WUXiaoyong

(School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

The seed kernel protein was extracted from Prunus humilis PEG4000/(NH4)2SO4aqueous two-phase system.The paper studied the effects of composing mechanism the PEG4000/(NH4)2SO4aqueous two-phase system on the recovery rate and the protein distribution coefficients,and then the best aqueous two-phase extraction system was determined.The minimum protein distribution coefficient was 0.495 and the maximum protein recovery rate was 92.0% in the aqueous two-phase system which was constituted by 18%(NH4)2SO4and 10% PEG4000 constituted by polyethylene glycol.The results obtained from the test of the maximum extraction capacity of the system showed that the aqueous two-phase system was suitable for large-scale active protein extraction and easy to be zoomed and continuously operated.

aqueous two-phase extraction;PEG4000/(NH4)2SO4system;Cerasus humilis;seed kernel protein

TQ464.7

A

1004-5422(2017)04-0338-04

2017-09-26.

食品加工與應(yīng)用四川省高校重點實驗室科研基金(14-S03)、 成都大學(xué)藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點實驗室開放基金(10Y201409)資助項目.

孫雁霞(1976 — )，女，博士，副教授，從事植物生物技術(shù)研究.