林英立，李艷麗，戚景光，梁 杰，趙 炎

(徐州市腫瘤醫(yī)院：1.泌尿外科；2.科教科，江蘇徐州 221005)

論著·臨床研究

血清CDH13甲基化對非肌層浸潤性膀胱癌行TURBT治療后進(jìn)展的預(yù)測作用*

林英立1，李艷麗2，戚景光1，梁 杰1，趙 炎1

(徐州市腫瘤醫(yī)院：1.泌尿外科；2.科教科，江蘇徐州 221005)

目的探索血清鈣黏蛋白13(CDH13)甲基化對非肌層浸潤性膀胱癌行經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(TURBT)治療后進(jìn)展的預(yù)測作用。方法選取2010年1月至2012年1月在該院行TURBT治療的非肌層浸潤性膀胱癌患者98例，應(yīng)用甲基化特異性PCR檢測患者血清CDH13甲基化狀態(tài)，并分析其與患者臨床病理資料及術(shù)后進(jìn)展情況的相關(guān)性。結(jié)果52例(53.1%)患者血清中檢測到CDH13甲基化，并且血清CDH13甲基化與腫瘤大小、分級及數(shù)目密切相關(guān)(P<0.05)。在隨訪過程中有20例(20.4%)患者出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展，Kaplan-Meier分析和log-rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)存在血清CDH13甲基化的患者無進(jìn)展生存率低于血清CDH13未甲基化的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)。Cox回歸分析顯示，血清CDH13甲基化是非肌層浸潤性膀胱癌行TURBT治療后進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論血清CDH13甲基化可作為非肌層浸潤性膀胱癌行TURBT治療后進(jìn)展的預(yù)測指標(biāo)。

膀胱腫瘤；進(jìn)展；CDH13；甲基化

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率[1]。在新發(fā)病例中70%以上為非肌層浸潤性膀胱癌。目前經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(TURBT)及術(shù)后的膀胱腫瘤灌注化療是其主要治療方法[2-3]。近年來，盡管手術(shù)技巧、灌注藥物及灌注方案有了很大的提高，但仍有相當(dāng)一部分腫瘤進(jìn)展為肌層浸潤性膀胱癌[4]。如何有效地預(yù)測非肌層浸潤性膀胱癌行TURBT治療后是否會進(jìn)展，并給予個體化治療以取得較好的預(yù)后，是目前亟須解決的問題[3，5-7]。鈣黏蛋白13(CDH13)基因?yàn)橐职┗?，研究發(fā)現(xiàn)其在膀胱癌中因啟動子甲基化而表達(dá)減少或缺失，并與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，有望成為膀胱癌預(yù)后的分子標(biāo)志物[8-9]。本研究將進(jìn)一步探索血清CDH13甲基化對非肌層浸潤性膀胱癌行TURBT治療后進(jìn)展的預(yù)測作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010年1月至2012年1月在本院行TURBT治療的膀胱癌患者98例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次發(fā)現(xiàn)膀胱癌，術(shù)后組織病理學(xué)確診為非肌層浸潤性尿路上皮癌；(2)無其他合并腫瘤；(3)術(shù)前未接受抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：未按照要求予術(shù)后膀胱灌注治療及未完成隨訪者?；颊叩呐R床病理資料見表1。本研究符合赫爾辛基宣言的原則。

1.2方法

1.2.1臨床治療方案 98例患者均行TURBT治療，術(shù)后給予表柔比星50 mg即刻膀胱灌注化療。對于中高危患者，術(shù)后8周每周1次膀胱灌注，之后每月1次，維持12個月。術(shù)后2年每3個月進(jìn)行1次膀胱鏡檢查，第3年開始每6個月1次。

1.2.2血清標(biāo)本的采集及甲基化檢測 所有患者在術(shù)前經(jīng)肘靜脈抽取靜脈血10 mL，分離血清后保存于液氮中待測。采用DNeasy Mini Kit(Qiagen，Valencia，CA)提取血清DNA，應(yīng)用EZ DNA Methylation-Gold Kit(美國Zymo Research公司)對DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾并純化。以甲基化修飾后的DNA為模板，分別用甲基化和非甲基化兩對引物進(jìn)行甲基化特異性PCR檢測。CDH13基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化引物，CDH13正義鏈：5′-TCG CGG GGT TCG TTT TTC GC-3′，CDH13反義鏈：5′-GAC GTT TTC ATT CAT ACA CGC G-3′，產(chǎn)物長度為243 bp(退火溫度為57 ℃)。非甲基化引物，CDH13正義鏈： 5′-TTG TGG GGT TGT TTT TTG T-3′，CDH13反義鏈：5′-AAC TTT TCA TTC ATA CAC ACA-3′，產(chǎn)物長度為242 bp (退火溫度為53 ℃)。取PCR產(chǎn)物10 μL行2.5%瓊脂糖凝膠電泳，以雙蒸水作為陰性對照，110 V電泳40 min，凝膠成像系統(tǒng)下照相。僅應(yīng)用甲基化引物擴(kuò)增出產(chǎn)物條帶判斷為存在完全DNA甲基化，僅應(yīng)用非甲基化引物擴(kuò)增出產(chǎn)物條帶判斷為不存在DNA甲基化(U)，若同時出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶則表明存在部分DNA甲基化，完全DNA甲基化和部分DNA甲基化均判為DNA甲基化陽性(M)[10-11]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)分析血清CDH13甲基化與臨床病理特征之間的關(guān)系；Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗(yàn)用來評價血清CDH13甲基化對腫瘤進(jìn)展的影響；Cox回歸分析檢測血清CDH13甲基化對膀胱癌進(jìn)展的預(yù)測作用；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1血清CDH13甲基化與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系 52例(53.1%)患者血清中檢測到CDH13甲基化，見圖1；并且血清CDH13甲基化與腫瘤的大小、分級及數(shù)目密切相關(guān)(P<0.05)，但與患者的年齡、性別和分期無關(guān)(P>0.05)，見表1。

U：未甲基化；M：甲基化；Case31、32、34：CDH13甲基化；Case33：CDH13未甲基化

圖1 膀胱癌CDH13甲基化檢測結(jié)果表1 膀胱癌患者的臨床病理特征及其與血清CDH13 甲基化的關(guān)系

續(xù)表1 膀胱癌患者的臨床病理特征及其與血清CDH13 甲基化的關(guān)系

M：甲基化；U：未甲基化

2.2血清CDH13甲基化與膀胱癌進(jìn)展的關(guān)系 所有患者術(shù)后均隨訪至術(shù)后3年。研究發(fā)現(xiàn)有20例(20.4%)患者出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展，其中16例為CDH13甲基化組患者，4例為CDH13未甲基化患者。Kaplan-Meier分析和log-rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)存在血清CDH13甲基化的患者其無進(jìn)展生存率比血清CDH13未甲基化的患者低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)，見圖2。進(jìn)一步Cox回歸分析表明血清CDH13甲基化是非肌層浸潤性膀胱癌行TURBT治療后進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表2。

圖2 血清CDH13甲基化與未甲基化患者生存曲線表2 血清CDH13甲基化對膀胱癌進(jìn)展的預(yù)測作用

項(xiàng)目多因素Cox回歸分析Exp(B)95%CIP年齡0.9730.694～4.6210.736性別0.8520.764～5.0310.817腫瘤大小1.6280.885～6.5710.117腫瘤數(shù)目1.1940.946～9.3170.217分級2.5141.134～7.2640.033分期2.1821.035～9.3720.047CDH13甲基化3.2561.485～10.3610.013

3 討 論

膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)常見腫瘤，近年來隨著暴露危險(xiǎn)因素的增加，其發(fā)病率有逐年增加的趨勢[12]。同時，膀胱癌是一種異質(zhì)性疾病，組織病理學(xué)相同的腫瘤其臨床表現(xiàn)和預(yù)后并不完全一致[3-4，6]。復(fù)發(fā)和進(jìn)展是膀胱癌的重要特性，尤其是非肌層浸潤性腫瘤；如何鑒別非肌層浸潤性膀胱癌行TURBT治療后是否會進(jìn)展為肌層浸潤性病變是臨床工作中面臨的一大難題[3-4，6]。目前，主要應(yīng)用臨床病理特征如腫瘤的分期、分級、數(shù)目、大小、形態(tài)等進(jìn)行預(yù)后的預(yù)測，但這些指標(biāo)并不能準(zhǔn)確地預(yù)測腫瘤的進(jìn)展[13-14]。因此，需要新的、準(zhǔn)確的指標(biāo)來預(yù)測腫瘤的進(jìn)展，并指導(dǎo)臨床治療。

CDH13是鈣黏蛋白家族的一員，在細(xì)胞黏附、運(yùn)動、增殖及細(xì)胞表型等方面起著重要的調(diào)節(jié)作用[8]。其基因定位于人類染色體16q24，在腫瘤中常因啟動子甲基化而表達(dá)減少或缺失，是一種抑癌基因。筆者在基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制CDH13在膀胱癌5637細(xì)胞中的表達(dá)后細(xì)胞增殖加快，遷移和侵襲能力增強(qiáng)；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌ScaBer細(xì)胞中因CDH13基因啟動子甲基化、CDH13呈低表達(dá)狀態(tài)，5-Aza-dc與ScaBer細(xì)胞共同孵育后CDH13基因甲基化狀態(tài)得到逆轉(zhuǎn)，并且CDH13蛋白表達(dá)明顯增加同時對細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲產(chǎn)生抑制作用；這些研究結(jié)果表明CDH13基因啟動子甲基化在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[15-16]。臨床研究中發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中CDH13甲基化與腫瘤生長、分化不良及浸潤等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者血清中也存在CDH13甲基化，并與腫瘤的惡性生物學(xué)行為及患者不良預(yù)后有關(guān)[10-11，17]。這些研究結(jié)果表明，血清CDH13甲基化有可能成為預(yù)測非肌層浸潤性膀胱癌行TURBT治療后進(jìn)展的分子標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，在98例非肌層浸潤性膀胱癌患者中，有52例存在血清CDH13甲基化，并且與腫瘤的大小、分級及數(shù)目密切相關(guān)。所有患者在行TURBT治療后均進(jìn)行了隨訪，發(fā)現(xiàn)存在血清CDH13甲基化的患者其無進(jìn)展生存率明顯低于血清CDH13未甲基化的患者，結(jié)果表明血清CDH13甲基化與膀胱癌的進(jìn)展密切相關(guān)，并有可能成為預(yù)測膀胱癌進(jìn)展的分子標(biāo)志物。為進(jìn)一步探索血清CDH13甲基化對非肌層浸潤性膀胱癌行TURBT治療后進(jìn)展的預(yù)測作用，筆者進(jìn)行了單因素和多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)血清CDH13甲基化是非肌層浸潤性膀胱癌行TURBT治療后進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，血清CDH13甲基化與非肌層浸潤性膀胱癌大小、分級、數(shù)目及腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，血清CDH13甲基化是非肌層浸潤性膀胱癌行TURBT治療后進(jìn)展的預(yù)測指標(biāo)。本研究將為建立膀胱癌的預(yù)后預(yù)測體系和探索個體化治療方案提供科學(xué)依據(jù)。

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PredictiveeffectofserumCDH13methylationforprogressionafterTURBTinpatientswithnon-muscleinvasivebladdercancer*

LingYingli1，LiYanli2，QiJingguang1，LiangJie1，ZhaoYan1

(1.DepartmentofUrologicSurgery;2.DepartmentofScienceandEducation,XuzhouMunicipalTumorHospital,Xuzhou,Jiangsu221005,China)

ObjectiveTo investigate the predictive effect of serum CDH13 methylation for the progression after TURBT in the patients with non-muscle invasive bladder cancer.MethodsNinety-eight patients with non-muscle invasive bladder cancer treated by TURBT in this hospital from January 2010 to January 2012 were selected.The methylation specific PCR was used to detect the methylation status of serum CDH13.Then its correlation with the clinicopathological data as well as postoperative progression situation was analyzed.ResultsSerum CDH13 methylation was detected in 52 cases (53.1%),moreover serum CDH13 methylation was closely correlated with tumor size,grade and number (P<0.05).During follow-up,20 cases (20.4%) appeared the tumor progression.The Kaplan-Meier analysis and log-rank test found that the patients with serum CDH13 methylation had shorter progression-free survival rate than the patients without serum CDH13 methylation,and the difference was statistically significant (P=0.007).The Cox regression analysis showed that serum CDH13 methylation was an independent risk factor for the progression after TURBT in non-muscle invasive bladder cancer.ConclusionSerum CDH13 methylation can serve as a predictive indicator of the progression after TURBT in non-muscle invasive bladder cancer.

urinary bladder neoplasms；progression；CDH13；methylation

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.35.016

江蘇省徐州市醫(yī)學(xué)青年后備人才項(xiàng)目(2014007)；江蘇大學(xué)臨床科技發(fā)展基金項(xiàng)目(JLY20160064)；江蘇省“六大人才高峰”資助項(xiàng)目(2014-WSW-066);江蘇省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會青年科研課題項(xiàng)目(Q201514)；江蘇省青年醫(yī)學(xué)人才項(xiàng)目(QNRC2016395)。

林英立(1980-)，副主任醫(yī)師，博士/博士后，主要從事泌尿系腫瘤的臨床、基礎(chǔ)研究。

R737.14

A

1671-8348(2017)35-4949-03

2017-06-15

2017-09-19)