陳文超，蘇琬涵，劉志高，季夢(mèng)成

(浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 臨安 311300)

鐵線蓮屬植物葉綠體微衛(wèi)星引物開(kāi)發(fā)及其遺傳分析

陳文超，蘇琬涵，劉志高*，季夢(mèng)成

(浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 臨安 311300)

對(duì)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中Clematisfuscavar.coreana葉綠體全基因組進(jìn)行了分析，以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)出11對(duì)葉綠體SSR引物，并進(jìn)一步研究了11對(duì)葉綠體SSR引物在鐵線蓮屬其他野生種類(lèi)和栽培品種中的通用性。結(jié)果表明，C.fuscavar.coreana葉綠體基因組內(nèi)共有67個(gè)SSR位點(diǎn)，主要分布于1 088～41 445 bp和50 135～127 217 bp，以A/T單堿基重復(fù)為主；設(shè)計(jì)所得11對(duì)cpSSR引物在鐵線蓮野生種類(lèi)和栽培品種中均表現(xiàn)出良好的通用性，在55個(gè)鐵線蓮樣本中擴(kuò)增等位基因數(shù)(Na)平均為10.91，有效等位基因數(shù)(Ne)平均為5.40，主等位基因頻率(MAF)平均為0.31，多態(tài)信息含量(PIC)平均為0.79。另外，基于cpSSR數(shù)據(jù)，對(duì)55個(gè)樣本的UPGMA聚類(lèi)結(jié)果進(jìn)行了初步討論。

鐵線蓮屬；葉綠體微衛(wèi)星；引物開(kāi)發(fā)；等位基因

葉綠體基因組通常為母性遺傳，基因變異概率低且進(jìn)化速率緩慢，因而被廣泛應(yīng)用于植物分類(lèi)及系統(tǒng)進(jìn)化分析[1-2]。葉綠體微衛(wèi)星(Chloroplast simple sequence repeat，cpSSR)在基因組中出現(xiàn)的頻率較高[3-4]，與核SSR(Simple sequence repeat)相比，既具有共顯性遺傳、多態(tài)性豐富的特點(diǎn)，又保持了葉綠體基因組的單親遺傳模式，幾乎不發(fā)生重組，在遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)、親緣地理學(xué)和雜種鑒定方面被廣泛應(yīng)用，是一種高效的分子標(biāo)記技術(shù)。

鐵線蓮屬(Clematis)是毛茛科中包含種類(lèi)最多的一屬，分布于北溫帶[5]，世界范圍內(nèi)約有鐵線蓮屬植物300余種[6-7]，多為木質(zhì)藤本。本屬植物花型、花色多樣，觀賞栽培品種豐富，被譽(yù)為藤本皇后，深受家庭園藝愛(ài)好者的喜愛(ài)。鐵線蓮屬植物含有類(lèi)黃酮、三萜皂苷等化學(xué)成分，具有很高的藥用研究?jī)r(jià)值。有關(guān)該屬植物分類(lèi)和系統(tǒng)進(jìn)化方面的研究已取得許多重要結(jié)果[8-10]，但屬內(nèi)仍有多個(gè)組別的鐵線蓮分類(lèi)學(xué)地位并未明確[11-13]。目前，已有多種分子標(biāo)記方法用于鐵線蓮屬植物系統(tǒng)進(jìn)化及遺傳多樣性研究。Gardner等[14]利用ISSR標(biāo)記對(duì)32個(gè)藤本鐵線蓮品種和5個(gè)直立型品種的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析；RAPD標(biāo)記被用于鑒定鐵線蓮雜交種[15]；atpB-rbcLspacer region、matK、trnK、trnLintron、trnL-trnFspacer region等葉綠體基因組序列被應(yīng)用于鐵線蓮屬種間遺傳多樣性分析[16-17]，蔣明等[18]和李驍?shù)萚19]對(duì)共計(jì)14種藥用鐵線蓮屬植物的ITS序列進(jìn)行了分析，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。但有關(guān)鐵線蓮屬植物葉綠體SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到Clematisfuscavar.coreana的葉綠體全基因序列，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行cpSSR引物開(kāi)發(fā)，并用于鐵線蓮野生種和栽培種之間遺傳信息的檢測(cè)，篩選出的cpSSR引物可作為本屬植物系統(tǒng)發(fā)育、群體遺傳結(jié)構(gòu)等遺傳信息檢測(cè)和研究的有效工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 cpSSR位點(diǎn)搜尋與引物開(kāi)發(fā)

從GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)下載C.fuscavar.coreana的葉綠體全基因組序列(GenBank No. KM652489.1)，用Misa軟件分析其SSR位點(diǎn)信息，參數(shù)設(shè)置：?jiǎn)螇A基、二堿基和三堿基重復(fù)微衛(wèi)星最小重復(fù)次數(shù)分別為10、6和4，四堿基和四堿基以上微衛(wèi)星最小重復(fù)次數(shù)為3。使用微軟Windows 7系統(tǒng)的記事本和Excel 2007軟件打開(kāi)Misa軟件的分析結(jié)果文件*.statistics和*.misa，查看和統(tǒng)計(jì)C.fuscavar.coreana葉綠體基因組序列全長(zhǎng)、SSR位點(diǎn)數(shù)量和具體分布位置、不同類(lèi)型SSR占比等信息。利用Primer Premier 5軟件，按照引物長(zhǎng)度20～25 bp，PCR產(chǎn)物100～300 bp，退火溫度50～65 ℃，正、反向引物退火溫度之差在5 ℃以內(nèi)，GC含量30%～60%設(shè)計(jì)引物，盡量避免引物出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)

使用E.Z.N.A Plant DNA Mini Kit Spin Protocol (Omega Bio-tek)試劑盒提取葉片基因組DNA。PCR總反應(yīng)體系為20 μL:ddH2O 11 μL，10× buffer 2 μL，dNTP(10 mmol·L-1)0.4 μL，Dynazyme II DNA polymerase 0.6 μL，DNA(約20 ng)2 μL，引物各2 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 45 s；94 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)后，使用Qsep100毛細(xì)管電泳(中國(guó)臺(tái)灣產(chǎn))測(cè)定產(chǎn)物片段大小。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

使用Powermarker V3.25和Popgene 3.2軟件統(tǒng)計(jì)主等位基因頻率、等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量等信息，并依據(jù)Nei’s遺傳距離，采用UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[20]。

表1供試材料信息

Table1Information of samples

*表示野生種

* means wild species

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體SSR的分布特征

C.fuscavar.coreana的葉綠體基因組全序列長(zhǎng)度為159 609 bp，從1 088 bp到158 278 bp共分布有67個(gè)SSR位點(diǎn)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，SSR位點(diǎn)序列總長(zhǎng)度777 bp，為葉綠體基因組長(zhǎng)度的0.5%；其中，單堿基重復(fù)微衛(wèi)星50個(gè)，占比74.63%，A和T是主要重復(fù)單元，分別占38.0%和60.0%，G僅出現(xiàn)1次，C沒(méi)有出現(xiàn)；二至四堿基微衛(wèi)星包括14種基元，二堿基微衛(wèi)星共3個(gè)(占4.5%)，所含基元僅TA一種；三堿基微衛(wèi)星共4個(gè)(占6.0%)，含有4種基元；四堿基微衛(wèi)星共10個(gè)(占14.9%)，含9種基元，其中ATAA出現(xiàn)了2次，占微衛(wèi)星總數(shù)的3.0%(表2)。cpSSR在整個(gè)葉綠體基因組中分布并不均勻，在1 088～41 445 bp(占總長(zhǎng)度25.3%)和50 125～127 217 bp(占總長(zhǎng)度48.3%)區(qū)域相對(duì)密集，分別有27(占40.3%)和38(占56.7%)個(gè)微衛(wèi)星。而在起始區(qū)域1～1 087 bp沒(méi)有SSR位點(diǎn)分布，末尾區(qū)域157 054～159 609 bp僅有2個(gè)SSR位點(diǎn)。

2.2 cpSSR引物設(shè)計(jì)結(jié)果

使用Primer Premier 5對(duì)隨機(jī)挑選的5個(gè)單堿基重復(fù)微衛(wèi)星[A]11、[A]14、[G]10、[T]10、[T]13及二堿基及以上重復(fù)的17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。共篩選獲得11對(duì)引物，具體信息見(jiàn)表3。

2.3 cpSSR引物檢測(cè)結(jié)果

引物在11種野生鐵線蓮的46個(gè)樣本和9個(gè)栽培品種的9個(gè)樣本中，共得到120條產(chǎn)物帶，毛細(xì)管檢測(cè)結(jié)果清晰、明確(圖1)。各引物對(duì)在仙女座、倪歐碧、粉香檳、吉恩斯、面白和雪舞等6個(gè)栽培品種中均未能得到擴(kuò)增產(chǎn)物，所得產(chǎn)物片段大小為191～303 bp。由表4可知，得到有效擴(kuò)增產(chǎn)物的55個(gè)樣本(野生種和栽培品種)中：產(chǎn)物條帶數(shù)7～18，平均10.91；有效條帶數(shù)3.92～8.33，平均5.40；主等位基因頻率0.22～0.44，平均0.31；多態(tài)信息含量0.72～0.88，平均0.79，其中，引物Clecp3多態(tài)信息含量最高，Clecp9最低(表4)。11個(gè)cpSSR位點(diǎn)均呈現(xiàn)良好的多態(tài)性，多態(tài)基因位點(diǎn)百分比為100%。

2.4 聚類(lèi)分析

由UPGMA法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)可知，在Nei’s遺傳距離0.886 5處(圖2虛線位置)，55個(gè)鐵線蓮樣本分別聚為5組。10個(gè)野生種類(lèi)聚集在第Ⅰ～Ⅳ組，1個(gè)野生種類(lèi)和9個(gè)栽培品種聚集在第Ⅴ組。其中，單葉鐵線蓮的3個(gè)樣本單獨(dú)聚為1組(Ⅰ)，柱果鐵線蓮、山木通共18個(gè)樣本和女萎、短尾鐵線蓮共17個(gè)樣本分別聚為2組(Ⅱ和Ⅲ)，圓錐鐵線蓮、安徽鐵線蓮、大花威靈仙、天臺(tái)鐵線蓮和毛蕊鐵線蓮共6個(gè)樣本聚集為第Ⅳ組，毛萼鐵線蓮和9個(gè)栽培品種共11個(gè)樣本集合為第Ⅴ組。

表2C.fuscavar.coreana葉綠體微衛(wèi)星基元組成信息

Table2Repeat motifs in cpDNA ofC.fuscavar.coreana

表311對(duì)引物信息表

Table3The information of 11 pairs of cpSSR primer

標(biāo)記位點(diǎn)在基因組中的位置重復(fù)類(lèi)型引物序列退火溫度產(chǎn)物大小LocusLocationRepeattypesPrimersequences(5′to3′)TM/℃Productsizes/bpClecp1rps16/trnKintergenic[ATA]4F：AAATGCCAATCCAACA48218R：CCCGGATAAGATAAATGAClecp2psbE/petLintergenic[ATT]4F：ATGTGCCATTCAAGAT49184R：TGGCGGGAATAGAAATClecp3trnS/trnVintergenic[TTG]6F：GAAATTCCCTTGGTTG48269R：CATTGAAACGCTTACTTClecp4atpB/rbcLintergenic[AAAG]3F：CCGTTGTTTCTTATTT44267R：TGAAAGTTTCGCATTAClecp5rpl16intron[AGAA]3F：AAGGGATATGGATAAATGG53277R：TGACTAGGCCCGAACTClecp6rps16/trnKintergenic[AGAT]3F：TGACCCAAGAAATCCC51181R：CCATAGGCTCATAAAGAATClecp7ndhH/rps15intergenic[ATAA]3F：ACCGTTGGTAGAGTTT48284R：AATTAAGAACCGAAGCClecp8trnKintron[ATAA]3F：TTGATGGGTGTTGAGG50274R：ACTCCTGGCTTATTTGClecp9ycf1intron[CATT]3F：TTTGCGGTACTAATCT48246R：TATCACAAGCCCAAGTClecp10rpl14/rpl16intergenic[CTAA]3F：GTAGAGGCATATTGGG49295R：ATGGAACGAAAGGAAAClecp11rpl16intron[TTTC]3F：AATGACTAGGCCCGAACT53281R：CAAAGGGATATGGATAAATG

Marker-L和Marker-H分別表示20和1 000 bp標(biāo)準(zhǔn)峰，Product為產(chǎn)物峰Marker-L and Marker-H represent the standard peak of 20 and 1 000 bp， Product represents the peak of product size圖1 引物Clecp3擴(kuò)增野生樣本8(A)和栽培品種64(B)的產(chǎn)物毛細(xì)管電泳結(jié)果Fig.1 Product sizes of primer Clecp3 from sample 8 and 64 tested by capillary electrophoresis

表4鐵線蓮11對(duì)cpSSR引物的遺傳多樣性參數(shù)

Table4Genetic diversity of 11 pairs of cpSSR primers ofC.fuscavar.coreana

標(biāo)記位點(diǎn)主等位基因頻率觀測(cè)等位基因數(shù)等位基因數(shù)多態(tài)信息含量LocusMAFNaNePICClecp102909900004748807589Clecp202909700004521707455Clecp3021821500008333308808Clecp4041821800004403207752Clecp5029091100005411407991Clecp6030911000005591508035Clecp702727900005873808157Clecp8023641300006237108296Clecp904364900003923507235Clecp1003273900004646707615Clecp11027271000005675408125均值Mean030581090915397007914

虛線處為Nei’s遺傳距離0.886 5Nei’s genetic distance of 0.886 5 was marked by dotted line圖2 基于UPGMA法構(gòu)建的55個(gè)樣本聚類(lèi)樹(shù)Fig.2 Cluster tree of 55 samples based on UPGMA algorithm

3 討論

3.1 cpSSR引物的開(kāi)發(fā)

葉綠體基因組保守性強(qiáng)，具有細(xì)胞質(zhì)遺傳的特點(diǎn)，除少數(shù)植物外，一般為單親遺傳。遺傳物質(zhì)由親代向子代傳遞過(guò)程中不發(fā)生基因重組，不會(huì)受到選擇壓力，由于突變等因素產(chǎn)生的變異也因此更容易保存。葉綠體基因組具有獨(dú)立的進(jìn)化路線，因此，cpSSR技術(shù)在進(jìn)行植物分類(lèi)、群體遺傳結(jié)構(gòu)及物種演化等研究中優(yōu)勢(shì)顯著。cpSSR標(biāo)記應(yīng)用的難點(diǎn)在于需要進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和篩選，通過(guò)構(gòu)件基因組文庫(kù)的方法耗時(shí)耗力，效率較低。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索法則是利用已知的核酸序列，搜索SSR位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和驗(yàn)證。目前，GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中存儲(chǔ)有大量高等植物葉綠體基因組全部或部分序列[21-23]，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行葉綠體微衛(wèi)星標(biāo)記開(kāi)發(fā)，較文庫(kù)構(gòu)建等方法更為經(jīng)濟(jì)、高效。

3.2 cpSSR的重復(fù)基元類(lèi)型

C.fuscavar.coreana的葉綠體微衛(wèi)星以單堿基低重復(fù)基元為主，且A和T占比較高，與水稻、黃瓜、擬南芥等多種植物[24-27]相似，這種以單堿基重復(fù)為主、低豐度的分布特點(diǎn)可能與葉綠體基因組自身特性和進(jìn)化方向有關(guān)。此外，二堿基和三堿基微衛(wèi)星分別出現(xiàn)了3和4個(gè)，與其他高等植物相比，含量偏低[28]。

3.3 引物通用性與多態(tài)性

葉綠體基因組序列十分保守，其進(jìn)化速率僅為核基因組的1/5[29]，這使得cpSSR標(biāo)記可在近源物種通用[30]。本研究篩選的11對(duì)cpSSR引物在鐵線蓮11個(gè)(100%)野生種和9個(gè)(60%)栽培品種中均可獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，有效等位基因數(shù)均值為5.40，顯示了其在鐵線蓮不同種間良好的通用性。微衛(wèi)星序列多態(tài)性的產(chǎn)生源于重復(fù)基元數(shù)目的改變，與堿基的插入或缺失有關(guān)，多態(tài)信息含量PIC可以顯示SSR序列的變異程度[31]。11對(duì)引物在55個(gè)樣本中檢測(cè)到的PIC平均值較高，達(dá)到0.791 4，所得PCR擴(kuò)增條帶均大于預(yù)計(jì)目標(biāo)條帶，表明此11個(gè)位點(diǎn)均存在由堿基插入所致的微衛(wèi)星長(zhǎng)度變異。

3.4 聚類(lèi)分析

用于本研究的46個(gè)鐵線蓮野生種類(lèi)樣本源于浙江和安徽省，通過(guò)植物志信息核對(duì)和專(zhuān)家鑒定的方式進(jìn)行種類(lèi)確認(rèn)。15個(gè)栽培品種由波蘭進(jìn)口，通過(guò)將觀測(cè)到的植株花、葉形態(tài)信息在國(guó)際鐵線蓮協(xié)會(huì)(International Clematis Society，http://www.clematisinternational.com/)的數(shù)據(jù)庫(kù)逐一核對(duì)進(jìn)行品種身份確認(rèn)。Upmga聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)野生種類(lèi)、栽培品種聚集在不同的組，表明其遺傳背景存在顯著差異。鐵線蓮不同野生種分別聚類(lèi)，其中單葉鐵線蓮的3個(gè)樣本自成1組，女萎、短尾鐵線蓮和山木通、柱果鐵線蓮分別聚集成2個(gè)組，顯示了較近的親緣關(guān)系。但蔣明等[18]利用ITS序列所得聚類(lèi)結(jié)果中，女萎與毛蕊鐵線蓮聚為1組，山木通與柱果鐵線蓮則分屬于2個(gè)組，這表明不同的分子標(biāo)記方法和所檢測(cè)種類(lèi)總數(shù)可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響。

圓錐鐵線蓮(1個(gè)樣本)、安徽鐵線蓮(1個(gè)樣本)、大花威靈仙(1個(gè)樣本)、天臺(tái)鐵線蓮(1個(gè)樣本)和毛蕊鐵線蓮(2個(gè)樣本)聚集為第Ⅳ組，而毛萼鐵線蓮(2個(gè)樣本)則同栽培品種聚集于1組，這可能是由于供試樣本少，導(dǎo)致聚類(lèi)圖分辨率較低所致，并不能準(zhǔn)確顯示不同種類(lèi)之間的遺傳差異，可通過(guò)增加檢測(cè)樣本數(shù)量進(jìn)一步驗(yàn)證。鐵線蓮栽培品種育種多采用雜交獲取，多代雜交與回交、F1代間再次雜交的情況并不鮮見(jiàn)，遺傳信息的交換與重組比較復(fù)雜，親緣關(guān)系遠(yuǎn)近不一。本研究中，仙女座等6個(gè)品種沒(méi)有獲得目標(biāo)PCR產(chǎn)物，其育種過(guò)程信息在國(guó)際鐵線蓮協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)庫(kù)中并無(wú)記錄，遺傳背景暫無(wú)法確認(rèn)。此外，葉綠體SSR具有單親遺傳特性，這為評(píng)判雜交后代與母本的親緣關(guān)系提供了有效工具，但同時(shí)也對(duì)遺傳背景不明的雜交后代親緣關(guān)系評(píng)價(jià)造成了局限。本次參試的樣本中不包括雜交親本與子代或馴化栽培品種與原種，有關(guān)11對(duì)cpSSR引物在鐵線蓮栽培品種雜交親本與子代中應(yīng)用的有效性有待進(jìn)一步研究。

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DevelopmentandgeneticanalysisofnovelchloroplastmicrosatellitemarkersofClematis

CHEN Wenchao， SU Wanhan， LIU Zhigao*， JI Mengcheng

(CollegeofLandscapeArchitecture，ZhejiangA&FUniversity，Lin’an311300，China)

The whole chloroplast genome sequence ofClematisfuscavar.coreanafrom GeneBank database was analyzed， and 11 cpSSR primer pairs were designed based on that. In addition， the transferability of the 11 pairs of cpSSR primer in different species and cultivars ofClematiswere studied. The results showed that 67 cpSSRs were distributed across the whole chloroplast genome， and most of them located in the area 1 088-41 445 bp and 50 135-127 217 bp， which generally consisted of a single base A/T. All of the 11 pairs of cpSSR primer could be successfully cross-amplified in different species and cultivars ofClematis， which indicated that the 11 primer pairs for cpSSR markers had good transferability inClematis. The average number of alleles (Na) was 10.91， effective number of alleles (Ne) was 5.40， major allele frequency (MAF) was 0.31， and polymorphism information content (PIC) was 0.79. In addition， clustering result of UPGMA of 55 samples based on cpSSR data was discussed.

Clematis; cpSSR; primer development; allele

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2023-2031

http://www.zjnyxb.cn

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10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.10

2017-05-12

浙江省農(nóng)業(yè)(林木)新品種選育重大科技專(zhuān)項(xiàng)子課題(2016C02056-13-4)；浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)生科研訓(xùn)練項(xiàng)目(104-2013200015)

陳文超(1995—)，男，浙江杭州人，園林專(zhuān)業(yè)本科生。E-mail: 80576133@qq.com

*通信作者，劉志高，E-mail: vzhigao@sina.com

S567.23+9

A

1004-1524(2017)12-2023-09

(責(zé)任編輯侯春曉)