吳華莉，涂尾龍，曹建國，吳 瀟，常 華，都啟晶，談永松*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 201302；3上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海 201106；4云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；5青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109）

基于RFLP-PCR的豬肉溯源技術(shù)研究

吳華莉1，2，涂尾龍1，2，曹建國1，2，吳 瀟3，常 華4，都啟晶5，談永松1，2*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 201302；3上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海 201106；4云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；5青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109）

選取杜洛克、大白豬和長白豬等3個品種共330頭樣品，提取基因組DNA，采用RFLP-PCR方法檢測13個基因在3個豬品種群體內(nèi)15個SNP位點的多態(tài)性，以期尋找到多態(tài)性信息含量豐富的SNP位點用于豬肉DNA溯源標(biāo)記。結(jié)果表明：ADAMTS、DAZL、FBXO32、FUT1、MC4R、MyoG、NR4A1和 PSMB基因的9個 SNP位點可以用于杜洛克豬、大白豬和長白豬肉產(chǎn)品檢測。根據(jù)9個SNP位點基因型對應(yīng)的9個數(shù)字和字母組合形成的DNA條形碼可以用于杜洛克豬、大白豬和長白豬肉產(chǎn)品溯源。

豬肉；DNA溯源；SNP

肉品的溯源檢測在保護(hù)和提高肉類品牌過程中能起到重要作用，也可以在食品危機(jī)時有效辨別和召回污染食品。近年來，人們逐漸重視食品的質(zhì)量和安全，一些學(xué)者在牛、羊和豬等肉類品種溯源方面開展了相關(guān)研究［1］。Rodríguez-Ramírez等［2］采用11個微衛(wèi)星標(biāo)記檢測墨西哥牛肉樣品，結(jié)果顯示：7個微衛(wèi)星標(biāo)記可以用來追溯牛的屠宰和銷售等各個環(huán)節(jié)采集的樣品是否來源于同一個體。Goffaux等［3］研究了長白×大白×皮特蘭雜交豬、純種皮特蘭和長白豬種，共檢測出21個SNP位點標(biāo)記可以用于品種溯源。豬肉溯源功能是指消費者向養(yǎng)豬場獲取生豬或豬肉產(chǎn)品的來源，即在豬養(yǎng)殖、屠宰、加工和銷售等環(huán)節(jié)都能追溯到產(chǎn)品豬的個體信息。分子溯源標(biāo)記為豬溯源提供一種方便方法，由于每個豬個體的DNA序列具有唯一性和穩(wěn)定性，通過鑒別個體DNA特征能夠準(zhǔn)確地識別豬種個體。本試驗采用RFLP-PCR方法分別對杜洛克豬、大白豬和長白豬的相關(guān)SNP進(jìn)行檢測分析，以期獲得可用于3個豬種豬肉產(chǎn)品溯源系統(tǒng)的SNP標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 動物樣品

三個品種的豬樣品來自上海祥欣畜禽有限公司，杜洛克（100頭）、大白豬（150頭）、長白豬（80頭）共計330頭，采集豬耳組織并保存于75%酒精中，置于冰盒中運回實驗室，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用AXYGEN組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，并稀釋到30 ng/mL，-20℃保存。

1.2.2 引物及PCR擴(kuò)增

查閱NCBI數(shù)據(jù)庫和已有報道，根據(jù)遺傳多樣性分布特點選擇15個SNP作為候選標(biāo)記位點（表1），包括與豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的基因H-FABP（豬心臟脂肪酸結(jié)合蛋白基因）、MC4R（黑皮質(zhì)素受體-4基因）和MyoG（肌細(xì)胞生成素基因），與豬繁殖性狀相關(guān)的基因ADAMTS（含凝血酶敏感蛋白模體的去解聯(lián)金屬蛋白酶基因）、RBP4（視黃醇結(jié)合蛋白4基因），與豬病有關(guān)的基因FUT1［α-（1，2）海藻糖轉(zhuǎn)移酶1基因］、DAZL（類似無精子癥基因）、PSMB10（20S蛋白酶體基因beta亞基基因10）、FBXO32（泛素連接酶基因）、PSMC3（19S調(diào)節(jié)亞基 Rpt5基因）、BPI（殺菌通透性增強(qiáng)蛋白基因）、NR4A1（核受體4A1基因）、ALAS1（5-氨基酮戊酸合成酶基因）。隨機(jī)抽取10個個體的DNA樣品作為擴(kuò)增模板，檢測15對引物（表1）的擴(kuò)增效率，引物由上海生工生物工程公司合成。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，退火30 s（退火溫度見表1），72℃延伸30 s，共36個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物由1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，要求條帶清晰無雜帶。

表1 用于檢測13個基因的15個SNP位點引物和內(nèi)切酶Table1 Primers and endonucleases used to detect 15 SNP lociof 13 genes

1.2.3 PCR-RFLP分析

將擴(kuò)增成功的片段用于酶切反應(yīng)，所使用的限制性內(nèi)切酶如表1所示。酶切體系由10μL PCR產(chǎn)物、5 U限制性內(nèi)切酶和1μL Buffer組成，反應(yīng)時間根據(jù)PCR產(chǎn)物大小調(diào)整，PCR產(chǎn)物片段小于500 bp為15 min，大于500 bp為30 min左右。所使用的限制性內(nèi)切酶購自Fermentas、NEB和寶生物工程有限公司。

1.2.4 統(tǒng)計方法

計算出每個SNP的等位基因頻率，雜合度的計算公式：H＝1-∑pi，可用于DNA溯源標(biāo)記的SNP要求H值大于0.30。

1.2.5 DNA條形碼的編制方法

DNA條形碼編制方法：數(shù)字條形碼編制時，各SNP位點先組合形成DNA條形碼。SNP位點使用阿拉伯?dāng)?shù)字標(biāo)記。DNA條形碼中每個SNP位點都有3種基因型，命名為A、B和C。例如第1對引物擴(kuò)增SNP1位點對應(yīng)的DNA條形碼編號為1A、1B和1C，具體編碼要根據(jù)個體檢測結(jié)果加以命名。最終形成DNA條形碼為數(shù)字和字母的組合，包括SNP位點信息和基因型信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 MyoG（2FR）、PMSB（1FR）、MC4R和 DAZL基因的RFLP分析

如圖1所示，PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物條帶清晰明亮，可以判定基因型。根據(jù)不同基因型選取樣品，一般每個基因型選擇2個樣品進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對，確定所研究的13個基因序列為豬 H-FABP、MC4R、MyoG、ADAMTS、RBP4、FUT1、DAZL、PSMB10、FBXO32、PSMC3、BPI、NR4A1和ALAS1基因（由于位點數(shù)目較多，僅提供幾個RFLP示例圖作為參考）。

圖1 豬MyoG（2FR）、PMSB（1FR）、MC4R和DAZL基因的RFLP多態(tài)位點分析Fig.1 RFLP polymorphism analysis of MyoG（2FR），PMSB（1FR），MC4R and DAZL in pig

2.2 PCR-RFLP檢測結(jié)果

利用15個SNP標(biāo)記引物對大白、長白及杜洛克豬進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：每個引物在不同個體擴(kuò)增出的片段大小是一致的，但經(jīng)PCR-RFLP后電泳檢測的條帶大小和數(shù)目不盡相同。產(chǎn)生酶切位點的等位基因稱為B型基因，酶切位點消失的等位基因稱為A型基因。ADAMTS擴(kuò)增出413 bp，經(jīng)內(nèi)切酶PvuⅡ分成413/316/97 bp，記為 SNP1。FBXO32擴(kuò)增出1 077 bp，經(jīng)內(nèi)切酶 Sna BⅠ分成 1 077/608/469 bp，記為SNP5。SNP1和SNP5在3個豬種中等位基因分布較平衡。ALAS1（SNP2）、DAZL（SNP4）、MyoG（SNP9和SNP10）和 RBP4（SNP15）基因擴(kuò)增出長度分別為359 bp、437 bp、959 bp、353 bp和480 bp的5個片段，5個片段分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶MSPⅠ消化后產(chǎn)生324/277/47/35 bp、437/247/190 bp、418（264+154）/370/171 bp、353/219/134 bp和190/154/136/125/75 bp。統(tǒng)計結(jié)果顯示：SNP2和SNP9位點等位基因頻率分布不平衡，3個品種都是A型基因占優(yōu)勢；SNP4位點等位基因頻率分布不平衡，在杜洛克豬種中B型基因占優(yōu)勢，在長白豬和大白豬種中A型基因占優(yōu)勢；SNP10位點等位基因頻率分布不平衡，3個品種都是B型基因占優(yōu)勢；SNP15位點等位基因頻率分布不平衡，在杜洛克豬和長白豬中A型基因占優(yōu)勢，大白豬種中B型基因占優(yōu)勢。H-FABP基因可由引物擴(kuò)增出816 bp的片段，經(jīng)HaeⅢ內(nèi)切酶切分成683（405+278）/117/16 bp，記為SNP7。SNP7位點等位基因頻率在大白豬種分布平衡，在杜洛克豬和長白豬種中B型基因占優(yōu)勢。MC4R（SNP8）基因擴(kuò)增出長度為999 bp的片段，被DdeⅠ消化后所得片段長度為999/899/100 bp，這個位點的等位基因在3個豬種中分布不平衡，在杜洛克豬和大白豬中A型基因占優(yōu)勢，在長白豬中B型占優(yōu)勢。BPI（SNP3）和PSMB10（1FR）（SNP12）基因可擴(kuò)增出長度為445 bp和642 bp的片段，分別被HpaⅡ和Eco81Ⅰ消化后所得片段長度為445/304/142 bp和642/535/107 bp，這兩個位點的等位基因在3個豬種中分布不平衡，在杜洛克豬中A型基因占優(yōu)勢，在長白豬和大白豬中B型占優(yōu)勢。FUT1（SNP6）和PSMC3（SNP14）基因可擴(kuò)增出長度為328 bp和642 bp的片段，分別被HhaⅠ和MvaⅠ消化后所得片段長度為328/241/87 bp和440（282+158）bp，這兩個位點的等位基因在3個豬種中分布平衡，都是B型占優(yōu)勢。NR4A1（SNP11）基因擴(kuò)增出長度為128 bp的片段，被DdeⅠ消化后所得片段長度為128/96/32 bp，這個位點的等位基因在3個豬種中分布平衡，都是A型占優(yōu)勢。PSMB10（2FR）（SNP13）基因擴(kuò)增長度為802 bp，被Eco72Ⅰ消化后所得片段長度為802/550/252 bp，這個位點的等位基因在3個豬種中分布不平衡，在杜洛克豬中B型基因占優(yōu)勢，在長白豬和大白豬中A型占優(yōu)勢。

2.3 雜合度（H）分析

結(jié)果顯示（表2）：在不同豬種中SNP1、SNP5、SNP11和SNP13位點的H值均高于0.30，表明多態(tài)性信息含量豐富，可用于溯源標(biāo)記；SNP4、SNP6、SNP8、SNP10和SNP12的H值在0.21—0.53，多態(tài)信息含量豐富，可用于溯源標(biāo)記；SNP15在不同豬種顯示出不同的多態(tài)性，在長白豬和大白豬中H值在0.28以上，在杜洛克豬中H值為0.18，SNP8位點能否作為溯源標(biāo)記還需進(jìn)一步驗證；SNP2在杜洛克豬種中H值為0，不適合作為溯源標(biāo)記；SNP3在長白豬和大白豬種中H值小于0.1，顯示出低度多態(tài)性，不適合作為溯源標(biāo)記；SNP7在長白豬種中H值為0，不符合溯源標(biāo)記要求；SNP9和SNP14在杜洛克豬和長白豬中H值為0，不能選用此標(biāo)記為溯源標(biāo)記位點。因此，能夠用于杜洛克豬、長白豬和大白豬肉DNA溯源標(biāo)記的位點有 SNP1、SNP4、SNP5、SNP6、SNP8、SNP10、SNP11、SNP12和 SNP13。

表2 15個SNP在3個豬品種中所顯示的等位基因頻率及雜合度Table 2 Allele frequencies and heterozygosity of the 15 SNP markers in 3 pig varieties

2.4 SNP用于肉品溯源的驗證

2.4.1 9 個SNP位點在3個豬種群體中的雜合度

為進(jìn)一步驗證上述9個SNP在溯源標(biāo)記中的可行性，在不同地點重新取樣進(jìn)行RFLP-PCR分析，結(jié)果顯示：9個SNP位點H值均大于0.3。從雜合度上來說，這9個SNP位點符合溯源標(biāo)記的要求（表3）。

表3 9個SNP標(biāo)記在330個樣品中所顯示的等位基因頻率及雜合度Table 3 Allele frequencies and heterozygosity of the 9 SNPmarkers in 330 samples

2.4.2 根據(jù)9個SNP位點信息編制DNA條形碼用于豬肉溯源的驗證試驗

DNA條形碼中9個SNP位點的每個SNP位點都有3種基因型，命名為A、B和C（此處A、B和C表示3種基因型，與2.2處 A和 B代表含義不同）。9個 SNP位點分別為 SNP1、SNP4、SNP5、SNP6、SNP8、SNP10、SNP11、SNP12、SNP13。表4列出10個樣品的檢測結(jié)果和命名方法，具體DNA條形碼編碼要根據(jù)個體檢測結(jié)果加以命名。在采集的杜洛克、長白和大白豬群體樣本中，根據(jù)本試驗篩選到的9個SNP位點編制個體對應(yīng)DNA條形碼，可以區(qū)分不同個體，每個個體對應(yīng)的DNA條形碼都是唯一的。杜洛克、長白和大白豬基因型也檢測出差異，在編制DNA條形碼時，發(fā)現(xiàn)同一品種內(nèi)某個SNP位點檢測出同種基因型，這會導(dǎo)致同一品種在編制DNA條形碼時出現(xiàn)幾個SNP位點相同數(shù)字和字母組合。這同時也表明DNA條形碼在區(qū)別不同個體的同時，也可以區(qū)別不同的品種。表4中樣品5和樣品7來源于杜洛克豬，它們的條形碼中出現(xiàn)8個SNP相同，SNP9位點檢測出不同基因型。樣品8、9和10來源于長白豬，分別在SNP4和SNP8位點檢測出不同的基因型。

表4 根據(jù)9個SNP位點編制的DNA條形碼Table 4 DNA barcode based on 9 SNP loci in 3 pig varieties

3 討論

我國肉類溯源標(biāo)記技術(shù)仍停留在傳統(tǒng)的標(biāo)簽溯源技術(shù)上，致使追溯鏈出現(xiàn)漏洞，動物被屠宰分割后溯源難以繼續(xù)追蹤下去。國外已經(jīng)開始采用DNA技術(shù)進(jìn)行肉制品溯源，并建立了豬肉追蹤系統(tǒng)［16］，而我國目前還沒有應(yīng)用此技術(shù)?；赗FLP-PCR的DNA溯源技術(shù)易分型、重復(fù)性好、檢測手段簡單，但同時也要求用于檢測的組織樣品必須為單一純凈組織樣品，因為來自不同個體組織樣混合成的肉樣品會混淆檢測信號，從而給檢測帶來分析困難［3］。

本試驗選擇13個基因的15個SNP作為候選標(biāo)記位點，采用RFLP-PCR方法對杜洛克豬、長白豬和大白豬種進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：每個SNP位點在3個豬種中所顯示的多態(tài)性分布是不同的，其中SNP12和SNP3雖然位于PSMB10基因上，但兩個位點之間不存在遺傳連鎖現(xiàn)象，相互獨立，因此二者都可作為3個豬肉產(chǎn)品的有效溯源標(biāo)記。張小波等［17］選擇12個SNP作為候選標(biāo)記位點，以上海本地常用豬種為材料檢測每個SNP等位基因的分布情況，研究結(jié)果證實H-FABP、MC4R、MyoG、ADAMTS和ESR基因6個SNP位點可用于豬肉產(chǎn)品的溯源體系。本試驗篩選的MC4R、MyoG、ADAMTS與張小波等［17］研究結(jié)果一致。本試驗H-FABP基因檢測結(jié)果顯示，在長白豬群體中只出現(xiàn)一種基因型，這種偏態(tài)現(xiàn)象的原因可能是由于長白豬經(jīng)過長期選育造成某種基因型缺失，這一推測還需要擴(kuò)大樣品加以驗證。

本試驗篩選 ADAMTS、DAZL、FBXO32、FUT1、MC4R、MyoG、NR4A1和 PSMB10基因的9個 SNP可滿足杜洛克豬、長白豬和大白豬肉產(chǎn)品的識別，理論上可用于2×104＝20 000頭豬個體身份DNA識別的數(shù)字條形碼編制，基本可以滿足500—600頭種豬規(guī)模的養(yǎng)豬場豬的個體身份識別，如果規(guī)模更大，則可通過新增有效SNP位點來實現(xiàn)?；赗FLP-PCR的豬肉溯源技術(shù)應(yīng)用的過程：從養(yǎng)殖場運到屠宰場的豬，采集血液樣本或者耳組織塊，進(jìn)行多個SNP位點檢測，建立個體“DNA條形碼”。當(dāng)豬肉銷售時出現(xiàn)問題，采集豬肉樣品做多個SNP位點分析，然后從數(shù)據(jù)庫查詢與之匹配的信息，從而快速鑒定出市場中生鮮肉類是否摻假。DNA溯源技術(shù)不受胴體被分割的限制，選擇多態(tài)信息含量豐富的標(biāo)記位點能夠識別不同品種豬不同個體的來源，從而將每個動物個體追溯到原產(chǎn)地，對豬屠宰后肉制品的跟蹤、追溯具有參考價值，這種技術(shù)可從源頭上控制并消除食品安全隱患，

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Study on the traceability technology of pork based on RFLP-PCR

WU Hua-li1，2，TUWei-long1，2，CAO Jian-guo1，2，WU Xiao3，CHANG Hua4，DU Qi-jing5，TAN Yong-song1，2*
（1Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai201106，China；2Shanghai Pig Breeding and Engineering Research Center，Shanghai201302，China；3Institute of Biological Technology，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai201106，China；4Faculty of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming650201，China；5College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao266109，China）

A total of 330 samples of Duroc，Large white and Landrace pigswere selected to extract genome DNA.The RFLP-PCR method was used to detect the polymorphism of13 genes in 15 SNP loci in 3 pig varieties to find SNP lociwith rich polymorphism information for the traceabilitymarker of pork DNA.The results showed that9 SNP loci ADAMTS，DAZL，F(xiàn)BXO32，F(xiàn)UT1，MC4R，MyoG，NR4A1 and PSMB genes could be used for the detection of Duroc，Large white and Landrace pork products.DNA barcodes formed by the combination of 9 numbers and alphabetical combinations of 9 SNP loci genotypes could be used in Duroc and Large white，Landrace pork traceability.

Pork；DNA traceability；Single nucleotide polymorphism

2016-04-01

上海市科委科技支撐項目（13391900100）；上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目［滬農(nóng)科攻字（2013）第5-6號）、滬農(nóng)青字（2014）第1-34號］

吳華莉（1975—），女，博士，助理研究員，研究方向為豬遺傳育種。E-mail：hiwuhuali＠163.com

*通信作者，E-mail：typine＠163.com

S879.2

A

1000-3924（2017）06-057-06

閆其濤）