王 鵬，韋月平

（遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，丹東 118003）

‘小金海棠’多酚對(duì)高脂小鼠肝組織的影響

王 鵬，韋月平

（遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，丹東 118003）

采用飼喂高脂飼料建立高脂小鼠模型，‘小金海棠’多酚（MXP）灌胃給藥（50 mg/kg、100 mg/kg）連續(xù)7周檢測(cè)肝組織中甘油三酯（TG）與總膽固醇（TC）水平，并觀察肝組織形態(tài)，最后檢測(cè)糖脂代謝途徑相關(guān)蛋白（IRS、Akt）的表達(dá)狀況。結(jié)果表明：MXP可以降低肝組織中TG和TC水平，并能明顯抑制肝細(xì)胞損傷，其中100 mg/kg組效果較好；更為重要的是MXP可以顯著提高IR和IRS的表達(dá)，改善糖脂代謝信號(hào)通路。

小金海棠；多酚；高脂

‘小金海棠’（Malus xiaojinensis）是中國(guó)自主篩選出的第一個(gè)抗缺鐵黃葉病的蘋(píng)果品種，已在國(guó)內(nèi)廣泛種植［1］。其果實(shí)含豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，特別是多酚類物質(zhì)可達(dá)0.9%左右，包括蘆丁、原兒茶酸以及少量對(duì)香豆酸和阿魏酸等［2］。研究顯示，植物多酚類物質(zhì)具有超強(qiáng)的抗氧化活性和自由基清除能力，在降血糖、降血脂、保護(hù)心腦血管、護(hù)肝、抗癌等方面有一定的作用［3-6］。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開(kāi)展了很多有關(guān)植物多酚的提取研究，但對(duì)于‘小金海棠’提取物活性及功能的研究少見(jiàn)。本試驗(yàn)根據(jù)‘小金海棠’多酚的藥理作用特性，研究其對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肝組織的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討，以期為其作為功能性保健品開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5周齡SPF級(jí)雄性KM小鼠，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司。

‘小金海棠’多酚（Malus xiaojinensis Polyphenols，MXP）采用乙醇提取，大孔樹(shù)脂純化，純度＞90%。

甘油三酯（TG）檢測(cè)試劑盒、總膽固醇（TC）檢測(cè)試劑盒及總RNA提取試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；First Strand cDNA Synthesis Kit及All-in-OneTMqPCRMix購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司；蘇木素伊紅染色試劑盒（HE試劑盒）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5430 R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó) Eppendorf；DK-S22型電熱恒溫水鍋 Electric Water Bath；Infinite F200/M200型酶標(biāo)儀，TECAN公司；ABI 7500定量PCR儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；組織切片機(jī)，德國(guó)Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物處理

小鼠經(jīng)1周適應(yīng)期后，隨機(jī)分成試驗(yàn)組與對(duì)照組。對(duì)照組飼喂正常飼料（NFD），試驗(yàn)組飼喂高脂飼料（HFD）。試驗(yàn)組分為3個(gè)小組，小鼠每天分別進(jìn)行相應(yīng)的灌胃處理，即HFD組（生理鹽水）、低劑量組（HFD+50 mg/kg MXP）和高劑量組（HFD+100 mg/kg MXP）。每周定時(shí)稱量小鼠體重一次，并觀察其活動(dòng)及精神狀態(tài)，7周后，眼球采血，處死后摘取肝臟［7］。飼料成分如表1。

表1 正常飲食和高脂飲食配方Table 1 The formula of normal diet and high-fat diet %

1.3.2 肝組織TG與TC水平檢測(cè)

取肝組織1 g，加入9mL生理鹽水，制成勻漿。按照試劑盒操作方法測(cè)定肝組織TG（甘油三酯）與TC（總膽固醇）含量。

1.3.3 HE染色

取小鼠肝臟用福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗，蘇木素染色5 min，自來(lái)水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，自來(lái)水浸泡15 min，置伊紅液2 min，常規(guī)脫水、透明、封片，用顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4 Western Blotting免疫印跡法［8］

定量稱取肝組織于小管中剪碎，加入細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min，于4℃、13 500 r/min離心15 min，上清液即為肝組織總蛋白。12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并用以下抗體進(jìn)行免疫印跡：anti-IRS、anti-Akt及 anti-β-actin（Bio Basic Inc.，加拿大）。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差格式。采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為5%差異顯著，P＜0.01為1%差異顯著，P＜0.001為1‰差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘小金海棠’多酚（MXP）對(duì)小鼠肝脂指標(biāo)的影響

如圖1所示，肝組織中TG與TC含量為試驗(yàn)組（HFD+MXP）低于對(duì)照組（NFD）。隨著MXP的加入，TG與TC含量呈下降趨勢(shì)，且隨著劑量的增加效果越明顯，其中100 mg/L MXP組小鼠肝中TG水平顯著（P＜0.001）低于NFD組。

2.2 ‘小金海棠’多酚（MXP）對(duì)小鼠肝臟中炎癥因子表達(dá)的影響

肝組織病理學(xué)觀察是評(píng)價(jià)肝組織形態(tài)和組織學(xué)的重要指標(biāo)。如圖2所示，顯微鏡下（16×40倍）觀察到對(duì)照組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)排列整齊，中心靜脈的大小正常，肝細(xì)胞形態(tài)清晰，膜完整。長(zhǎng)期高脂飲食（HFD）則造成大量肝細(xì)胞脂肪累積變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞排列層次紊亂且細(xì)胞膜受到損壞。MXP（50 mg/kg、100 mg/kg）補(bǔ)充明顯逆轉(zhuǎn)了上述高脂飲食導(dǎo)致的不利變化，且100 mg/kg劑量的效果更佳。

圖1 ‘小金海棠’多酚（MXP）對(duì)小鼠肝組織中TG與TC水平的影響Fig.1 Effect of MXP on the level of TG and TC in liver tissues ofm ice

圖2 小金海棠多酚（MXP）對(duì)小鼠肝組織病理的影響Fig.2 Effect of MXP on liver pathology in m ice

2.3 ‘小金海棠’多酚（MXP）對(duì)小鼠糖脂代謝通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

胰島素受體底物（IRS）與蛋白激酶B（Akt）是體內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵蛋白，直接調(diào)控著細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收和利用，間接調(diào)控著脂肪的代謝［9-10］。以β-actin內(nèi)參抗體作為Western Blotting內(nèi)部參照指數(shù)。如圖3所示，對(duì)照組（NFD）的IRS與Akt表達(dá)量明顯高于高脂飲食組（HFD），在經(jīng)過(guò)7周的MXP灌胃后，二者在HFD組的表達(dá)量明顯得到提升。試驗(yàn)結(jié)果顯示，MXP能明顯改善糖脂代謝信號(hào)通路。

圖3 ‘小金海棠’多酚（MXP）對(duì)小鼠肝組織糖脂代謝通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of MXP on the glycolipid metabolic pathway related protein in liver tissue ofm ice

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在對(duì)小鼠進(jìn)行高脂飼料飼喂的同時(shí)，又對(duì)其進(jìn)行MXP灌胃7周，相比于只進(jìn)行高脂飼料飼喂的小鼠，肝組織中TG、TC水平明顯下降，可能正是因?yàn)镸XP可以降低肝組織中TG的水平，從而降低了血脂水平。顯微鏡觀察結(jié)果表明，MXP處理還能顯著降低高脂飲食引起的肝組織炎癥水平升高，肝臟作為機(jī)體的主要代謝器官，其炎性細(xì)胞因子的過(guò)度累積會(huì)造成肝細(xì)胞損傷引起代謝功能障礙，從而導(dǎo)致脂肪過(guò)度生成［11-13］。試驗(yàn)表明，‘小金海棠’多酚能降低肝臟的炎癥水平，改善肝細(xì)胞的生存微環(huán)境，從而起到護(hù)肝的作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)血脂平衡，許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究也證實(shí)了這點(diǎn)［14-15］。IRS與Akt是糖脂代謝信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，研究表明肝臟中缺失IRS與Akt會(huì)造成胰島素耐受，并會(huì)喪失對(duì)高糖高脂飲食的反應(yīng)，使肝臟“認(rèn)為”機(jī)體處于禁食狀態(tài)，作為響應(yīng)，肝臟會(huì)繼續(xù)生成葡萄糖從而為細(xì)胞持續(xù)供給富能分子，致使脂質(zhì)過(guò)度積累［16-18］。MXP對(duì)于這種狀況有著良好的改善作用，可為解決胰島素耐受提供新的思路。

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Effects of Malus xiaojinensis polyphenols on high fat liver tissue ofmouse

WANG Peng，WEIYue-ping

（Agricultural College，Eastern Liaoning University，Dandong118003，China）

Hyperlipemia mice model was established by feeding high-fat diet and MXP gavage administration（50 mg/kg and 100 mg/kg）were treated tomice for 7 weeks.The levels of triglyceride（TG）and total cholesterol（TC）in liver tissue were detected，and themorphology of liver tissueswas observed.Finally，the expression of related proteins（IRS，Akt）in the pathway of glucose and lipidmetabolism was detected.The results showed that MXP could reduce the level of TG and TC in liver tissue and inhibit the injury of liver cells obviously.The effect of 100 mg/kg group was better.More importantly，MXP could significantly improve the expression of IR and IRS and improve the signaling pathway of glycolipid metabolism.

Malus xiaojinensis；Polyphenols；Hyperlipidemia

2016-06-21

遼東學(xué)院青年基金項(xiàng)目（2016QN029）“小金海棠多酚對(duì)肝臟功能的改善及機(jī)制研究”

王鵬（1970—），男，碩士，副教授，研究方向：植物次生物提取。E-mail：58993698＠qq.com，Tel：18242588906 13342171866

R282.71

A

1000-3924（2017）06-053-04

閆其濤）