鄭廣翔 李新穎 羅 民 徐 淼 (長春市第六醫(yī)院精神科，吉林 長春 005)

老齡慢性酒精中毒大鼠模型大腦中動脈力學(xué)特性

鄭廣翔 李新穎1羅 民2徐 淼3(長春市第六醫(yī)院精神科，吉林 長春 130052)

目的探討正常與老齡慢性酒精中毒大鼠大腦中動脈的力學(xué)特性。方法建立老齡慢性酒精中毒大鼠模型，隨機分為模型組與對照組，建模第55天起對各組大鼠進(jìn)行Morris 水迷宮實驗，取兩組大鼠大腦中動脈進(jìn)行拉伸實驗，將兩組大鼠斷頭后快速取腦，漂洗，將額區(qū)皮質(zhì)分離后以生理鹽水為介質(zhì)，腦組織與生理鹽水重量體積比為9∶1，制成10%腦組織勻漿液，離心后取上清液0.2 ml加入試管，測量丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和金屬硫蛋白(MT)含量。結(jié)果模型組各時間點逃避潛伏期值顯著大于對照組(P<0.05)。模型組SOD和MT含量顯著小于對照組，MDA含量顯著大于對照組(均P<0.05)。模型組大鼠大腦中動脈彈性限度應(yīng)變、彈性限度應(yīng)力、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變均顯著小于對照組，彈性模量顯著大于對照組(均P<0.05)。結(jié)論老齡慢性酒精中毒大鼠模型大腦中動脈力學(xué)特性發(fā)生了改變。

慢性酒精中毒；力學(xué)特性

酒精中毒是引起腦組織損傷、腦血管病變的因素之一，王念等〔1〕研究表明，慢性酒精中毒患者有不同程度腦萎縮、腦梗死、腦白質(zhì)脫髓鞘、胼胝體變性、韋尼克腦病等。研究表明，胎兒臍靜脈和大腦中動脈應(yīng)力-應(yīng)變變化規(guī)律具有相似性〔2〕。于波等〔3〕研究表明，動脈粥樣硬化模型大鼠大腦中動脈的力學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變。國內(nèi)外對酒精中毒后引起腦血管病變相關(guān)機制已經(jīng)有了一定的報道〔4～7〕。本文旨在探討老齡慢性酒精中毒模型大腦中動脈的生物力學(xué)特性。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗大鼠 健康雄性清潔級10月齡SD大鼠40只，隨機分為對照組、模型組各20只，體重245～248 g，由長春高新醫(yī)學(xué)動物實驗研究中心提供〔許可證號：SCXK-(吉)：2003-0004〕。SPF級動物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度22℃～24℃，濕度56%～61%。按參考文獻(xiàn)〔8〕的方法建立老齡慢性酒中毒大鼠模型：第1、2、3周對大鼠分別以酒精濃度為5%(V/V)、10%(V/V)、20%(V/V)，第4～8周以35%(V/V)濃度(乙醇3.50 g·kg-1·d-1)灌胃；對照組大鼠灌同等體積的生理鹽水10 ml·kg-1·d-1。

1.1.2儀器、試劑和實驗裝備 Morris水迷宮(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、金屬硫蛋白(MT)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；KDC 40 離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。Morris水迷宮為深25 cm、高50 cm、直徑160 cm的圓形水池，水池的內(nèi)壁均為黑顏色，水池內(nèi)水溫為(22±2)℃，以等距離點將水池分為4個象限，設(shè)第3象限為目標(biāo)象限，在距離水池壁35 cm、直徑12 cm處放有高23 cm黑色的圓形站臺，站臺位于水面下2 cm。在水迷宮池壁內(nèi)側(cè)貼著不同形狀的標(biāo)志物。將攝像機連接水迷宮實驗裝備。拉伸實驗設(shè)備為長春試驗機研究所集團(tuán)生產(chǎn)的電子萬能試驗機(長春，吉林省，中國)，試驗機配有溫控儀和環(huán)境溫箱，根據(jù)需要可進(jìn)行實驗溫度設(shè)定。以長春市第三器廠生產(chǎn)的CCs-3型讀數(shù)顯微鏡(長春，吉林省，中國)測量各組大鼠大腦中動脈試樣的幾何尺寸。

1.2方法

1.2.1大鼠水迷宮實驗方法 于建模第8周起對大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實驗，實驗前1 d兩組大鼠在水池自由游泳2 min，以適應(yīng)實驗環(huán)境，第2天正式實驗：將大鼠置于站臺上適應(yīng)10 s后隨機將大鼠從不同象限面壁放于池內(nèi)，大鼠登上站臺5 s后終止記錄，記錄時間最長120 s，如果大鼠在120 s內(nèi)不能上臺，引導(dǎo)大鼠登上站臺適應(yīng)10 s，完成后將大鼠放入鼠籠中。每天將大鼠置入池內(nèi)4次，每次時間間隔60 min，大鼠定位航行訓(xùn)練4 d，測量平臺逃避潛伏期次數(shù)，以此來判定大鼠的空間記憶能力。

1.2.2大鼠大腦中動脈試樣取樣 于建模60 d后，水分氯醛(0.3 ml/100 g)以腹腔注射的方法麻醉大鼠后開顱，在ZC-x-6A手術(shù)顯微鏡下(鎮(zhèn)江市卓創(chuàng)醫(yī)療科技有限公司)找到大鼠大腦中動脈，以無菌塑柄手術(shù)刀(浙江省遂昌雙劍醫(yī)療器械有限公司)切取各組大鼠大腦中動脈，每組20個大腦中動脈標(biāo)本，將標(biāo)本放置生理鹽水槽中。實驗前以無菌塑柄手術(shù)刀切取兩組大鼠大腦中動脈試樣，每組20個，試樣長12 mm。

1.2.3兩組大鼠腦組織勻漿加工制作 兩組大鼠大腦中動脈試樣切取完后，大鼠頭切斷后取腦，漂洗，分離額區(qū)皮質(zhì)后，以生理鹽水為介質(zhì)，生理鹽水重量與腦組織重量體積比為9∶1，制成10%腦組織勻漿液，3 500 r/min離心20 min，分別取各組上清液0.2 ml加入試管，待測量SOD、MDA、MT含量。按MT試劑盒操作說明，采用硫代巴比妥酸比色法測定MT含量。按SOD試劑盒操作說明，以日本東京日立公司U3410分光光度儀采用黃嘌呤氧化酶(XO)法測定SOD含量。按MDA試劑盒操作說明，采用硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量；大鼠腦組織勻漿中MDA含量=(測定管吸光度-測定空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol/ml)×樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.2.4兩組大鼠大腦中動脈單向拉伸實驗 模型組大鼠大腦中動脈試樣直徑0.99～1.03 mm、對照組1.02～1.05 mm，設(shè)定拉伸實驗溫度為36.5℃±1℃。按參考文獻(xiàn)〔4～6〕的方法對兩組大鼠大腦中動脈試樣進(jìn)行處理預(yù)調(diào)。分別將每個處理預(yù)調(diào)后的兩組大腦中動脈試樣裝夾于萬能拉伸試驗機的夾具內(nèi)，以1.5 mm/min的實驗速度對大腦中動脈試樣進(jìn)行一維拉伸實驗。實驗中向試樣不斷地噴灑生理鹽水。實驗結(jié)束后，計算機自動輸出試樣的彈性模量、彈性限度應(yīng)變、最大應(yīng)變、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變、應(yīng)力-應(yīng)變曲線。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SSPS13.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組大鼠水迷宮實驗比較 模型組各時間點每天1次、每天4次航行測試的逃避潛伏期顯著大于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組每天1次、4次行形測試的逃避潛伏期比較

與對照組比較：1)P<0.05，下表同

2.2兩組MDA、SOD、MT含量比較 對照組SOD和MT含量大于模型組，MDA含量顯著小于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組MDA、SOD、MT 含量比較

2.3兩組大鼠大腦中動脈試樣拉伸實驗結(jié)果 模型組大腦中動脈彈性限度應(yīng)變、最大應(yīng)變、彈性限度應(yīng)力、最大應(yīng)力顯著小于對照組，彈性模量值顯著大于對照組(P<0.05)。見表3。兩組大鼠大腦中動脈應(yīng)力-應(yīng)變曲線見圖1。分別建立兩組大鼠大腦中動脈試樣的應(yīng)力-應(yīng)變函數(shù)關(guān)系表達(dá)式，對照組大腦中動脈=-0.000 0e5 +0.000 2e4 +0.013 0e3+ 30.268 8e2 +2.760 3e；模型大鼠組大腦中動脈=-0.000 0e5 +0.000 1e4 +0.014e3+0.551 0e2 +1.010 3e。

表3 兩組大鼠大腦中動脈試樣拉伸結(jié)果比較

圖1 兩組大鼠大腦中動脈應(yīng)力-應(yīng)變曲線

3 討 論

本研究結(jié)果表明，大鼠酒精中毒后使腦組織缺血、缺氧，從而引起腦組織自由基釋放，造成SOD值下降，MDA值上升。MT是一種高效的自由基清除劑，對氧化應(yīng)激狀態(tài)下機體細(xì)胞、組織的保護(hù)具有重要作用；MT可直接捕獲多種活性氮和自由基，起到清除自由基的作用等〔7〕。酒精在體內(nèi)代謝后會產(chǎn)生大量自由基，并通過氧化應(yīng)激反應(yīng)引起神經(jīng)細(xì)胞損傷，MT作為一種具有高效保護(hù)性蛋白，發(fā)揮重要的抗氧化作用。本研究結(jié)果說明，長期的酒精攝入會使動物腦組織內(nèi)MT含量發(fā)生變化，腦組織清除自由基的能力下降。酒精中毒使大鼠腦組織受到損傷后造成氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能是慢性酒精中毒性腦損害的發(fā)病機制之一；長期大量酒精攝入可導(dǎo)致動物腦組織中氧自由基的產(chǎn)生與清除失衡，從而導(dǎo)致腦組織損傷，氧化應(yīng)激可能是慢性酒精腦損害的中間環(huán)節(jié)或始動因素，對慢性酒精中毒患者要盡早進(jìn)行抗氧化治療，中斷氧化應(yīng)激反應(yīng)的惡性循環(huán)，使氧自由基的平衡狀態(tài)得到恢復(fù)，起到更好地保護(hù)腦組織的效果〔8〕。

本文以數(shù)學(xué)統(tǒng)計學(xué)模型驗證應(yīng)力應(yīng)變實驗數(shù)據(jù)，能更好地闡明慢性酒精中毒模型和對照組大鼠大腦中動脈的拉伸力學(xué)性質(zhì)，為慢性酒精中毒造成坐骨神經(jīng)損傷的發(fā)病機制提供生物力學(xué)方面的理論依據(jù)。

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R595.6

A

1005-9202(2017)24-6049-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.019

吉林省科技發(fā)展計劃資助項目(No.20110492)

1 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院超聲科 2 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院疼痛科

3 長春市第六醫(yī)院司法鑒定科

徐 淼(1976-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事精神司法鑒定與生物醫(yī)學(xué)工程研究。

鄭廣翔(1975-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事精神科臨床與生物醫(yī)學(xué)工程研究。

〔2017-05-26修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)