郭 鵬 趙曉暉 楊萬(wàn)國(guó) 姜 靜 王振江 孫 英 劉艷波

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院腎病風(fēng)濕病科，吉林 吉林 132012)

白細(xì)胞介素-17A及其受體在前列腺癌中的表達(dá)及意義

郭 鵬 趙曉暉1楊萬(wàn)國(guó)1姜 靜 王振江1孫 英1劉艷波1

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院腎病風(fēng)濕病科，吉林 吉林 132012)

目的探討白細(xì)胞介素(IL)-17A及其受體IL-17RA在前列腺癌(Pca)組織中的表達(dá)及意義。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法分別檢測(cè)6例正常前列腺(NP)、39例良性前列腺增生(BPH)和20例Pca標(biāo)本中IL-17A、IL-17RA表達(dá)情況；炎癥細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞)浸潤(rùn)情況。結(jié)果IL-17A主要表達(dá)于腺上皮，單個(gè)核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，也可見部分癌細(xì)胞內(nèi)，在NP、BPH及Pca陽(yáng)性表達(dá)率分別為為3.77%±0.04%、5.58%±0.15%、8.82%±0.06%，Pca與BPH和NP比較有明顯差異(P<0.05)；IL-17RA主要表達(dá)于腺上皮，單個(gè)核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，也可見部分癌細(xì)胞，在NP，BPH及Pca表達(dá)率陽(yáng)性分別為3.36%±0.20%、4.12%±0.17%、8.29%±0.21%，Pca與BPH和NP比較表達(dá)明顯增加(P<0.05)。淋巴細(xì)胞在NP，BPH和Pca中的陽(yáng)性表達(dá)密度分別為(1.40±0.01)個(gè)/mm2、(4.11±0.03)個(gè)/mm2、(4.12±0.05)個(gè)/mm2，Pca和BPH與NP比較差異明顯(P<0.05)；巨噬細(xì)胞在NP，BPH和Pca的陽(yáng)性表達(dá)密度分別為(1.25±0.13)、(6.82±0.04)、(4.71±0.02)個(gè)/mm2，Pca和PH與NP比較差異明顯(P<0.05)；肥大細(xì)胞在NP，BPH和Pca中的陽(yáng)性表達(dá)密度分別為(1.01±0.03)、(7.21±0.01)、(7.35±0.01)個(gè)/mm2，Pca和BPH與NP比較差異明顯(P<0.05)；中性粒細(xì)胞在NP，BPH和Pca的陽(yáng)性表達(dá)密度分別為(0.72±0.01)、(4.73±0.08)、(4.42±0.01)個(gè)/mm2，Pca與BPH和NP比較差異明顯(P<0.05)。BPH組織中IL-17A陽(yáng)性表達(dá)與IL-17RA呈正相關(guān)(r=0.368，P=0.025)；Pca組織中IL-17RA陽(yáng)性表達(dá)與肥大細(xì)胞陽(yáng)性密度呈正相關(guān)(r=0.523，P=0.021)。結(jié)論IL-17A與IL-17RA在Pca中表達(dá)明顯增加，IL-17RA可能主要由肥大細(xì)胞分泌，與Pca的發(fā)病密切相關(guān)；而IL-17A與IL-17RA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在BPH發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

白細(xì)胞介素-17A；白細(xì)胞介素-17RA；前列腺癌；前列腺增生；炎癥細(xì)胞

前列腺癌(Pca)是中老年男性最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)達(dá)國(guó)家Pca的發(fā)病率僅次于肺癌，由于飲食習(xí)慣不斷變化，我國(guó)Pca的發(fā)病率也顯著增加。隨著腫瘤免疫學(xué)快速發(fā)展，探討Pca微環(huán)境中炎癥細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子的變化對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等影響，是Pca研究主要方向之一。白細(xì)胞介素(IL)-17A是最新發(fā)現(xiàn)的一類促炎細(xì)胞因子，主要由Th17細(xì)胞分泌，此外，巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等也可分泌，存在于多種炎癥相關(guān)性腫瘤患者體內(nèi)〔1〕。IL-17A受體IL-17RA也主要由Th17細(xì)胞分泌，IL-17A與IL-17RA結(jié)合，通過(guò)一定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程影響其下游基因的表達(dá)，然而在Pca中作用仍不明確。本研究對(duì)比IL-17A、IL-17RA、炎癥細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)在正常前列腺(NP)、良性前列腺增生(BPH)和Pca組織中的表達(dá)差異，分析IL-17A、IL-17RA與Pca發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 本研究所用標(biāo)本來(lái)自吉林大學(xué)前列腺癌防治研究中心、北華大學(xué)附屬醫(yī)院、吉林市人民醫(yī)院。NP 6例，年齡(55±12.4)歲，經(jīng)直腸前列腺穿刺活檢獲得；BPH 39例，年齡(61±21.3)歲，前列腺穿刺活檢或術(shù)中取樣獲得；Pca 20例，年齡(58±18.8)歲，前列腺穿刺或手術(shù)獲得。所有患者本人知情，有明確病理診斷，符合倫理學(xué)要求。

1.2主要儀器設(shè)備 顯微鏡(奧林巴斯公司)，軟件處理圖像系統(tǒng)(Image pro plus)，電子天平(上海圣科儀器有限公司，F(xiàn)A1004B)，磁力攪拌器(上海一科儀器有限公司，CL-1A)，酸度計(jì)(杭州聯(lián)測(cè)自動(dòng)化技術(shù)有限公司，LR-PH-S25)，移液器(德國(guó)eppendorf)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(長(zhǎng)沙市秋龍儀器設(shè)備有限公司)，滅菌鍋(廣州康邁醫(yī)療器械有限公司，YX-280A-24L)，臺(tái)式低速離心機(jī)(湘儀集團(tuán)，L400)等。

1.3主要試劑 抗IL-17A(美國(guó))、IL-17RA(Abcam香港)、CD3(Abcam香港)、CD68(Santa Cruz)、中性粒細(xì)胞(Abcam香港)、肥大細(xì)胞(Abcam美國(guó))抗體的稀釋濃度分別為1∶100,1∶400,1∶20,1∶400,1∶800,1∶2 000。二抗為北京中杉金橋試劑公司提供的通用型PV9000試劑盒和抗山羊PV9003試劑盒，二胺基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液由北京中杉金橋試劑公司生產(chǎn)，其他均為進(jìn)口及國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.4主要方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行染色，其主要步驟為：標(biāo)本常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，每次3 min，蒸餾水沖洗兩次后待用；利用高溫高壓法進(jìn)行抗原修復(fù)(修復(fù)液為pH6.0的0.01 mol/L檸檬酸緩沖液)，冷卻至室溫后PBS漂洗3次；1%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：滴加一抗常溫孵育過(guò)夜，PBS漂洗3次，每次3 min；滴加二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，二抗加5%血清)，常溫孵育30 min，PBS漂洗后DAB顯色，自來(lái)水充分沖洗后，蘇木素輕度復(fù)染，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，干燥，封片。

1.5結(jié)果判斷及處理 當(dāng)棕黃色顆粒高于本底時(shí)定為陽(yáng)性。在200倍顯微鏡下連續(xù)拍攝每一張組織切片，在相同條件下通過(guò)Image-pro plus軟件對(duì)圖片進(jìn)行平均光密度值分析，平均光密度值越大，說(shuō)明組織的染色越強(qiáng)。IL-17A和IL-17RA陽(yáng)性計(jì)算方法為：陽(yáng)性面積占整個(gè)染色切片面積的百分比。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)密度方法計(jì)算方法為：?jiǎn)挝幻娣e(mm2)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Minitab Release 9.2進(jìn)行U檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1IL-17A及IL-17RA在前列腺疾病組織中的表達(dá) IL-17A及IL-17RA陽(yáng)性顆粒呈棕黃色，主要表達(dá)于腺上皮、單個(gè)核細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，也可見部分癌細(xì)胞中，見圖1。Pca組IL-17A、IL-17RA表達(dá)明顯高于BPH組和NP組(P<0.05)，BPH組與NP組無(wú)明顯差異(P>0.05)。見表1。

箭頭表示陽(yáng)性細(xì)胞，下圖同圖1 IL-17A及IL-17RA在前列腺組織中的表達(dá)(DAB，×200)

組別nIL?17AIL?17RAPca組20882±006829±021BPH組39558±0151)412±0171)NP組6377±0041)336±0201)

與Pca組比較：1)P<0.05

2.2各種炎癥細(xì)胞在前列腺疾病組織中的表達(dá) CD3作為淋巴細(xì)胞特異性標(biāo)志物、CD68作為巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物，其陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。CD3表達(dá)情況即可反映淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況，CD68表達(dá)可反映巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在BPH組和Pca組中浸潤(rùn)明顯高于NP組(P<0.05)，Pca組與BPH組無(wú)明顯差異(P>0.05)。肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)亦位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在BPH組和Pca組浸潤(rùn)明顯高于NP組(P<0.05)，Pca組與BPH組無(wú)明顯差異(P >0.05)。見表2，圖2，圖3。

圖2 淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在前列腺組織中表達(dá)(DAB，×200)

圖3 肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在前列腺組織中表達(dá)(DAB，×200)

組別nCD3CD68肥大細(xì)胞中性粒細(xì)胞Pca組20412±0051)471±0021)735±0011)442±0011)BPH組39411±0031)682±0041)721±0011)473±0081)NP組6140±001125±013101±003072±001

與NP組比較：1)P<0.05

2.3不同組織中IL-17A、IL-17RA與炎癥細(xì)胞的相關(guān)性 BPH組織中IL-17A與IL-17RA陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.368，P=0.025)；Pca組織中IL-17RA與肥大細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.523，P=0.021)。

3 討 論

IL-17家族是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種促炎細(xì)胞因子，包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F 6種配體及IL-17RA、IL-17BR、IL-17CR、IL-17DR和IL-17ER等不同的受體〔2〕。目前在腫瘤領(lǐng)域研究較多的為IL-17A及其受體IL-17RA。IL-17A在卵巢癌、乳腺癌、肝癌和胃癌等腫瘤組織中有較高表達(dá)，且預(yù)后不良〔3～5〕，但在Pca發(fā)病機(jī)制中研究較少。

本研究表明IL-17A和IL-17RA主要分布在腺上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和部分癌細(xì)胞，且在Pca中表達(dá)明顯增加，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而慢性炎癥是促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素〔6〕。有研究證實(shí)慢性前列腺炎與Pca呈正相關(guān)〔7〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)前列腺炎癥信號(hào)可以誘導(dǎo)或增強(qiáng)致癌信號(hào)〔8〕。此外，炎癥時(shí)釋放的細(xì)胞活性因子可影響腫瘤周圍微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、血管形成、侵襲和死亡等過(guò)程〔9〕。腫瘤細(xì)胞死亡時(shí)能釋放一些促炎因子(如IL-6)，進(jìn)入周圍微環(huán)境進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞反應(yīng)，炎癥細(xì)胞是IL-17家族的重要來(lái)源，IL-17A通過(guò)stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)腫瘤內(nèi)血管形成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)甚至轉(zhuǎn)移，炎癥過(guò)程中釋放的腫瘤壞死因子(TNF)-α在腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的作用，TNF-α聯(lián)合IL-17A能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)〔10〕。因此，IL-17A與IL-17RA結(jié)合后不同的通路增強(qiáng)炎癥反應(yīng)〔11〕，細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤轉(zhuǎn)移等過(guò)程，呈現(xiàn)惡性循環(huán)過(guò)程。

本研究證實(shí)在BPH及PCa前列腺癌組織內(nèi)，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，說(shuō)明T淋巴細(xì)胞參與前列腺疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其發(fā)生機(jī)制與其激活核因子(NF)-κB通路相關(guān)；巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，腫瘤類型不同其作用也不盡相同，機(jī)制尚未清楚，但巨噬細(xì)胞可增強(qiáng)前列腺基質(zhì)細(xì)胞的增殖〔12〕；肥大細(xì)胞可影響腫瘤的生長(zhǎng)，而中性粒細(xì)胞是氧化應(yīng)激的主要參與者，而氧化應(yīng)激可造成基因突變，進(jìn)而促進(jìn)Pca的發(fā)生〔13〕，此外，活化的Th17細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生和釋放具有生物活性的CXCL型趨化因子對(duì)中性粒細(xì)胞具有直接趨化作用，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展〔14〕。

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12Vykhovanets EV，Maclennan GT，Vykhovanets OV，etal.IL-17 expression by macrophages is associated with proliferative inflammatory atrophy lesions in prostate cancer patients〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2011；4(6)：552-65.

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ExpressionandsignificanceofIL-17A,IL-17RAinprostatecancer

GUOPeng,ZHAOXiao-Hui,YANGWan-Guo,etal.

DepartmentofNephrologyandRheumatology,AffiliatedHospitalofBeihuaUniversity,Jilin132012,Jilin,China

ObjectiveTo explore the expression and significance of IL-17A and IL-17RA in prostate cancer (Pca).MethodsImmunohistochemistry staining was applied to detect IL-17A,IL-17RA and related inflammatory cells in 6 cases of normal prostate (NP) specimens,39 cases of BPH specimens and 20 cases of Pca specimens.ResultsIL -17A mainly expressed glandular epithelium,mononuclear cells and vascular endothelial cells as well as partial cancerous cells. In NP,BPH and Pca its positive expression percentage was 3.77% ±0.04%,5.58%±0.15% and 8.82%±0.06% respectively. Compared with NP and BPH it had obviously increased in Pca (P<0.05).IL-17RA also mainly expressed in glandular epithelium,mononuclear cells,vascular endothelial cells and partial cancer cells. In NP,BPH and Pca its positive expression percentage was 3.36%±0.20%,4.12%±0.17%,8.29±0.21%. Compared with NP and BPH,there was obvious statistical difference in Pca (P<0.05).Lymphocyte distribution density in NP,BPH and Pca was (1.40±0.01) mm-2,(4.11±0.03) mm-2and(4.12±0.05) mm-2respectively,there existed obvious increase in Pca and BPH (P<0.05),while there was no difference between Pca and BPH.Macrophages distribution density in NP,BPH and Pca was (1.25±0.13) mm-2,(6.82±0.04) mm-2and (4.71±0.02) mm-2. In BPH and Pca they increased obviously (P<0.05). Mast cells distribution density in NP,BPH and Pca was (1.01±0.03) mm-2,(7.21±0.01) mm-2and(7.35±0.01) mm-2respectively. In BPH and Pca they accumulated obviously (P<0.05). Neutrophils distribution density in NP,BPH and Pca was (0.72±0.01) mm-2,(4.73±0.08) mm-2and (4.42±0.01)mm-2separately. In Pca it elevated obviously compared with NP and Pca while between BPH and NP there was no obvious difference (P>0.05).In BPH there existed obvious positive correlation between IL-17A and IL-17RA (r=0.368,P=0.025). In Pca obvious positive correlation was found between IL-17RA and mast cells(r=0.523,P=0.021).ConclusionsBoth IL-17A and IL-17RA expression are increased significantly in Pca and IL-17RA mainly is secreted by mast cells,which is related with prognosis of Pca. IL-17A and IL-17RA participate in BPH occurrence and development. Both IL-17A and IL-17RA participate in the occurrence and development in BPH and Pca.

IL-17A;IL-17RA;Prostate cancer;Benign prostatic hyperplasia;Inflammatory cells

R737.25

A

1005-9202(2017)24-6008-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.002

國(guó)家自然科學(xué)基金(81302226)；吉林省科技廳資助項(xiàng)目(20130101164JC，20140414059GH)；吉林省教育廳科研資助項(xiàng)目(20132070，2014200，2015129)

1 北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床免疫研究中心

劉艷波(1974-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事前列腺癌發(fā)病機(jī)制研究。

郭 鵬(1968-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事前列腺癌發(fā)病機(jī)制研究。

〔2017-06-18修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)