唐 芳 馬武開 陳玉婷 姚血明 黃 穎 徐 暉 黃 昆

(貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，貴州 貴陽 550001)

·基礎(chǔ)研究·

三氧化二砷對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的抗炎作用

唐 芳 馬武開 陳玉婷 姚血明 黃 穎 徐 暉 黃 昆

(貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，貴州 貴陽 550001)

目的探討三氧化二砷(AS2O3)對牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β 水平的影響。方法將60只健康清潔級Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、雷公藤對照組及AS2O3低、中、高劑量組，每組10只。除空白對照組外，其余各組建立CIA模型，觀察AS2O3對CIA 大鼠關(guān)節(jié)病理、關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化及對TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響。結(jié)果AS2O3能夠抑制CIA 大鼠關(guān)節(jié)腫脹，降低血清TNF-α、IL-1β水平，減輕關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生、滑膜層及滑膜下層淋巴細(xì)胞浸潤，其中低、中劑量組療效與雷公藤對照組相當(dāng)(P>0.05)，高劑量組優(yōu)于雷公藤組(P<0.01)。結(jié)論AS2O3能減輕CIA 大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度及關(guān)節(jié)滑膜淋巴細(xì)胞浸潤，下調(diào)CIA 大鼠血清致炎因子TNF-α、IL-1β 的表達(dá)。

三氧化二砷；誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-1β

目前研究已經(jīng)證實(shí)腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、-6等細(xì)胞因子是造成類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者長期關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)及關(guān)節(jié)破壞的主要致炎因子，滑膜細(xì)胞中的TNF-α、IL-1β及IL-6等致炎因子通過一系列級聯(lián)反應(yīng)，最終激活低化β激酶(IKK)復(fù)合體，釋放核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號，從而調(diào)控各種炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)，促進(jìn)RA的發(fā)生和發(fā)展〔1，2〕。TNF-α與IL-1β在滑膜細(xì)胞的表達(dá)與NF-κB具有一致性〔3〕。因此，控制NF-κB途徑的非正常激活，下調(diào)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，成為RA治療的新途徑與切入點(diǎn)。RA屬祖國醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，傳統(tǒng)中醫(yī)藥可通過多途徑、多層次、多靶點(diǎn)地作用于人體而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用〔4〕。在三氧化二砷(AS2O3)抗腫瘤的研究中，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制血管增生是其主要作用機(jī)制，RA病理特征為關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞過度增殖和血管增生，類似于惡性腫瘤的發(fā)病特點(diǎn)。本課題旨在探討AS2O3對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)模型大鼠關(guān)節(jié)炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及條件 清潔健康Wistar大鼠60只，雌雄各半(分籠飼養(yǎng))，體重(170±15)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001。喂養(yǎng)飼料來源：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。Wistar大鼠進(jìn)行1 w的適應(yīng)期喂養(yǎng)，然后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑及藥品 牛Ⅱ型膠原(Collagen Type Ⅱ，批號：C7806)，弗氏完全佐劑(FCA，批號：F5881，美國Sigma公司)，TNF-α、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(武漢華美生物工程公司，批號：CSB-E11987r、CSB-E08055r)，注射用AS2O3(哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)公司，國藥準(zhǔn)字：H20080665)；雷公藤多苷片(貴州漢方藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字：Z52020369)。

1.3儀器 電熱恒溫水浴鍋(HW-SY11-K P2，北京市長風(fēng)儀器公司)、垂直電泳槽(DYCZ-24DN，北京六一儀器廠)、冷凍離心機(jī)(LDZ5-2型,北京離心機(jī)廠)、電轉(zhuǎn)儀(DYCZ-40，北京市六一儀器廠)。

1.4模型復(fù)制 參照文獻(xiàn)方法〔5〕，建立CIA模型，造模前將膠原溶液與FCA等體積混合、乳化。將混懸乳劑0.4 ml注射于大鼠右后足跖肉墊皮內(nèi)致炎，第8天以相同乳劑和劑量于大鼠尾根部加強(qiáng)注射?？瞻讓φ战M不予任何處理。

1.5分組及給藥 將60只健康清潔級Wistar 大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、雷公藤對照組及AS2O3低、中、高劑量組，每組10只。大鼠用藥劑量根據(jù)人與大鼠體質(zhì)量換算，雷公藤對照組每次6.25 mg/kg，1次/d灌胃給藥，AS2O3低、中、高劑量組每日給藥量分別為0.5、1.0、2.0 mg/kg，于造模第1天開始給藥，每周1次腹腔注射；其余各組大鼠灌胃給藥，空白對照組和模型對照組給予等體積生理鹽水灌胃。給藥 28 d 后，斷頭處死大鼠采血，離心取血清用于細(xì)胞因子活性測定，分離關(guān)節(jié)滑膜組織觀察病理學(xué)形態(tài)改變。

1.6觀察指標(biāo)

1.6.1一般情況觀察 分別觀察各組大鼠在造模、治療前后毛色、反應(yīng)速度、精神狀態(tài)、進(jìn)食情況、關(guān)節(jié)腫脹情況及排泄物等變化。

1.6.2關(guān)節(jié)腫脹度 用游標(biāo)卡尺測量大鼠左后肢踝關(guān)節(jié)的直徑(mm)，每周測1次。以第1天測得的值為基值，之后測得的值與基值的差值即為關(guān)節(jié)腫脹度。

1.6.3關(guān)節(jié)病理觀察 麻醉處死大鼠后，每組隨機(jī)選取2只大鼠，取右后踝關(guān)節(jié)與滑膜組織長約2 cm制作標(biāo)本，經(jīng)中性甲醛固定，硝酸脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色。光鏡下觀察滑膜細(xì)胞和血管的增生，淋巴細(xì)胞浸潤及軟骨的增生、破壞等情況。

1.6.4ELISA檢測血清中IL-1β、TNF-α表達(dá) ELISA試劑盒置于4℃冰箱中保存，使用前室溫平衡30 min，嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行操作，最后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)曲線方程計(jì)算各樣本的濃度。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件，符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般情況觀察 空白對照組大鼠活動正常，毛色光澤，正常進(jìn)食與飲水，體重逐漸增加，對各項(xiàng)刺激反應(yīng)靈敏。模型對照組大鼠于造模12 h后開始出現(xiàn)踝膝關(guān)節(jié)腫脹，攝食減少；各給藥組部分大鼠于造模第4天開始出現(xiàn)踝膝關(guān)節(jié)輕度腫脹，攝食減少；第8天所有大鼠均出現(xiàn)明顯踝膝關(guān)節(jié)腫脹，甚者出現(xiàn)四肢關(guān)節(jié)腫脹，足部皮膚皸裂，跛行，毛色暗淡，活動受限，進(jìn)食減少，便質(zhì)變稀、不成形，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍。經(jīng)4 w治療后，各給藥組上述情況均有所好轉(zhuǎn)，模型對照組改善不明顯，模型對照組少數(shù)大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形。實(shí)驗(yàn)過程中，各組大鼠無死亡，可能與良好的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境有關(guān)。

2.2各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度比較 治療前各造模組關(guān)節(jié)腫脹度與空白對照組同一時(shí)間點(diǎn)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后1 w模型對照組關(guān)節(jié)腫脹度開始上升，治療后2 w達(dá)到高峰，治療后3～4 w逐漸下降，各時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)腫脹度與空白對照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。治療后1～4 w：各治療組關(guān)節(jié)腫脹度逐漸下降，各時(shí)間點(diǎn)與模型對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01或P<0.05)；AS2O3低、中劑量組與雷公藤對照組相比，關(guān)節(jié)腫脹度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AS2O3高劑量組與雷公藤對照組相比關(guān)節(jié)腫脹度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01或P<0.05)。見表1。

2.3滑膜組織病理學(xué)形態(tài)改變 空白對照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜未見炎性細(xì)胞浸潤及纖維組織增生；模型對照組滑膜組織見大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及較多中性粒細(xì)胞浸潤，并見關(guān)節(jié)軟骨破壞及關(guān)節(jié)內(nèi)纖維組織增生；雷公藤對照組滑膜組織局部見較多淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤；AS2O3低劑量組滑膜組織見較多淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及較多中性粒細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)腔內(nèi)見炎性滲出物；AS2O3中劑量組部分滑膜組織見少量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤；AS2O3高劑量組近關(guān)節(jié)腔的滑膜結(jié)構(gòu)較正常，其他滑膜組織內(nèi)可見少量淋巴細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.4ELISA檢測IL-1β及TNF-α水平 與空白對照組相比，模型對照組IL-1β、TNF-α的表達(dá)升高(P<0.01)；與模型對照組相比，各治療組IL-1β、TNF-α的表達(dá)均有不同程度下降(P<0.01)；與雷公藤對照組相比，AS2O3低、中劑量組IL-1β及TNF-α水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，AS2O3高劑量組IL-1β及TNF-α水平優(yōu)于雷公藤對照組(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠治療前后關(guān)節(jié)腫脹度比較

與空白對照組同一時(shí)間點(diǎn)相比：1)P<0.01；與模型對照組同一時(shí)間點(diǎn)相比：2)P<0.01，3)P<0.05；與雷公藤對照組同一時(shí)間點(diǎn)相比：4)P<0.01，5)P<0.05；下表同

圖1 各組滑膜組織病理學(xué)改變(×40)

組別IL?1βTNF?α空白對照組10478±4465218±202模型對照組19364±5951)9745±3141)雷公藤對照組13395±4442)7127±3112)AS2O3低劑量組13598±4672)7354±3402)AS2O3中劑量組12913±4852)6826±3252)AS2O3高劑量組11233±4552)5)5838±3632)5)

3 討 論

RA是一種以對稱性、多關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的自身免疫性疾病。NF-κB 是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的重要調(diào)節(jié)蛋白，在哺乳動物細(xì)胞中最常見的是NF-κB p65與p50結(jié)合形成p65/p50二聚體。在靜息狀態(tài)下，胞質(zhì)中NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合形成復(fù)合體，并覆蓋了NF-κB的核定位信號，使NF-κB錨定于胞質(zhì)中，不能發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。IκB亞基IκBα與NF-κB二聚體上的兩個(gè)核定位序列中的一個(gè)結(jié)構(gòu)結(jié)合，使得非活性狀態(tài)的NF-κB-IκBα能夠進(jìn)入細(xì)胞核；同時(shí)，IκBα蛋白氨基末端的出核信號能夠使NF-κB-IκBα復(fù)合物移出細(xì)胞核，NF-κB-IκBα復(fù)合物在核內(nèi)與核外處于動態(tài)平衡中。正常情況下，胞核中檢測不到NF-κB-IκBα復(fù)合物是因?yàn)槌龊诉^程比入核過程效率高〔6〕。由于IκBα啟動子上有一個(gè)NF-κB反應(yīng)元件，對刺激比較敏感，能夠快速被降解與再合成〔7〕，當(dāng)細(xì)胞受到TNF-α、IL-1β、T細(xì)胞激活劑、生長因子及病毒感染等外源性刺激后，可激活I(lǐng)KK導(dǎo)致IκB發(fā)生磷酸化被降解，使NF-κB異二聚體失去IκB的抑制作用而移位到細(xì)胞核內(nèi)，與相關(guān)基因結(jié)合從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。目前研究〔2〕已經(jīng)證實(shí)TNF-α、IL-1β、干擾素-γ等炎性細(xì)胞因子是NF-κB信號通路中被激活的重要標(biāo)志，滑膜細(xì)胞中TNF-α、IL-1β及干擾素-γ等致炎因子通過一系列級聯(lián)反應(yīng)，最終激活I(lǐng)KK復(fù)合體釋放NF-κB，從而調(diào)控各種炎癥基因的表達(dá)，產(chǎn)生的各種炎癥因子與活化了的NF-κB形成了一個(gè)正相的調(diào)控循環(huán)，促進(jìn)RA的炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞的發(fā)生。

AS2O3在祖國傳統(tǒng)中醫(yī)藥中早有應(yīng)用，是目前在臨床上被較多應(yīng)用的凋亡誘導(dǎo)劑。觀察RA的發(fā)病過程，其滑膜組織增生侵襲性生長及病理學(xué)行為在許多方面類似于腫瘤組織的特性。在AS2O3抗腫瘤的研究中，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制血管增生是其主要作用機(jī)制，而滑膜細(xì)胞凋亡失調(diào)和血管過度增生在RA發(fā)病過程中起到重要作用。相關(guān)研究〔8〕表明，腹腔注射AS2O3治療CIA大鼠，可抑制炎癥細(xì)胞浸潤、滑膜細(xì)胞增生，有效降低CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)。有研究〔9〕表明，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射AS2O3可有效改善CIA大鼠X線表現(xiàn)。因此，砷制劑可能誘導(dǎo)RA增生的滑膜細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，AS2O3各治療組能夠不同程度抑制CIA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)，其中以高劑量組最明顯，低、中劑量組與雷公藤對照組作用相當(dāng)，而AS2O2抗炎作用機(jī)制可能與其降低血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α 表達(dá)有關(guān)。

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Theanti-inflammatoryactionofarsenictrioxideincollageninducedarthritismodelrats

TANGFang，MAWu-Kai，CHENYu-Ting,etal.

DepartmentofRheumatologyandImmunology，No．2AffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine，Guizhou550001，Guiyang,China

ObjectiveTo observe the influence of arsenic trioxide(AS2O3) on the level of serum tumor necrosis factor(TNF) -α, interleukin (IL) -1βin collagen induced arthritis (CIA) model rats.Methods60 healthy and clean Wistar rats were randomly divided into blank control,model control,tripterygium wilfordii(TwHF) control, AS2O3high, medium and low dose treatment groups,each group with 10 rats. The changes of joint pathology and arthritis index in CIA rats were observed,and the levels of serum TNF-α, IL-1β were measured.ResultsAS2O3inhibited the joint swelling,reduced the levels of serum TNF-α, IL-1β,and reduced the joint synovial cell hyperplasia and the lymphocyte infiltration in synovial layer and synovial lower layer. The curative effect in the AS2O3low and medium dose treatment groups were comparable to those of TwHF control group(P>0.05), the curative effect of high dose treatment group was better than that of TwHF control group (P<0.01).ConclusionsAS2O3could alleviate the joint swelling degree and the joint synovial lymphocyte infiltration.

Arsenic trioxide;Collagen induced arthritis;Tumor necrosis factor α;Interleukin-1β

R2-031

A

1005-9202(2017)24-6005-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.001

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460727)；貴州省社會公關(guān)課題(黔科合SY字(2013)3048號)；國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)建設(shè)?？祈?xiàng)目(2012年)；貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)(黔科合人才團(tuán)隊(duì)(2013)4033)；貴州省中醫(yī)藥管理局課題(QZYY2013-63)；

馬武開(1968-)，男，博士，教授，主要從事風(fēng)濕免疫疾病研究。

唐 芳(1978-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事風(fēng)濕免疫疾病研究。

〔2017-05-16修回〕

(編輯 袁左鳴)