王雅琴 張海云 唐艷榮 楊 榮 張曉梅 許東保 張長(zhǎng)林 曹院章

（北京市朝陽區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100018）

2016年朝陽區(qū)動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)犬狂犬病和A型流感的流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告

王雅琴 張海云*唐艷榮 楊 榮 張曉梅 許東保 張長(zhǎng)林 曹院章

（北京市朝陽區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100018）

本文對(duì)動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)中因不同的原因前來就診的寵物進(jìn)行采樣調(diào)查，針對(duì)狂犬病和A-型流感病毒病開展檢測(cè)活動(dòng)，動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)共計(jì)采樣84份，應(yīng)用 V8實(shí)時(shí)快速熒光PCR檢測(cè)設(shè)備，開展病原學(xué)檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)有攜帶以上兩個(gè)病毒的寵物犬。

流行病學(xué)調(diào)查 寵物犬 狂犬病 A型流感病毒病 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

城市生活中，寵物的飼養(yǎng)既是一種精神需求，也是一種生活方式。在人們關(guān)注身心健康的同時(shí)，不可避免的重視所飼養(yǎng)動(dòng)物可能引發(fā)的人畜共患傳染病的可能。世界衛(wèi)生組織專家委員會(huì)認(rèn)定的人畜共患病中與寵物犬貓有直接或間接關(guān)系的有70 多種[1]。國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委疾病控制局官方網(wǎng)站發(fā)布信息表明，2016年全國(guó)共發(fā)生人感染狂犬病644例，感染H7N9型禽流感264例。所以，本次調(diào)研的目的旨在通過定點(diǎn)診療機(jī)構(gòu)中的就診病例，采集樣品，開展涉及狂犬病、A-型流感的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。調(diào)查臨床病例中可能攜帶的嚴(yán)重的人畜共患病可能。通過現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)相結(jié)合的方式，動(dòng)物疫病進(jìn)行定期定點(diǎn)抽樣調(diào)查，經(jīng)對(duì)各類資料和數(shù)據(jù)綜合分析、有效評(píng)估免疫效果、病原污染程度等技術(shù)指標(biāo)，從而提出防控建議和預(yù)測(cè)預(yù)警。提高寵物飼養(yǎng)帶來的健康危害、經(jīng)濟(jì)損失以及潛在的風(fēng)險(xiǎn)意識(shí)。

本項(xiàng)目的流行病學(xué)調(diào)查方法采取動(dòng)物疫病定點(diǎn)流調(diào)的方法，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)相結(jié)合的方式，在朝陽區(qū)四個(gè)街道中的動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)中開展采樣，樣品采集的時(shí)間為2016年1月至12月，樣品冷鏈運(yùn)輸?shù)轿抑行膶?shí)驗(yàn)室，進(jìn)行V8實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，相關(guān)數(shù)據(jù)處理。

本項(xiàng)目的實(shí)施單位為北京市朝陽區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，參加采樣的單位分別位于朝陽區(qū)南磨房街道、團(tuán)結(jié)湖街道、望京街道、奧運(yùn)村街道中的動(dòng)物治療機(jī)構(gòu)共計(jì)四家。同時(shí)涉及朝陽區(qū)警犬巡防隊(duì)的警用犬只。

1 材料和方法

1.1 定點(diǎn)調(diào)查的原則和范圍

1.1.1 定點(diǎn)流調(diào)的原則：每個(gè)定點(diǎn)的布局考慮到地域、交通、動(dòng)物飼養(yǎng)量、動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)的工作能力以及所采樣品充分的代表性。

1.1.2 定點(diǎn)的范圍：指針對(duì)動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)中前來就診的寵物采樣。

1.2 定點(diǎn)調(diào)查的內(nèi)容

（1）開展項(xiàng)目的動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)的完整信息調(diào)研。

（2）開展寵物樣品信息采集，內(nèi)容包括寵物主人姓名、病例號(hào)、寵物年齡、性別、品種、就診時(shí)臨床癥狀、采集樣品種類，采樣日期。

（3）開展V8實(shí)時(shí)快速熒光PCR檢測(cè)，配套專用商品化試劑盒，對(duì)狂犬病、A-型流感病毒病進(jìn)行快速診斷。

2 定點(diǎn)流行病學(xué)調(diào)查情況

2.1 樣品采集及運(yùn)輸要求

2.1.1 樣品采集標(biāo)準(zhǔn)：

咽、眼、鼻棉拭子的采集：選擇有臨床呼吸道癥狀的犬，采集樣品前要求潤(rùn)濕棉簽，在黏膜部位捻轉(zhuǎn)3～5次。放置于含有1ml生理鹽水的離心管內(nèi)。

唾液樣品的采集：隨機(jī)選擇可以采集唾液的犬，將唾液導(dǎo)入經(jīng)過高溫高壓消毒的一次性1.5ml離心管內(nèi)。2.1.2 樣品保存：樣品的適當(dāng)保存是有效檢測(cè)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。棉拭子類樣品，可置于生理鹽水中保存。樣品如果在三日內(nèi)完成檢測(cè)，均可以再4℃冷藏保存，超過3日再做檢測(cè)的樣品，可于-20℃冷凍保存。血液類樣品，于-20℃冷凍保存。所有樣品都應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.1.3 樣品運(yùn)輸：樣品要求保持冷鏈運(yùn)輸。

2.2 試驗(yàn)方法和試劑來源

2.2.1 檢測(cè)原理：實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過特定探針和引物的設(shè)計(jì)和合成，模板的制備，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)使用儀器：

（1）V8實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀器。特點(diǎn)：快速變溫、收集熒光信號(hào)、自動(dòng)設(shè)定閾值、自動(dòng)計(jì)算Ct值。

（2）移液器。試驗(yàn)中配備的eppendorf手動(dòng)單道移液器10μl、20μl、100μl、200μl、1000μl的移液器各一把。

（3）其他設(shè)備：配備電熱恒溫水浴鍋一臺(tái)、小型漩渦振蕩器一臺(tái)，計(jì)時(shí)器一臺(tái)，板架若干。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)使用的V8反應(yīng)試劑盒。共計(jì)引進(jìn)V8試劑盒10個(gè)，其中狂犬病V8反應(yīng)試劑盒5個(gè)，A-型流感V8反應(yīng)試劑盒5個(gè)。

3 檢測(cè)方法V8實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)操作步驟

3.1 RNA提取操作

按照試劑盒內(nèi)操作說明開展提取操作，通過消化--吸附--洗滌--洗脫獲得相應(yīng)的核酸模板。

3.2 核酸擴(kuò)增反應(yīng)操作

（1）取V8實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管，置于室溫融化，放置于反應(yīng)管架（溫度保持在2-10℃），加入核酸模板，用離心機(jī)離心30s，放入V8實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀器中，使用對(duì)應(yīng)的反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

（2）結(jié)果判定：根據(jù)自動(dòng)分析，Ct值≤36并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線為陽性樣品；Ct值＞36時(shí)，并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，需要重新取樣品提取核酸模板，擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定，如仍出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，結(jié)果判定為陽性樣品；對(duì)于未能呈現(xiàn)特定的“s”型曲線的，即使Ct值≤36，應(yīng)為陰性。

3.3 注意事項(xiàng)

3.3.1 預(yù)防污染

操作人員必須穿戴好工作服、口罩、手套；提取過程中，盡量避免手套接觸吸附柱管口和離心管管口；將液體吸入吸附柱中時(shí)，若離心管開蓋時(shí)液體粘在手上或?yàn)R出，應(yīng)立即更換手套；

所有用于檢測(cè)的廢棄物都應(yīng)該收集放入消毒液的消毒缸中。

反應(yīng)管放入儀器前，一定要蓋緊封口，放置在儀器內(nèi)崩開。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用卡夾取出時(shí)，要卡到反應(yīng)管最后一道棱框內(nèi)，放置取出過程中導(dǎo)致封口崩開，飛沫污染儀器。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)該用1%次氯酸鈉或75%酒精消毒工作臺(tái)。

3.3.2 規(guī)范操作

所有樣品必須進(jìn)行明確的標(biāo)記，編號(hào)，采樣單位制作完整的《V8項(xiàng)目檢測(cè)樣品采樣表格》，送樣品時(shí)上交《V8項(xiàng)目流行病學(xué)調(diào)查采樣登記表》。由實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)號(hào)碼的編制，并且進(jìn)行標(biāo)記，排序。

所有樣品都需進(jìn)行充分的融化后進(jìn)行檢測(cè)，棉拭子以及唾液樣品檢測(cè)前需要進(jìn)行振蕩混勻。嚴(yán)禁樣品反復(fù)凍融（三次不可用）。

實(shí)際操作中，所有試劑使用前需要認(rèn)真核對(duì)檢測(cè)試劑名稱。反應(yīng)管、蛋白酶K使用前，于室溫融化，隨用隨取，用后立即放回冰箱。

所有實(shí)驗(yàn)操作完全按照操作說明書步驟操作，不得刪減。

3.4 儀器設(shè)備計(jì)量、效驗(yàn)、維護(hù)

參加由北京世紀(jì)元亨組織的V8快速實(shí)時(shí)熒光PCR能力驗(yàn)證比對(duì)實(shí)驗(yàn)，依據(jù)ISO/IEC17043、GB/T 27043和SN/T2989運(yùn)作能力驗(yàn)證計(jì)劃，參與能力驗(yàn)證比對(duì)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：比對(duì)實(shí)驗(yàn)中的四個(gè)盲樣，檢測(cè)結(jié)果均為滿意。計(jì)算中位值、標(biāo)準(zhǔn)IQR和Z比分?jǐn)?shù)，均為滿意。

3.5 影響調(diào)查研究結(jié)果和數(shù)據(jù)的條件和因素

3.5.1 樣品采集的代表性意義：動(dòng)物流行病學(xué)調(diào)查采樣工作，采樣人員的主觀因素影響比較嚴(yán)重，隨機(jī)性差，不具有完全的代表性。同時(shí)，也與動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)工作狀況相關(guān)，在日常工作比較繁忙的季節(jié)，采樣數(shù)量明顯較少。存在樣品采集的隨機(jī)誤差和選擇偏倚。

3.5.2 檢測(cè)水平和檢測(cè)方法效驗(yàn)誤差：V8實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)雖然是成熟的檢測(cè)技術(shù)，但是在實(shí)際操作過程中，對(duì)操作人員的要求較高，對(duì)各種試劑的存儲(chǔ)、使用都有著極為苛刻的規(guī)定，不可避免出現(xiàn)人員誤差和儀器誤差。

3.5.3 項(xiàng)目設(shè)計(jì)中的目的性偏倚：本項(xiàng)目的主旨是寵物源性人畜共患病的快速診斷檢測(cè)的應(yīng)用，針對(duì)個(gè)體動(dòng)物的疫病攜帶情況的檢測(cè)和分析，缺少對(duì)整個(gè)群體的大數(shù)據(jù)分析和考量。所以，檢測(cè)范圍小、采集樣品量少、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)少，社會(huì)意義有限。

4 結(jié)果

2016年1月至12月期間我實(shí)驗(yàn)室共計(jì)接收到動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)送檢樣品84份，犬唾液樣品50份，咽、眼、鼻棉拭子34份。共計(jì)開展實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)86項(xiàng)次，其中狂犬病檢測(cè)50項(xiàng)次、A-型流感檢測(cè)36項(xiàng)次。

4.1 狂犬病調(diào)查結(jié)果

共計(jì)收到50份犬唾液樣品，根據(jù)樣品的要求，46份犬唾液樣符合實(shí)驗(yàn)要求，46份樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

4.2 A-型流感調(diào)查結(jié)果

共計(jì)開展犬咽、眼、鼻棉拭子34份A-型流感檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。

5 結(jié)論

在2016年1月至12月期間，在朝陽區(qū)的四個(gè)街道的診療機(jī)構(gòu)中采集的就診動(dòng)物樣品的檢測(cè)中，其中病毒類傳染病狂犬病未檢出，A-型流感病毒病未檢出；

6 分析與討論

6.1 狂犬病檢測(cè)情況分析

根據(jù)我國(guó)2000年以后狂犬病的死亡人數(shù)變化可以看出，自2007年以后，死亡人數(shù)持續(xù)下降。以2015年為例，截至2015年8月份，北京市報(bào)告本地狂犬病8例，發(fā)病率0.06/10萬，病死率100%。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)2015年1～8月全市動(dòng)物致傷120241人次，比2014年同期上升11.4%[2]。在政府大力度宣傳、全面開展門診狂犬病疫苗接種等工作的背景下，家庭飼養(yǎng)的犬只，開展狂犬病免疫的比例較大。加之北京市狂犬病強(qiáng)制免疫政策和注冊(cè)犬免費(fèi)免疫政策的實(shí)施以朝陽區(qū)為例，多年來能夠保證注冊(cè)犬的100%免疫。最重要的是在就診病例中，動(dòng)物主人對(duì)待動(dòng)物的態(tài)度和關(guān)注度都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般動(dòng)物飼養(yǎng)者，所以，未檢出狂犬病病毒攜帶符合社會(huì)現(xiàn)狀。

關(guān)于犬唾液檢測(cè)的說明：唾液檢測(cè)狂犬病用于人類的狂犬病檢測(cè)方法。犬的唾液中發(fā)現(xiàn)的狂犬病病毒，是在多克隆的免疫球蛋白的乳膠凝聚中發(fā)現(xiàn)的。唾液中的病毒檢出低于直接從腦組織中檢測(cè)出來，唾液的陰性檢測(cè)仍然需要直接的腦組織檢測(cè)來驗(yàn)證。更加敏感和特異性的唾液檢測(cè)需要進(jìn)一步的病毒分離和基因檢測(cè)方法[4]。也就是說，犬唾液的檢測(cè)是可以檢測(cè)出狂犬病病原體的，但是易發(fā)生假陰性，如果需要進(jìn)行確定的診斷仍需要進(jìn)行腦組織的檢測(cè)，所以犬唾液檢測(cè)具有一定的局限性。

6.2 A型流感病毒病情況分析

A型流感病毒屬于是正粘病毒科，其最危險(xiǎn)的特性是跨種間傳播，A型流感已經(jīng)在多種動(dòng)物中分離到：如人、禽類、豬、馬、貓、犬等。其中流感病毒受體在犬體內(nèi)分布最為廣泛，可以作為流感病毒的中間宿主，使得病毒在體內(nèi)進(jìn)行重組，從而產(chǎn)生新的病毒威脅人類的生命安全[3]。根據(jù)A-型流感在犬類上的報(bào)道，犬貓的A型流感攜帶是由于人類感染，導(dǎo)致所飼養(yǎng)動(dòng)物出現(xiàn)攜帶。根據(jù)2009年犬?dāng)y帶H3N8和國(guó)內(nèi)關(guān)于犬?dāng)y帶H1N1的報(bào)道，都沒有明確的證據(jù)證明犬所攜帶的A-型流感病毒可以感染人類[4]。由于A-型流感病毒的復(fù)雜情況，應(yīng)該在盡可能多的環(huán)節(jié)，增加檢測(cè)動(dòng)物品種和數(shù)量，盡可能地在最早的時(shí)刻，將流感的攜帶動(dòng)物及時(shí)篩查出來。本次檢測(cè)采集樣品數(shù)量有限，對(duì)現(xiàn)實(shí)情況的指導(dǎo)意義有限。

本表為書中節(jié)選部分犬?dāng)y帶流感情況的實(shí)驗(yàn)室分類調(diào)查情況，攜帶有H5N1和H3N8型流感的犬只已有報(bào)道，根據(jù)A型流感病毒的特性，其在不同動(dòng)物體內(nèi)容易發(fā)生變異，所以應(yīng)該將A型流感病的檢測(cè)在動(dòng)物臨床診療中盡快應(yīng)用，以降低新型流感病毒擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)。

7 結(jié)語

（1）加大對(duì)人畜共患病的宣傳力度，擴(kuò)大流行病學(xué)調(diào)查范圍，促進(jìn)對(duì)相關(guān)疾病的認(rèn)識(shí)，提高寵物飼養(yǎng)者的風(fēng)險(xiǎn)意識(shí)。

（2）開發(fā)建立以動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)為主體的動(dòng)物人畜共患病平臺(tái)，及時(shí)通過平臺(tái)進(jìn)行系統(tǒng)上報(bào)數(shù)據(jù)，既可以保護(hù)獸醫(yī)群體，同時(shí)保護(hù)公共衛(wèi)生安全。

（3）指導(dǎo)轄區(qū)動(dòng)物診療機(jī)構(gòu)開展相關(guān)人畜共患病監(jiān)測(cè)技術(shù)培訓(xùn)，通過有效的檢測(cè)方法結(jié)合臨床病例的監(jiān)測(cè)，達(dá)到控制疫病的目的。

[1] 侯加法，鄧譯峰.寵物犬貓常見人畜共患病[J].新獸醫(yī)，2005，（7）：34-36.

[2] 李愛華.淺議當(dāng)前犬貓人畜共患病現(xiàn)狀及防控對(duì)策[A].北京畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)五十周年慶典暨第八屆會(huì)員代表大會(huì)、學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].2004：195-196.

[3] 張鳳霞.A型流感病毒HA受體在犬、貉子、藍(lán)狐和水貂主要器官的分布[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

王雅琴（1978-），女，獸醫(yī)師，從事多年人畜共患病研究及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

張海云（1964-），女，高級(jí)獸醫(yī)師，從事多年人畜共患病研究。