李桂林 王 穎 馬蘭婷 郭恒俊 胥保華 郭興啟

（1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271018；2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018）

1 前言

蜜蜂作為自然界中最重要的授粉者[1]，極具社會(huì)效益及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，近年來由于受到各種不利環(huán)境脅迫及各種蜜蜂疾病的影響，全球范圍內(nèi)蜜蜂的數(shù)量正逐漸減少[2-4]。蜜蜂病毒病是一種特殊的蜜蜂疾病，不僅與弱勢(shì)蜂群的死亡相關(guān)，還影響蜜蜂的行為、生理及形態(tài)多個(gè)方面，其在多個(gè)國(guó)家都有分布，并在世界范圍內(nèi)快速擴(kuò)散，現(xiàn)已成為世界上引起蜂群損失的主要原因[5-7]。近年來，蜜蜂病毒病不僅成為養(yǎng)蜂行業(yè)的熱點(diǎn)話題，也成為養(yǎng)蜂研究的重要課題之一。

蜜蜂黑蜂王臺(tái)病是蜜蜂病毒病的一種，由蜜蜂黑蜂王臺(tái)病毒（Black queen cell virus，BQCV）引起。自2000年完成BQCV的南非株（GenBank:AF183905.1）全基因組測(cè)序以來，目前NCBI上已收藏7株BQCV的全基因組序列。近年來蜂產(chǎn)品貿(mào)易的全球化，使BQCV在世界范圍內(nèi)廣泛流行。在分類上，BQCV屬于類小核糖核酸病毒、雙順反子病毒科、蟋蟀麻痹病毒屬[8-10]；在形態(tài)上，BQCV是呈球形的、無囊膜的、直徑為30 nm的病毒粒子。BQCV傳播廣泛，可感染蜜蜂（蜂王、工蜂、雄蜂）的卵、幼蟲、蛹及成蜂，也可以感染不同蜂種甚至非膜翅類昆蟲。BQCV的傳播方式分為水平傳播及垂直傳播[11]。感染方式為隱性感染[12]，看似健康的蜂群里的蜜蜂可能攜帶BQCV，在各種不利環(huán)境條件下（高溫、低溫、營(yíng)養(yǎng)不良及外敵入侵等），蜜蜂體內(nèi)的BQCV可被激活并快速?gòu)?fù)制，最終導(dǎo)致蜂群大量死亡[3,13]。蜂群的大量死亡不僅給蜂農(nóng)帶來不可估量的損失，也將影響?zhàn)B蜂相關(guān)的產(chǎn)業(yè)。蜜蜂體內(nèi)攜帶BQCV并不可怕，可怕的是各種環(huán)境壓力導(dǎo)致蜜蜂體內(nèi)BQCV的激活，繼而導(dǎo)致BQCV被大量復(fù)制，最終導(dǎo)致蜂群崩潰。由于蜜蜂黑蜂王臺(tái)病給蜂群帶來嚴(yán)重危害，近年來針對(duì)BQCV的研究與日俱增[14-19]。

鑒于蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)病特點(diǎn)及流行性，提前檢測(cè)出蜂群中是否攜帶BQCV，做好預(yù)防措施，及時(shí)切斷BQCV的傳播途徑是必要的。本研究參照Benjeddou 等人設(shè)計(jì)的引物[20]，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR），對(duì)山東省17地市蜂群攜帶BQCV的狀況進(jìn)行調(diào)查，首次報(bào)道了山東省17地市部分蜂場(chǎng)蜜蜂攜帶BQCV的情況，為有效預(yù)防山東省蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)生提供參考。

2 材料與方法

2.1 樣品的采集

2016年7月至2016年11月，我們先后調(diào)研了山東省17個(gè)地市的62個(gè)蜂場(chǎng)，并從蜂場(chǎng)采集蜜蜂樣品，保存在-80℃超低溫冰箱內(nèi)備用。蜂種包括意大利蜜蜂（Apis mellifera）和中華蜜蜂 (Apis cerana cerana)，多數(shù)蜜蜂樣品是意大利蜜蜂，部分是中華蜜蜂。

2.2 試劑

RNAiso plus由TAKARA公司生產(chǎn)；氯仿、異丙醇、無水乙醇由天津市凱通化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；5× All-In-One RT MasterMix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)由ABM公司生產(chǎn)；EasyTaq?DNA Polymerase、pEASY?-T1 Simple Cloning Vector 及Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell由北京全式金生物生產(chǎn)；Plasmid Mini Kit I由上海拜力生物科技有限公司生產(chǎn)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。10 mM dNTP mixture由生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)。

2.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

在本研究中用到的擴(kuò)增BQCV的引物借鑒于Benjeddou 等人設(shè)計(jì)的引物，上游引物（BQCVup）為：5'-TGGTCAGCTCCCACTACCTTAAA-3'，下游引物（BQCVdown）為：5'-TGGTCAGCTCCCACTAC CTTAAAC-3'[20]，該對(duì)引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.4 樣品 RNA的提取

利用Trizol法提取樣品總RNA。具體步驟如下：液氮研磨采集的蜜蜂樣品至粉末狀，稱取0.05～0.1 g粉末至無RNA酶的1.5 ml離心管里（離心管里事先被分裝了1 ml的RNAiso plus），立即旋渦震蕩1 min，室溫放置5 min；12000 g，4℃離心10 min；取上清至新的1.5 ml離心管里，加入200 μl的氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min用來沉淀蛋白；12000 g，4℃離心15 min；取上清至新的1.5 ml離心管里，加入500 μl異丙醇用來沉淀RNA，輕輕地顛倒混勻，室溫放置10 min；12000 g，4℃離心10 min；去上清，加入1 ml預(yù)冷的75%的無水乙醇，漂洗RNA；7500 g，4℃離心5 min；用真空泵抽去75%的無水乙醇，室溫放置3 min，使殘留的無水乙醇盡量揮發(fā)完；加入30 μl的無RNA酶的水，吸打數(shù)次，溶解RNA，稍離心，保存在-80℃超低溫冰箱內(nèi)備用。

2.5 cDNA第一鏈的合成

用 5× All-In-One RT MasterMix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)合 成cDNA第 一 鏈。RNA模板加入2 μg，再加入AccuRT Reaction Mix(4X)至兩者的總體積為8 μl；42℃孵育2 min；分別加入 AccRT Rection Stopper (5X) 2 μl，5X All-In-One RT MasterMix 4 μl，Nuclease-free H2O 6 μl，吸打混勻，25℃孵育10 min，42℃孵育15 min，85℃孵育5 min；適當(dāng)離心后，放-20℃冰箱內(nèi)備用。

2.6 PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增程序

以合成的第一鏈cDNA為模板，建立以下25 μl的反應(yīng)體系：模板1 μl，上游引物1 μl，下游引物 1 μl，10X EasyTaq?Buffer 2.5 μl，10 mM dNTP mixture 溶 液 1 μl，EasyTaq?DNA Polymerase 0.25 μl，雙蒸水18.25 μl。反應(yīng)條件為：94℃ 10 min；94℃ 40 s，48℃ 40 s，72℃ 50 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10 min。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備

采集山東農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)殖的中華蜜蜂，按上述方法提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一條鏈，以此為模板，以BQCVup、BQCVdown為引物進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用凝膠成像系統(tǒng)（產(chǎn)自北京賽智科技有限公司）成像，把含目的條帶的凝膠切下，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行膠回收。膠回收產(chǎn)物連pEASY?-T1 Simple Cloning Vector。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell。次日挑選陽性單克隆菌送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。目的基因的測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Nucleotide BLAST，以檢測(cè)目的基因擴(kuò)增的正確性。選取測(cè)序正確的陽性單克隆菌的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。

2.8 檢測(cè)采集的山東省17地市的蜜蜂樣本中BQCV的攜帶情況

首先對(duì)采集的蜜蜂樣本按上面提到的RNA提取方法進(jìn)行RNA的提取，并制備cDNA第一條鏈。用來檢測(cè)的各蜂場(chǎng)的每個(gè)樣品均由20只蜜蜂組成，用液氮研磨至粉末狀，稱取0.05～0.1 g粉末用來提取RNA，剩余的粉末放-80℃超低溫冰箱備用。在進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，每個(gè)樣品做兩個(gè)平行。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，然后用全自動(dòng)凝膠成像儀拍照。陽性對(duì)照中模板是質(zhì)粒（上面提到的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板），陰性對(duì)照的模板是雙蒸水，其他反應(yīng)體系及反應(yīng)條件不變。

3 結(jié)果與分析

3.1 體系調(diào)研的基本情況

本研究對(duì)山東省17個(gè)地市（濟(jì)南、青島、淄博、德州、煙臺(tái)、濰坊、日照、萊蕪、菏澤、濱州、濟(jì)寧、泰安、臨沂、聊城、威海、棗莊及東營(yíng)等）的蜂場(chǎng)進(jìn)行抽樣調(diào)查。調(diào)查發(fā)現(xiàn)蜂農(nóng)主要養(yǎng)殖意大利蜜蜂，大部分蜂場(chǎng)有爬蜂現(xiàn)象，多數(shù)蜂場(chǎng)的蜜蜂被感染蜂螨。采集的樣品被帶回實(shí)驗(yàn)室后，先用液氮冷凍，然后立即放入-80℃超低溫冰箱保存。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的獲得

首先將從疑似患有BQCV的蜜蜂中得到的cDNA作為PCR擴(kuò)增的模板，并采用Benjeddou 等人設(shè)計(jì)的引物[20]（該引物已在世界范圍內(nèi)被多人用來篩選BQCV[21-23]），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，在選取的7個(gè)模板中，有六個(gè)模板可擴(kuò)出條帶，條帶大小與理論擴(kuò)增片段大小一致。1、3及7號(hào)目的條帶分別被用來切膠、膠回收，膠回收產(chǎn)物進(jìn)一步被用來做連接轉(zhuǎn)化，挑選陽性單克隆菌測(cè)序。測(cè)序獲得的目的序列在NCBI上Blast，結(jié)果顯示與之同源的核苷酸序列全來自BQCV。以上結(jié)果表明，我們擴(kuò)出來的片段就是BQCV的序列。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)飼養(yǎng)的中華蜜蜂蜂群購(gòu)自臨沂的某蜂場(chǎng)，在2016年9月份我們從這家蜂場(chǎng)采集的樣品中也檢測(cè)到了BQCV，初步說明該蜂場(chǎng)的蜜蜂攜帶BQCV，也進(jìn)一步證實(shí)了我們擴(kuò)出的序列是BQCV的。選取1號(hào)樣品的菌進(jìn)行搖菌，用Plasmid Mini Kit I抽提質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒作為檢測(cè)山東省17地市BQCV存在情況的陽性對(duì)照模板。

圖1 BQCV基因PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

3.3 山東省17地市蜂群攜帶BQCV的抽樣調(diào)查結(jié)果

采用RT-PCR初步檢測(cè)采集的蜜蜂樣品中是否含有BQCV。本研究共調(diào)研山東省17地市的62個(gè)蜂場(chǎng)，采集了128份樣品。在山東省17個(gè)地市的62個(gè)蜂場(chǎng)中，有7個(gè)地市（日照、泰安、臨沂、棗莊、濱州、威海和淄博），13個(gè)蜂場(chǎng)的蜂群初步被檢測(cè)到攜帶BQCV，檢出率為4.769%。其中3家蜂場(chǎng)的樣品來自日照，3家蜂場(chǎng)的樣品來自泰安，2家蜂場(chǎng)的樣品來自臨沂，2家蜂場(chǎng)的樣品來自棗莊，1家蜂場(chǎng)的樣品來自濱州，1家蜂場(chǎng)的樣品來自威海，1家蜂場(chǎng)的樣品來自淄博（表1）。

表1 山東省檢出BQCV的地市的情況

4 討論

蜜蜂黑蜂王臺(tái)病毒的感染方式為隱性感染，這種感染方式不易被觀察到，直到蜂王幼蟲及蛹變黑，巢房房壁變黑時(shí)，才能呈現(xiàn)出可觀察的現(xiàn)象[19,24]。RT-PCR方法具有快速、特異性強(qiáng)、敏感性高等特點(diǎn)，可用于快速檢測(cè)BQCV的存在，也為快速診斷蜜蜂黑蜂王臺(tái)病提供一種新的途徑。本研究用分子生物學(xué)的手段，用RT-PCR方法初步檢測(cè)了BQCV在山東省17地市的蜂群中攜帶情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在山東省17地市，62個(gè)蜂場(chǎng)中，有來自泰安、淄博、日照、臨沂、棗莊、濱州、煙臺(tái)和威海等7個(gè)地市的13個(gè)蜂場(chǎng)的蜜蜂初步被檢測(cè)到攜帶BQCV（檢出率為4.769%），在青島、東營(yíng)、濰坊、德州、聊城、萊蕪、濟(jì)南、煙臺(tái)、菏澤及濟(jì)寧的蜂場(chǎng)未檢測(cè)到BQCV的存在。此結(jié)果初步說明BQCV在山東省分布并不廣泛。通過本研究，可以通知被檢測(cè)出BQCV存在的蜂場(chǎng)的蜂農(nóng)加強(qiáng)防御BQCV增殖的意識(shí)，以免造成不必要的損失。值得提出的是，日照嵐山區(qū)部分蜂場(chǎng)的蜜蜂于2016年11月初出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象，我們?cè)诋?dāng)?shù)厝曳鋱?chǎng)采集了?。ㄋ溃┓錁悠罚?jīng)RT-PCR鑒定顯示：三家蜂場(chǎng)的蜜蜂均攜帶BQCV，相對(duì)于本實(shí)驗(yàn)室所鑒定的其他蜜蜂病原，BQCV的含量還是較強(qiáng)的（數(shù)據(jù)未顯示）。經(jīng)調(diào)研這三家蜂場(chǎng)，發(fā)現(xiàn)蜂農(nóng)對(duì)蜂群飼養(yǎng)管理不規(guī)范，蜂群群勢(shì)弱。本地區(qū)蜜蜂突發(fā)性大量死亡可能原因之一是：這三家蜂場(chǎng)的蜂群本身就攜帶BQCV，只是BQCV的滴度低，不足以引起蜜蜂患病。在各種不利環(huán)境（寒流來襲及飼料不足等）的影響下，蜜蜂體內(nèi)的BQCV被激活，再加上與其他蜜蜂病原（蜂螨、慢性麻痹病毒、克什米爾病毒及殘翅病毒等）的混合感染，導(dǎo)致蜂群出現(xiàn)大規(guī)模病死現(xiàn)象。蜂群的大量死亡給蜂農(nóng)造成大量損失，也間接影響?zhàn)B蜂行業(yè)，通過這一事件，我們覺得有必要加強(qiáng)蜂農(nóng)防御蜜蜂病毒病的意識(shí)。

蜜蜂給我國(guó)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益，然而BQCV導(dǎo)致的蜜蜂急劇死亡也給國(guó)家造成極大經(jīng)濟(jì)損失。鑒于目前還沒有針對(duì)BQCV的徹底治療方法，因此保持蜂群健康，預(yù)防蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)生顯得尤為重要。為減少蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)生，以下防御措施可供參考：（1）有效治理狄斯瓦螨（這是保證蜂群健康的最有效的措施）。Chantawannakul等首次報(bào)道了瓦螨可攜帶BQCV[25]。瓦螨的刺吸行為可使寄生在瓦螨身上的病毒粒子進(jìn)入蜜蜂血淋巴，如果瓦螨寄生的是被病毒感染的蜜蜂，那么蜜蜂血淋巴里存在的病毒顆粒也可被瓦螨一塊吸取，繼而造成病毒在不同蜜蜂個(gè)體間傳播。此外，由于生物免疫抑制作用，隱藏在蜜蜂體內(nèi)潛在的病毒可被激活[26,27]。通過與多位蜂農(nóng)的交談發(fā)現(xiàn)，如果在養(yǎng)蜂的過程中對(duì)螨防治的好，基本上可以獲得強(qiáng)群，蜂群一般不會(huì)出現(xiàn)不明原因的死亡現(xiàn)象。目前針對(duì)瓦螨的防治已有比較成熟的辦法，因此，可以通過控制蜂群中的瓦螨來間接控制蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)生。（2） 蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)生可能與蜜蜂微孢子蟲病有一定的聯(lián)系，當(dāng)與蜜蜂微孢子蟲合并感染時(shí)導(dǎo)致極強(qiáng)的致病性，給養(yǎng)蜂業(yè)帶來巨大損失。蜜蜂微孢子蟲病爆發(fā)的高峰期是春季和初夏，因此在春季及初夏可以通過嚴(yán)格控制蜜蜂微孢子蟲病的發(fā)生來間接防治蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的爆發(fā)[23,28,29]。（3）及時(shí)切斷其他蜜蜂病毒的傳播途徑。由于蜜蜂病毒的多重感染對(duì)蜂群帶來的損失遠(yuǎn)高于單一感染，勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致弱勢(shì)蜂群的產(chǎn)生，再加上不利環(huán)境的刺激，勢(shì)必使蜜蜂病毒被激活并大量復(fù)制的概率增加[24,30,31]。因此，我們可以定期對(duì)蜂場(chǎng)及蜂場(chǎng)所使用的各種蜂具進(jìn)行消毒，減少各種病毒的增殖，進(jìn)而減少BQCV與其他蜜蜂病毒混合感染的機(jī)會(huì)。切斷各種蜜蜂病毒的傳播途徑，防止蜜蜂受到病毒的多重感染，減少弱勢(shì)蜂群的產(chǎn)生，有利于蜂群抵抗BQCV的侵染。（4）飼養(yǎng)強(qiáng)群，選用年輕的優(yōu)質(zhì)蜂王[4,11]。相比弱群，強(qiáng)群里的蜜蜂有較強(qiáng)的免疫力及抗病性[19,24,30]。在各種不利環(huán)境因子的應(yīng)激壓力下，強(qiáng)群的蜜蜂有更強(qiáng)的適應(yīng)性，潛伏在蜜蜂體內(nèi)的BQCV不易被激活。另外，因蜜蜂病毒可通過垂直傳播途徑傳給后代，因此選用健康的、不攜帶蜜蜂病毒及抗病能力強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)蜂王來繁育后代，就減少了蜜蜂病毒通過垂直傳播途徑傳給后代的機(jī)會(huì)。（5）加快研究抗BQCV藥物的步伐。Aurori等提出月桂可做為潛在的治療受BQCV感染的蜂群的抗病毒藥物[16]，這當(dāng)然還要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。此外，隨著科技的發(fā)展，可利用RNA干擾的原理及技術(shù)，制造抗BQCV的藥物用于防治蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)生也是可行的。

總之，通過抽樣調(diào)查及RT-PCR方法，本研究發(fā)現(xiàn)山東省17地市蜂群攜帶BQCV的現(xiàn)象不普遍，此結(jié)果為下一步預(yù)防蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)生提供了參考。另外，希望本研究根據(jù)調(diào)研情況及對(duì)查閱文獻(xiàn)的總結(jié)提出的可能預(yù)防蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的方法，能對(duì)蜂農(nóng)了解防治蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的方法提供幫助。

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