唐強(qiáng)，田源，葉濤，朱路文，阮野，趙彬，陳慧杰，王雪

·專題·

針康法對(duì)腦缺血大鼠缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡及X連鎖凋亡抑制蛋白和cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)的影響①

唐強(qiáng)1，田源2，葉濤2，朱路文1，阮野1，趙彬1，陳慧杰1，王雪2

目的觀察針康法對(duì)腦缺血大鼠缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡及X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)和cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)的影響。方法選取180只雄性Sprague-Dawley大鼠，通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、針刺組、康復(fù)組和針康組。每組再分為3 d、7 d和14 d三個(gè)亞組(n=12)。采用改良Longa線栓法進(jìn)行造模，假手術(shù)組和模型組不予治療，針刺組進(jìn)行頭穴叢刺治療，康復(fù)組進(jìn)行跑臺(tái)康復(fù)訓(xùn)練，針康組進(jìn)行針康法治療。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS)后取材，采用TUNEL染色觀察大鼠腦缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡率，Western blotting檢測(cè)腦缺血半暗區(qū)XIAP和cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)。結(jié)果術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，與模型組比較，各治療組mNSS評(píng)分均降低(P＜0.05)，細(xì)胞凋亡率均降低(P＜0.05)，XIAP蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)；與針刺組、康復(fù)組比較，針康組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低(P＜0.05)，XIAP蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)(P＜0.05)。術(shù)后7 d、14 d，針康組mNSS評(píng)分進(jìn)一步降低(P＜0.05)，針康組cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)(P＜0.05)。結(jié)論針康法能降低腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損，優(yōu)于單獨(dú)的頭穴叢刺和康復(fù)訓(xùn)練，其機(jī)制可能與促進(jìn)XIAP蛋白表達(dá)，抑制caspase-9蛋白活化，從而減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。

腦缺血；神經(jīng)功能；針康法；凋亡；X連鎖凋亡抑制蛋白；cleaved-caspase-9；大鼠

缺血性腦卒中作為臨床常見(jiàn)疾病，約占腦卒中發(fā)病的80%，主要是由于各種原因引起大腦血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致局部腦組織缺血缺氧發(fā)生壞死，從而引起運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、言語(yǔ)和認(rèn)知等功能障礙的一類臨床疾病[1]。針康法是在頭穴叢刺時(shí)進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練并長(zhǎng)時(shí)間留針的方法，具有“針康同步、動(dòng)態(tài)治療、整體康復(fù)”的優(yōu)點(diǎn)，在臨床上對(duì)腦卒中后痙攣狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)功能和言語(yǔ)功能障礙有顯著的療效[2-4]，但其機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明[5]。細(xì)胞凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis,IAPs)家族中X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)是最有效的半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)抑制物，通過(guò)其氨基端的BIR3與caspase-9結(jié)合使其失活無(wú)法裂解為cleaved-caspase-9，從而抑制細(xì)胞凋亡[6-8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察針康法對(duì)大鼠腦缺血后神經(jīng)功能及缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)檢測(cè)缺血半暗區(qū)XIAP和cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)水平，探討針康法神經(jīng)保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠，鼠齡10～12周，初始體質(zhì)量240～260 g，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXX(黑)2010007。飼養(yǎng)條件：室溫(24±1)℃，濕度(65±10)%，噪音小于60 dB，通氣良好，明暗光照交替各12 h，自由食水。實(shí)驗(yàn)前大鼠進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，15 m/min，每天15 min，共3 d。篩選自愿跑臺(tái)訓(xùn)練的大鼠180只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的動(dòng)物飼養(yǎng)及取材嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理準(zhǔn)則和指南相關(guān)的規(guī)定。

將180只大鼠從1至180進(jìn)行編號(hào)后，計(jì)算機(jī)隨機(jī)生成180個(gè)數(shù)字，隨機(jī)選取一個(gè)數(shù)字作為起始點(diǎn)與編號(hào)1號(hào)的大鼠相對(duì)應(yīng)，從左至右、由上而下分別對(duì)應(yīng)1至180號(hào)大鼠。用隨機(jī)數(shù)字除以5得的余數(shù)0、1、2、3、4對(duì)應(yīng)假手術(shù)組、模型組、針刺組、康復(fù)組和針康組，最終每組各分得36只大鼠。各組再分成3 d、7 d、14 d 3個(gè)亞組(n=12)。

造模失敗或者實(shí)驗(yàn)中死亡的大鼠另外補(bǔ)充。

1.2 主要試劑及儀器

XIAP、cleaved-caspase-9多克隆抗體：美國(guó)CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。PVDF膜：美國(guó)MILLIPORE公司。TEMED：美國(guó)AMRESCO公司。內(nèi)參抗體β-actin、羊抗兔IgG-HRP：沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司。TUNEL檢測(cè)試劑盒：德國(guó)ROCHE公司。預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)：加拿大FERMENTAS公司。ECL發(fā)光液：上海七海復(fù)泰生物科技有限公司。

一次性無(wú)菌針灸針：北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心。ZH-PT型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)：徐州利華電子科技發(fā)展有限公司。H-2050R型超速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)、DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)移槽、DY-CZ-24DN型雙垂直蛋白電泳儀、WD-9405B型水平搖床：北京六一生物科技有限公司。ELX-800型酶標(biāo)儀：美國(guó)BIOTEK公司。RM2235型切片機(jī)：德國(guó)LEICA公司。DH36001B型電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津泰斯特儀器有限公司。NW10LVF型超純水系統(tǒng)：香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司。Proline型微量移液器：芬蘭BIOHIT公司。

1.3 造模及入組標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)改良Longa線栓法[9]對(duì)大鼠進(jìn)行腦缺血模型的制備。術(shù)前12 h大鼠禁食不禁水，腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。麻醉后將大鼠固定于恒溫手術(shù)臺(tái)(36～37℃)，在頸部用酒精進(jìn)行消毒后，頸前正中線切口。鈍性剝離皮下肌肉組織，找到右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈，用微動(dòng)脈夾閉阻頸內(nèi)動(dòng)脈離心端血流，然后在下方3～4 mm處用2 ml注射器針頭刺入頸總動(dòng)脈形成“V”形缺口，將制備好的前端2 mm過(guò)蠟、長(zhǎng)3 cm的魚(yú)線沿缺口插入頸總動(dòng)脈后，打開(kāi)動(dòng)脈夾，將魚(yú)線繼續(xù)插入頸內(nèi)動(dòng)脈，當(dāng)遇到阻力時(shí)停止并打死結(jié)固定線栓，完成后進(jìn)行縫合消毒。

假手術(shù)組不插入魚(yú)線，其余處理方式相同。

24 h后進(jìn)行Longa評(píng)分，保留1～3分大鼠入組。

1.4 干預(yù)方法

假手術(shù)組、模型組術(shù)后不進(jìn)行任何治療，僅進(jìn)行與其他組同等條件的抓取。

針刺組術(shù)后24 h采用直徑0.25 mm、長(zhǎng)25 mm針灸針，選取大鼠百會(huì)穴和百會(huì)穴左、右各旁開(kāi)2 mm處針刺，快速捻轉(zhuǎn)1 min后留針2 h[10]。每天1次。

康復(fù)組術(shù)后24 h進(jìn)行電動(dòng)跑臺(tái)訓(xùn)練，每天30 min；第 1～3天 8 m/min，第4～7天12 m/min，7 d后15 m/min；坡度0°[11]。每天1次。

針康組術(shù)后24 h，在頭穴叢刺針長(zhǎng)留針治療期間，同步進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練。針刺方案同針刺組，跑臺(tái)訓(xùn)練方案同康復(fù)組。每天1次。

1.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)估

在各時(shí)間點(diǎn)采用14分制改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modified Neurological Severity Score,mNSS)[10]評(píng)估各組大鼠神經(jīng)功能。

1.6 TUNEL染色

各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠mNSS評(píng)分后，每組取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛4 ml/kg深度麻醉大鼠后暴露心臟，采用生理鹽水和4%多聚甲醛進(jìn)行在體灌流，待大鼠肺組織變白、四肢僵硬后迅速斷頭取腦，常規(guī)制備5μm石蠟切片后進(jìn)行TUNEL染色。切片脫蠟、水合后滴加0.1%TritonX-100溶液50 μl，室溫靜置8 min，PBS漂洗5 min，共3次；滴加3%H2O250 μl，室溫靜置10 min，PBS漂洗后滴加TUNEL反應(yīng)液50 μl，避光條件下37℃孵育60 min，再次PBS漂洗。滴加DAB顯色液50 μl，鏡下觀察染色深度，完成后入水終止反應(yīng)。PBS漂洗后進(jìn)行蘇木素復(fù)染，最后將返藍(lán)的切片依次放入上行梯度乙醇中脫水，二甲苯透明，封片，鏡下觀察采圖，每例樣本取3個(gè)不同視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，以其均值代表該樣本的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.7 Western blotting

各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠mNSS評(píng)分后，每組取6只大鼠，深度麻醉后斷頭取鮮腦，取大腦中動(dòng)脈梗死周邊區(qū)組織，液氮速凍5 min后置于-80℃冰箱保存。取樣本加入細(xì)胞裂解液，低溫離心分離上清液為所需蛋白。BCA測(cè)定樣本蛋白總濃度，上樣體積20 μl，含蛋白40 μg。10%SDS-PAGE電泳分離目的蛋白(80 V,2.5 h)，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(80 V,1.5 h)。用TTBS緩沖液配制5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h，加入XIAP一抗(1∶100)4℃過(guò)兩夜、cleaved-caspase-9一抗(1∶1000)4℃過(guò)夜，后分別加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶5000)，37℃下XIAP孵育2 h、cleaved-caspase-9孵育45 min。洗膜后ECL發(fā)光試劑孵育5 min，顯影后拍攝。內(nèi)參β-action稀釋比1∶1000，檢測(cè)過(guò)程同XIAP和cleaved-caspase-9一抗。Gel-Pro-Analyzer 4.0分析定量分析反應(yīng)條帶灰度值，每組條帶分別進(jìn)行3次分析，以模型組灰度為1，得到其余4組的蛋白表達(dá)相對(duì)灰度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，最終mNSS評(píng)分、TUNEL染色細(xì)胞凋亡率與XIAP、cleaved-caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均以(xˉ±s)表示。采用單因素方差分析(ANOVA)比較各組間差異，LSD-t檢驗(yàn)比較兩兩之間差異。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 mNSS評(píng)分

各時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組大鼠mNSS評(píng)分均為0。與假手術(shù)組比較，模型組mNSS評(píng)分升高(P＜0.05)；與模型組比較，各治療組mNSS評(píng)分降低(P＜0.05)；術(shù)后7 d、14 d，與針刺組、康復(fù)組相比，針康組mNSS評(píng)分降低(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分

2.2 缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡

TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞為圓形或橢圓形，細(xì)胞核固縮，核內(nèi)可見(jiàn)棕褐色的TUNEL反應(yīng)產(chǎn)物，細(xì)胞核呈半月形或環(huán)狀，主要位于缺血半暗帶區(qū)。假手術(shù)組大鼠大腦皮層內(nèi)幾乎未見(jiàn)TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞，神經(jīng)元排列整齊，核仁清晰可見(jiàn)。見(jiàn)圖1。

與假手術(shù)組比較，各時(shí)間點(diǎn)模型組TUNEL染色細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.05)；與模型組比較，各時(shí)間點(diǎn)各治療組TUNEL染色細(xì)胞凋亡率降低(P＜0.05)；與康復(fù)組、針刺組比較，針康組TUNEL染色細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低(P＜0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，400×，bar=50 μm)

表2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)TUNEL染色細(xì)胞凋亡率(%)

2.3 缺血半暗區(qū)XIAP蛋白表達(dá)

各時(shí)間點(diǎn)上，假手術(shù)組均可見(jiàn)XIAP蛋白表達(dá)。與假手術(shù)組比較，各時(shí)間點(diǎn)上模型組XIAP蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)；與模型組比較，各治療組各時(shí)間點(diǎn)XIAP蛋白表達(dá)均升高(P＜0.05)；與針刺組和康復(fù)組比較，針康組各時(shí)間點(diǎn)XIAP蛋白表達(dá)均增加(P＜0.05)。見(jiàn)圖2、表3。

圖2 Western blotting檢測(cè)各組XIAP蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)XIAP蛋白表達(dá)

2.4 缺血半暗區(qū)cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)

各時(shí)間點(diǎn)上，假手術(shù)組均能見(jiàn)cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組造模后各時(shí)間點(diǎn)cleaved-caspase-9表達(dá)增加(P＜0.05)；與模型組比較，各治療組各時(shí)間點(diǎn)cleaved-caspase-9表達(dá)均下降(P＜0.05)；與針刺組和康復(fù)組相比較，術(shù)后7 d、14 d，針康組cleaved-caspase-9表達(dá)降低(P＜0.05)。見(jiàn)圖3、表4。

圖3 Western blotting檢測(cè)各組cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)

3 討論

本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針康法可以縮小腦梗死灶，降低神經(jīng)功能缺損，從而促進(jìn)運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能的恢復(fù)，其機(jī)制與對(duì)抗細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)軸突與血管再生等多個(gè)方面有關(guān)[5,12-15]。本研究mNSS結(jié)果表明，針康法在改善大鼠腦缺血后神經(jīng)功能缺損方面優(yōu)于單一的針刺或康復(fù)治療，且遠(yuǎn)期療效更為明顯。腦缺血后細(xì)胞凋亡率升高，3 d最明顯，7 d、14 d逐漸緩解。經(jīng)過(guò)針刺、康復(fù)和針康法治療后，各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率降低，提示針刺、康復(fù)和針康法均能降低腦缺后神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量，其中針康法效果最佳，表明針康法能有效抑制腦缺血引起的細(xì)胞凋亡，優(yōu)于單純康復(fù)和針刺。

細(xì)胞凋亡有三條途徑，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷途徑、細(xì)胞凋亡線粒體途徑和死亡受體途徑[16-17]，腦缺血細(xì)胞凋亡主要以線粒體途徑為主。由于缺血區(qū)腦神經(jīng)細(xì)胞受缺血和缺氧的刺激，發(fā)生線粒體膜的去極化和電位下降，使細(xì)胞色素C從線粒體中被釋放，激活線粒體依賴的caspase-9，并剪切活化為cleaved-caspase-9，繼而活化下游caspase-3、caspase-6、caspase-7，直接引起腦缺血區(qū)細(xì)胞的凋亡[18-19]。其他兩條通路最后也都激活caspase介導(dǎo)的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡程序，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。在細(xì)胞凋亡中，不論是線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑還是死亡受體途徑，三者都與caspase凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)[21]。

XIAP是IAPs家族中最主要的凋亡抑制蛋白，通過(guò)氨基端的BIR1、BIR2、BIR3可抑制caspase-3、caspase-7、caspase-9的活化，從而抑制細(xì)胞凋亡[22]。在線粒體途徑中，XIAP可以通過(guò)其氨基端BIR3與caspase-9蛋白結(jié)合，使細(xì)胞色素C難以與未活化的caspase-9結(jié)合活化為cleaved-caspase-9引起細(xì)胞凋亡，同時(shí)也使與XIAP結(jié)合的caspase-9無(wú)效化[23]。在缺血性腦卒中中，XIAP的表達(dá)呈逐漸下降趨勢(shì)；隨著XIAP蛋白表達(dá)的下降，線粒體途徑下caspase-9被活化為cleaved-caspase-9，從而使細(xì)胞凋亡[24]。曾芳等[25]發(fā)現(xiàn)電針對(duì)阿爾茨海默病治療效應(yīng)的發(fā)揮可能與抑制caspase-9蛋白表達(dá)和增加X(jué)IAP蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡線粒體途徑的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。趙雯等[26]研究發(fā)現(xiàn)，肝豆湯改良方通過(guò)上調(diào)XIAP蛋白的表達(dá)，下調(diào)caspase-9、caspase-3蛋白及其mRNA在腦組織中的表達(dá)，減輕銅沉積對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血發(fā)生后，在缺氧缺血損傷作用下，caspase-9被持續(xù)活化為cleaved-caspase-9，啟動(dòng)線粒體凋亡途徑；大量的XIAP在與caspase-9蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制其活性轉(zhuǎn)化過(guò)程中被消耗，造成XIAP的表達(dá)量驟然減少；在無(wú)外界干預(yù)的情況下，XIAP的表達(dá)水平無(wú)明顯上調(diào)，致使cleaved-caspase-9長(zhǎng)時(shí)間積蓄，細(xì)胞凋亡持續(xù)存在。經(jīng)針刺、康復(fù)、針康法干預(yù)后，各時(shí)間點(diǎn)XIAP表達(dá)均升高，同時(shí)cleaved-caspase-9表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡程度緩解，提示三種療法均可通過(guò)上調(diào)缺血腦組織中XIAP的表達(dá)來(lái)抑制由caspase-9活化起始的細(xì)胞凋亡，且隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，針康法的治療效果優(yōu)于單一頭穴叢刺或康復(fù)治療。

綜上所述，針康法可上調(diào)腦缺血后缺血半暗區(qū)XIAP蛋白表達(dá)，抑制caspase-9活化，降低線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而改善神經(jīng)功能缺損，優(yōu)于單一的頭穴叢刺或康復(fù)治療。后續(xù)我們將采用慢病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)對(duì)XIAP介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑展開(kāi)深入研究，進(jìn)一步豐富針康法的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)理，為針康法的臨床推廣提供理論支撐。

[1]魏琰,張維文,王曉莉,等.無(wú)癥狀性腦梗死患者首發(fā)癥狀性急性腦卒中的臨床特征及相關(guān)危險(xiǎn)因素[J].腦與神經(jīng)疾病雜志,2016,24(11):681-684.

[2]關(guān)瑩,張立,邢艷麗,等.針康法對(duì)腦卒中后痙攣狀態(tài)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2011,17(4):325-327.

[3]唐強(qiáng),吳北峰,朱肖菊.針康法對(duì)缺血性腦卒中患者肢體運(yùn)動(dòng)功能的影響[J].針灸臨床雜志,2005,21(2):46-47.

[4]唐強(qiáng),李宏玉,朱路文,等.針康法對(duì)腦卒中后非流暢性失語(yǔ)患者言語(yǔ)功能的影響[J].針灸臨床雜志,2016,32(7):35-37.

[5]唐強(qiáng),朱路文.腦卒中康復(fù)新策略——針康法[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2015,30(10):1071-1073.

[6]Russell JC,Whiting H,Szuflita N,et al.Nuclear translocation of X-linked inhibitor of apoptosis(XIAP)determines cell fate after hypoxia ischemia in neonatal brain[J].J Neurochem,2008,106(3):1357-1370.

[7]Shiozaki EN,Chai J,Rigotti DJ,et al.Mechanism of XIAP-mediated inhibition of caspase-9[J].Mol Cell,2003,11(2):519-527.

[8]Zumbr?gel FK,Machtens DA,Curth U,et al.Survivin does not influence the anti-apoptotic action of XIAP on caspase-9[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,482(4):530-535.

[9]Yang LX,Zhang X,Zhao G.Ginsenoside Rd attenuates DNA damage by increasing expression of DNA glycosylase endonuclease VIII-like proteins after focal cerebral ischemia[J].Chin Med J(Engl),2016,129(16):1955-1962.

[10]唐強(qiáng),葉濤,朱路文,等.針康法對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2信號(hào)通路的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(1):27-31.

[11]唐強(qiáng),姜云飛,朱路文,等.針康法對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損及缺血區(qū)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管抑制素蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(10):1151-1155.

[12]孔妍.針康法對(duì)局灶性腦缺血大鼠膠質(zhì)細(xì)胞環(huán)境和細(xì)胞凋亡的影響[D].哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),2013.

[13]葉濤,唐強(qiáng),朱路文,等.針康法對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能和缺血半暗區(qū)皮層血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(5):520-524.

[14]崔乃松.針康法對(duì)腦缺血大鼠運(yùn)動(dòng)功能及缺血區(qū)皮質(zhì)Nogo-A表達(dá)的影響[D].哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),2013.

[15]陳慧杰,唐強(qiáng),朱路文,等.針康法對(duì)腦缺血大鼠腦組織微血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)及aFGF、PF4蛋白表達(dá)影響[J].針灸臨床雜志,2017,33(5):65-69.

[16]Zhang X,Tang N,Hadden TJ,et al.Akt,FoxO and regulation of apoptosis[J].Biochim Biophys Acta,2011,1813(11):1978-1986.

[17]Hermeking H.The miR-34 family in cancer and apoptosis[J].Cell Death Differ,2010,17(2):193-199.

[18]趙捷,王靜,吳精霞.五價(jià)釩致神經(jīng)細(xì)胞凋亡中細(xì)胞色素C和天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶9及3蛋白的變化[C].2015中國(guó)金屬學(xué)會(huì)冶金安全與健康分會(huì)預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)學(xué)術(shù)交流會(huì),2015.

[19]彭偉,駱泓潔,元小冬.死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展[J].生命的化學(xué),2016,36(5):629-632.

[20]劉楠,李巖,牛振華,等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡通路[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病,2013,30(8):757-759.

[21]陳琳,吳巧鳳,楊明曉,等.基于細(xì)胞凋亡探討針刺作用機(jī)理的研究述評(píng)[J].上海針灸雜志,2016,35(10):1143-1146.

[22]Huang C,Zeng X,Jiang G,et al.XIAP BIR domain suppresses miR-200a expression and subsequently promotes EGFR protein translation and anchorage-independent growth of bladder cancer cell[J].J Hematol Oncol,2017,10(1):6.

[23]Holcik M,Gibson H,Korneluk RG.XIAP:apoptotic brake and promising therapeutic target[J].Apoptosis,2001,6(4):253-261.

[24]Chávez-Galán L,Sada-Ovalle I,Baez-Salda?a R,et al.Monocytes from tuberculosis patients that exhibit cleaved caspase 9 and denaturalized cytochrome C are more susceptible to death mediated by Toll-like receptor 2[J].Immunology,2012,135(4):299-311.

[25]曾芳,何宇恒,彭靜,等.電針對(duì)SAMP8小鼠海馬神經(jīng)元凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9及凋亡抑制蛋白XIAP表達(dá)的影響[J].中國(guó)老年學(xué),2008,28(6):521-523.

[26]趙雯,馬艷紅,韓詠竹,等.肝豆湯改良方對(duì)TX小鼠腦組織XIAP、Caspase-9和Caspase-3蛋白及其mRNA表達(dá)的影響[J].安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2015,34(4):58-64.

Effects of Acupuncture-rehabilitation Therapy on Apoptosis and Expression of X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein and Cleaved-caspase-9 in Ischemic Penumbra of Rats with Cerebral Ischemia

TANG Qiang1,TIAN Yuan2,YE Tao2,ZHU Lu-wen1,RUAN Ye1,ZHAO Bin1,CHEN Hui-jie2,WANG Xue2
1.Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150001,China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150040,China

ObjectiveTo explore the effect of acupuncture-rehabilitation therapy on apoptosis and the expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein(XIAP)and cleaved-caspase-9 in ischemic penumbra of rats with cerebral ischemia.MethodsA total of 180 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group,model group,acupuncture group,rehabilitation group and acupuncture-rehabilitation therapy group.Each group was divided into three days,seven days and 14 days subgroups(n=12).The model was established with the modified Longa suture method.The model group and the sham operation group

no treatment.The acupuncture group received cluster needling of scalp acupuncture,the rehabilitation group received treadmill training,and the acupuncture-rehabilitation therapy group received both acupuncture and treadmill training.On the third,seventh and 14th days after modeling,the neurological function was assessed with modified Neurological Severity Score(mNSS).The apoptosis was observed by TUNEL staining and the expression of XIAP and cleaved-caspase-9 protein was determined by Western blotting in cerebral ischemic penumbra,respectively.ResultsCompared with the model group,the mNSS scores decreased,the rate of apoptosis decreased,the expression of XIAP protein increased,and the expression of cleaved-caspase-9 decreased in each treatment group at each time point(P＜0.05).Compared with the other two treatment groups,the rate of apoptosis further decreased at each time points(P＜0.05),the expression of XIAP protein further increased at each time points(P＜0.05),the mNSS score further decreased(P＜0.05)and the expression of cleaved-caspase-9 protein further decreased(P＜0.05)seven days and 14 days after modeling in the acupuncture-rehabilitation therapy group.ConclusionAcupuncture and rehabilitation therapy could reduce the neurological deficit in rats with cerebral ischemia,which was superior to the simple acupuncture treatment and rehabilitation training.The mechanism may be related to th reduction of apoptosis by promoting XIAP protein expression and inhibiting caspase-9 protein activation.

cerebral ischemia;neurological function;acupuncture-rehabilitation therapy;apoptosis;X-linked apoptosis inhibitory protein;cleaved-caspase-9;rats

TANG Qiang.E-mail:tangqiang1963@163.com

R743.3

A

1006-9771(2017)12-1365-07

[本文著錄格式]唐強(qiáng)，田源，葉濤，等.針康法對(duì)腦缺血大鼠缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡及X連鎖凋亡抑制蛋白和cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(12):1365-1371.

CITED AS:Tang Q,Tian Y,Ye T,et al.Effects of acupuncture-rehabilitation therapy on apoptosis and expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein and cleaved-caspase-9 in ischemic penumbra of rats with cerebral ischemia[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(12):1365-1371.

1.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81473762;No.81273818)；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)領(lǐng)軍人才計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012RCL02)；3.黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013TD007)。

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市150040。作者簡(jiǎn)介：唐強(qiáng)(1963-)，男，漢族，四川大竹縣人，博士，教授，主要研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病中醫(yī)康復(fù)基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail:tangqiang1963@163.com。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.12.001

2017-07-17

2017-08-10)