孫昊雪

摘 要：本次實驗以Hela細胞為原材料，選擇阿霉素（Adriamycin）和紫杉醇（Paclitaxel）作為實驗抗腫瘤藥物，用MTT比色法測定細胞數(shù)目探究不同濃度的阿霉素和紫杉醇對細胞增殖的影響，用Hoechests-PI雙染法探究兩種藥物對細胞凋亡的影響。經(jīng)過為期兩周的實驗我們得出的結(jié)果是在阿霉素的作用下Hela細胞的IC50值為12.53μg/ml，在紫杉醇的作用下細胞的IC50值為10.97μg/ml。加入半數(shù)抑制藥物濃度后用顯微熒光拍照可觀察到紫杉醇和阿霉素均能抑制細胞增殖，降低細胞活力，明顯提高死亡和不健康細胞比例。

關(guān)鍵詞：Hela細胞；阿霉素；紫杉醇；IC50；細胞凋亡；MTT比色法；Hoechests-PI雙染法

中圖分類號：R73-361 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2017）22-0203-04

1 前言

近年來，癌癥的頻發(fā)和高致命性引起了人們越來越多的重視，針對癌癥細胞的治療藥物的研究也在蓬勃發(fā)展。紫杉醇和阿霉素是典型的抗癌藥物，對癌癥細胞有著明顯的殺滅和抑制作用：

（1）紫杉醇（Paclitaxel），進口藥商品名為Taxel，簡稱PTX。紫杉醇是M期的植物類藥物，對乳腺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌獲得較好的療效。分子式為C47H51NO14，其性狀是五色透明或略帶黃色的粘性溶液。具有高度親脂性，不溶于水。PTX是1971年從短葉紫衫樹皮中提取的具有抗腫瘤作用的活性物質(zhì)。PTX能特異性結(jié)合到微管導致微管聚合成團塊和束狀，而抑制微管網(wǎng)的正常組裝。另外其不良反應為嚴重骨髓抑制。

（2）阿霉素（Adriamycin），也稱為14-羥基柔紅霉素，簡稱：ADM，DOX，DXR，分子式為C27H23NO11，其形狀是鹽酸鹽為橘紅色針狀結(jié)晶或橙紅色粉末，呈疏松塊狀。易溶于水，微溶于甲醇，幾乎不溶于丙酮、乙醚或氯仿。其水溶性的穩(wěn)定性依賴于pH，在酸性水溶液中大致穩(wěn)定，在堿性溶液中不穩(wěn)定。ADM是由Di Marco等從一種鏈霉菌變異株發(fā)酵液中提出的糖甙抗生素。化學結(jié)構(gòu)與DNA相似，僅在側(cè)鏈14位碳原子上尉羥基。1968年動物實驗證實ADM有抗腫瘤作用，同年進行了臨床試驗。ADM可嵌入DNA的相鄰堿基對之間，使DNA鏈裂解，阻礙DNA及RNA的合成。對S 期最敏感，M期其次，而對G1期敏感性較差。另外其不良反應為骨髓抑制，發(fā)生率為60%-80%；心臟毒性，6%-30%。

Hela細胞系（HeLa cell line）是生物學與醫(yī)學研究中使用的源自一位名叫Henrietta Lacks美國婦女的子宮頸癌細胞的細胞系，是由人類乳突狀瘤病毒第18型（Human Papillomavirus 18）轉(zhuǎn)化的，常用作癌癥細胞模型（model cancer cells）研究。與其他癌細胞相比，HaLa細胞系增殖異常迅速，因此本實驗以HaLa細胞系為實驗材料，對紫杉醇和阿霉素的抗癌性進行研究。

2 材料與方法

2.1 MTT比色法

MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽，黃色）能被活細胞線粒體脫氫酶還原成不溶于水的藍紫色產(chǎn)物甲鐕（formazan），后者被溶解后所呈現(xiàn)的色度則反映活細胞的代謝水平。死細胞上述無脫氫酶活性。因此formazan產(chǎn)生的量與活細胞數(shù)量成正比。MTT比色法的優(yōu)點是簡單、快速、較準確。因而被廣泛應用于新藥篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗分析。具體實驗流程如下：

（1）將HeLa細胞懸液按照設(shè)計好的濃度（每孔1*104個細胞）經(jīng)稀釋后接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔加稀釋后的細胞懸液0.2mL。設(shè)定無細胞孔位調(diào)零組，每組設(shè)6個平行孔；

（2）待細胞貼壁后（或次日），吸出培養(yǎng)基，加100uL新鮮的培養(yǎng)基和10uL MTT，培養(yǎng)4小時后加100uL裂解液，繼續(xù)培養(yǎng)16小時（或過夜）；

（3）用酶標儀測定OD值，檢測波長490nm或570nm。

本實驗中利用MTT比色法檢測在同一藥物的不同濃度下細胞的成活率，進而分析比較紫杉醇和阿霉素這兩種藥物對HeLa細胞的作用效果，并進一步計算出這兩種藥物的IC50值。

2.2 Hoechst-PI雙染色

PI（碘化丙啶）：雙鏈核酸標記物，親水性，不能通過完整細胞膜，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜分別為535nm和617nm，激發(fā)光波長范圍較寬，從紫光到綠光均可作為激發(fā)光。Hoechst 33342：特異結(jié)合AT區(qū)的DNA標記物，親脂性，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜分別為350nm和461nm。Hoechst-PI雙染色能夠通過顏色有效區(qū)分正常細胞、凋亡細胞與壞死細胞，具體情況如表1所示。

Hoechst-PI雙染色的實驗流程為：

（1）提前藥物處理細胞；

（2）用滴管將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)移到試管中，胰酶消化細胞，用收集的培養(yǎng)液吹打，制備細胞懸液，將細胞懸液轉(zhuǎn)入試管中1000r/min，離心5min，棄上清；

（3）用1ml PBS重懸細胞，轉(zhuǎn)入1.5ml微量離心管中，1000r/min，離心5min，棄上清，500μL PBS重懸，取178μl轉(zhuǎn)入0.5mL的微量離心管中，加入20μL PI（終濃度100μg/ml），2μL Ho.33342（終濃度10μg/ml），混勻，37°C溫箱中避光標記15min；

（4）1000r/min，離心5min，棄上清，加50μL PBS重懸，取10μL滴于載玻片上，蓋片（不能有氣泡或漂起），保存于暗處；

（5）熒光顯微鏡，紫外激發(fā)，觀察并計數(shù)。

2.3 結(jié)果與討論

2.3.1 MTT比色法（第一次實驗）

（1）紫杉醇：

（2）阿霉素：

由表4可計算出：不同藥物濃度情況下OD值得變化情

由表5得出曲線如圖2所示。

（3）結(jié)果分析：

由實驗結(jié)果中的96孔板OD值可以看出，紫杉醇和阿霉素藥物處理過后，結(jié)果顯示：96孔板中，平行孔之間的差別較大，不太具有顯著性；且數(shù)據(jù)出現(xiàn)了0甚或是負值，數(shù)據(jù)不甚合理。

對所得數(shù)據(jù)進行處理，用所使用的藥物濃度及相對應的平均OD值列出表格并繪制關(guān)系曲線，所得曲線如圖所示，紫杉醇和阿霉素的處理結(jié)果變動劇烈均不成規(guī)律，毫無統(tǒng)計學意義。

誤差原因分析：（1）藥物濃度梯度設(shè)計差異過小，加樣槍在小劑量范圍內(nèi)誤差范圍過大，導致實驗結(jié)果各濃度之間的差異不夠明顯；（2）儀器存在一定的誤差，導致在小范圍內(nèi)結(jié)果會產(chǎn)生較大的波動；（3）藥物處理時間過長，細胞死亡數(shù)量過多，存活數(shù)量過少，OD值之間變化不明顯；（4）排槍的誤差較大，在加樣是會產(chǎn)生一些誤差，導致結(jié)果產(chǎn)生波動。

綜上所述，本次實驗結(jié)果較為失敗，因此決定重做本實驗。

2.3.2 MTT比色法（第二次實驗）

（1）紫杉醇：

由表6、表7得出曲線如圖3所示。

（2）阿霉素：

由表8可計算出：不同藥物濃度情況下OD值得變化情況。

由表9得出曲線如圖4所示。

（3）結(jié)果分析：

由實驗結(jié)果中的96孔板OD值可以看出，紫杉醇和阿霉素藥物處理過后，結(jié)果顯示：96孔板中，平行孔之間數(shù)值比較接近，具有顯著性；數(shù)據(jù)合理清晰。

對所得數(shù)據(jù)進行處理，用所使用的藥物濃度及相對應的平均OD值列出表格并繪制關(guān)系曲線，所得曲線如圖所示，紫杉醇和阿霉素的處理結(jié)果藥物濃度與OD值之間成線性關(guān)系，清晰明了，符合規(guī)律，具有極強的統(tǒng)計學意義以及數(shù)學計算意義。

因此可由實驗結(jié)果進行進一步的計算：

IC50（紫杉醇）=10.97μg/ml

IC50（阿霉素）=12.53μg/ml

由計算結(jié)果可知：紫杉醇的IC50濃度大致合理，但是阿霉素的IC50濃度偏高，與理論值不合，分析原因可能為：（1）所用藥物稀釋時稀釋倍數(shù)有所誤差，導致結(jié)果不合理論；（2）所用標準藥物的濃度與老師告知的濃度不符，導致結(jié)果誤差較大。

3 細胞周期時相及藥物對細胞核的影響

所有染色細胞統(tǒng)一由PI和Ho.33342雙染色，其中PI可以通過嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光，將細胞核染成紅色，但由于PI不能穿透活細胞膜，因此只能染色死細胞；Ho.33342能在不殺死細胞的前提下，將細胞核染成藍色，因為它是少數(shù)的能直接穿透細胞膜的染劑。結(jié)合PI-Ho.33342雙染的結(jié)果，能展示阿霉素和紫杉醇對細胞核的影響，從而得出這兩種藥物對細胞周期的影響。

阿霉素可抑制RNA和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強，抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺傷作用，其作用機理主要是嵌入DNA而抑制核酸的合成。

紫杉醇粗提取物在篩選實驗被發(fā)現(xiàn)對離體培養(yǎng)的鼠腫瘤細胞有很強的抑制活性。它能阻斷微管的形成，具有周期依賴性。

3.1 阿霉素對細胞核的影響

用PI和Ho.33342染色細胞核經(jīng)過熒光顯微鏡顯色后的影像如圖（添加阿霉素的實驗細胞如A圖，未添加阿霉素的對照組細胞如B圖）。無論是對照組還是實驗組的細胞，都有藍色和紫紅色兩種染色區(qū)域，但可以明顯看出，對照組的細胞活力要明顯好于實驗組。原因是，阿霉素能抑制DNA和RNA的合成，是廣抗瘤的周期作用藥物，施用了這種抑制型藥物，癌細胞的活力明顯減弱，并且在本次實驗中，阿霉素的濃度過高，超過了普遍得出的阿霉素對于823細胞的IC50值，阿霉素對細胞的傷害更廣更大。

同時，染色的紅色越深，表示細胞膜破損越嚴重，PI進入細胞核的量越多，意味著壞死的細胞較多，而圖中也有細胞核藍色但核形態(tài)不健康的個體，這可能是即將凋亡的細胞，但由于其細胞膜的通透性還保持，因此PI不能進入。

由圖可見，加入阿霉素后，細胞密度降低，對比同體積對照組細胞密度，可以推測阿霉素阻礙了細胞的增殖能力，使得細胞數(shù)量減少，新細胞不能產(chǎn)生；同時，加入阿霉素藥物后，細胞活力減弱，死亡和不健康的細胞比例明顯提高。因此可以推測阿霉素對細胞生長確實有負面作用，能造成細胞的增殖抑制和死亡。

3.2 紫杉醇對細胞核的影響

用PI和Ho.33342染色細胞核經(jīng)過熒光顯微鏡顯色后的影像如圖（添加紫杉醇的實驗組細胞如C圖，未添加紫杉醇的對照組細胞如D圖）。都有藍色和紫紅色兩種染色區(qū)域，原因是，紫杉醇能抑制微管的合成，而微管的形成直接關(guān)聯(lián)細胞中心體的形成，因此施用了這種抑制型藥物，癌細胞的活力明顯減弱。

由圖可見，加入紫杉醇后，細胞密度降低，對比同體積對照組細胞密度，可以推測紫杉醇阻礙了細胞的增殖能力，使得細胞數(shù)量減少，新細胞不能產(chǎn)生，可能和紫杉醇對細胞增殖的影響有關(guān)；同時，加入紫杉醇藥物后，細胞活力減弱，死亡和不健康的細胞比例明顯提高。因此可以推測紫杉醇對細胞生長確實有負面作用，能造成細胞的增殖抑制和死亡。

4 結(jié)語

本次實驗利用MTT法得出IC50值后，用此濃度的藥物作用于腫瘤細胞，得到了較明顯的抑制效果。但本次實驗只是對抗腫瘤藥物對腫瘤細胞抑制效果的初探究，現(xiàn)我國癌癥形勢嚴峻，發(fā)病率和死亡率逐年提升，研究開發(fā)出經(jīng)濟有效的抗癌藥物刻不容緩。希望通過本次實驗，我們能對抗癌研究有初步了解，也希望我國的抗腫瘤研究之路走得更遠。

參考文獻

[1]張云，閆世風，趙桂森.紫杉烷類藥物抗癌作用機制的研究進展[J].齊魯藥事，2007，（09）： 548.

[2]王洪波，李洪燕，方唯碩，陳曉光.紫杉烷類衍生物Lx2-32c對人卵巢癌A2780細胞的抑制作用[J].中國新藥雜志，2008，（10）：883-884.

[3]梁艷琴，鄧聯(lián)東，邢金峰，董岸杰.用于腫瘤靶向介入治療的聚酸酐納米原位凝膠給藥系統(tǒng)[A].天津市生物醫(yī)學工程學會第30次學術(shù)年會暨生物醫(yī)學工程前沿科學研討會論文集[C]. 2010.

[4]劉媛媛，王銀松，張寧.肝腫瘤靶向的基因/藥物納米共載體系的研究[A].天津市生物醫(yī)學工程學會第三十四屆學術(shù)年會論文集[C].2014.