周生爍

摘 要：在石油污染日益嚴(yán)重的今天，針對高效降解石油方法的研究處于前言，其中生物法降解石油因其環(huán)境污染小、投入成本低以及降解效率高是目前石油降解的首選方法。本人對生物法降解石油做一些介紹，并介紹了目前仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段的基因工程石油降解菌。

關(guān)鍵詞：石油降解；生物法；基因工程

中圖分類號(hào)：Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2017）22-0009-02

石油作為重要化石能源，是工業(yè)發(fā)展必要的能源物質(zhì)。但自上個(gè)世紀(jì)以來，石油運(yùn)輸過程中泄露、石油加工生產(chǎn)工程中產(chǎn)生的廢棄物等進(jìn)入環(huán)境，對水體、土壤造成了嚴(yán)重的危害，進(jìn)而對人類本身的健康造成不良影響。

石油作為重點(diǎn)監(jiān)控的污染物來源之一，其本身就具有致突變、致癌、致畸的毒性，而且其所含污染物的種類繁多，不同的成分對環(huán)境的污染程度不同，且降解和清除的方法不一樣。石油作為污染物的主要表現(xiàn)在如下方面：

（1）污染水體。例如海上泄露的原油，其成分種中的芳香烴會(huì)在水面形成一層油膜，阻止水體與空氣中氧氣的交換，導(dǎo)致水中生物的死亡，從而破壞了水中的生態(tài)環(huán)境。污染地下水會(huì)直接對居民的健康造成威脅。

（2）污染土壤。石油中的某些成分嵌入突然會(huì)造成土壤的黏連性、滲水性的變差以及阻礙空氣的流通性，不利于土壤上植被的存活，以及土壤中微生物的生存，對生態(tài)系統(tǒng)造成破壞。

（3）石油中的芳香類物質(zhì)能對人類和動(dòng)物的機(jī)體產(chǎn)生較大的毒性。進(jìn)入人體或動(dòng)物體中的多環(huán)芳香烴會(huì)造成腎臟和肝臟等的損傷，而且還具有“三致”毒性。高分子烴和低分子烴會(huì)形成一層油膜覆蓋在植物的表面，隔絕植物與空氣中的氣體交換以及水分蒸發(fā)，而且石油中的低碳化合物能夠直接進(jìn)入植物機(jī)體破壞其內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)，從而影響植物的代謝和機(jī)能。

1 石油降解原理

1.1 石油降解方法

目前降解時(shí)候的方法包括生物法、物理法以及化學(xué)法。其中物理以及化學(xué)法降解石油能夠起到一定的作用，但只能作為處理石油污染的輔助手段來使用，原因有：物理、化學(xué)法處理成本耗費(fèi)太高、很容易造成二次污染。與此同時(shí)，生物法處理石油污染，不會(huì)存在二次污染的問題，相對于化學(xué)法和物理法，生物法對環(huán)境友好，效率高而且投入成本低，是目前一種重要且被給予厚望的石油污染處理方法。

石油一般由鏈狀烷烴、環(huán)狀烷烴、芳香烴、樹脂以及瀝青質(zhì)組成。其中短鏈的鏈狀烷烴可以通過會(huì)發(fā)作用進(jìn)入到大氣，剩下的成分中，長的鏈狀烷烴以及環(huán)狀烷烴容易被降解，其次是分子量較低的芳香烴，多環(huán)芳烴被降解的難度很大，而樹脂和瀝青質(zhì)則是極難被降解。

1.2 生物法降解石油的原理

生物法降解石油的原理是，微生物能利用石油成分中的烴類作為自身的能源物質(zhì)，通過體內(nèi)一系列酶促反應(yīng)介導(dǎo)的氧化、還原以及合成、分解等過程將石油中的碳?xì)浠衔镛D(zhuǎn)化成為二氧化碳、水等無機(jī)物。不同石油成分被降解的原理不一樣，烷烴的降解方式包括雙末端氧化、單末端氧化以及亞末端氧化三種。其中雙末端氧化和單末端氧化是主要的降解方式，單末端氧化是指在微生物的單末端氧化酶的作用下將烷烴鏈的一個(gè)末端氧化成為醇，并進(jìn)一步氧化成醛類物質(zhì)，再進(jìn)一步氧化成脂肪酸，最后形成的脂肪酸能通過三羧酸循環(huán)被當(dāng)做能源物質(zhì)利用。雙末端氧化主要針對的是帶分支的烷烴，在非專一羧基酶的作用下將雙鏈的末端同時(shí)氧化成二羧基酸，再在兩端進(jìn)行β-氧化之后，進(jìn)入到三羧酸循環(huán)中。

芳香烴的降解機(jī)制有很多種，在細(xì)菌和真菌中降解的機(jī)制不一樣，而在不同的細(xì)菌中降解的機(jī)制也不一樣，相對于烷烴的降解，芳香烴的降解難度更大，在各種不同的降解機(jī)制中都需要分子氧的加入以及加氧酶的參與。在細(xì)菌中，在加氧酶的催化作用下，分子氧加入到芳香烴中，生成的物質(zhì)在相關(guān)酶的作用下裂解生成鄰苯二酚。

2 降解石油的微生物

在自然界中能夠降解石油污染的微生物種類繁多，而對于生物法治理石油污染的主要微生物研究對象是細(xì)菌。

治理石油污染的細(xì)菌一般是在從污染的區(qū)域篩選出來的自然界中本來就存在的細(xì)菌或者是經(jīng)過人工改造的工程菌。環(huán)境中的諸多因素都會(huì)影響細(xì)菌降解石油的能力，其中包括溫度、濕度、含氧量、酸堿度、鹽度以及壓力等等。這些因素不僅影響細(xì)菌的數(shù)量還會(huì)對細(xì)菌體內(nèi)的代謝途徑造成影響從而影響細(xì)菌對石油中各成分中的利用情況。

細(xì)菌降解石油的能力源于體內(nèi)一系列的代謝酶，而有些編碼石油降解相關(guān)的代謝酶存在在細(xì)菌的質(zhì)粒上。質(zhì)粒是細(xì)菌體內(nèi)獨(dú)立于染色體存在的大多數(shù)是環(huán)狀的少數(shù)是現(xiàn)狀的DNA分子，能自主復(fù)制穩(wěn)定遺傳給下一代，是基因工程中常用的載體。有研究表明將帶有降解不同石油組分的代謝酶基因的質(zhì)粒導(dǎo)入到一種細(xì)菌株里面，通過選擇培養(yǎng)，這些天然質(zhì)粒在細(xì)胞株穩(wěn)定存在且表達(dá)相關(guān)的代謝酶，從而選育中良好的石油降解的新菌株。

3 基因工程菌

目前投入石油降解領(lǐng)域使用的細(xì)菌大部分是從相關(guān)環(huán)境中篩選得到的。為了解決單一菌種無法有效降解石油中不同成分的問題，實(shí)際中一般使用混合菌種，但這些菌種因?yàn)橛懈髯缘膶I養(yǎng)的需求，在使用過程中菌種之間會(huì)發(fā)生競爭、抑制，導(dǎo)致了不同菌種的組成比例較之前的配比發(fā)生變化。為了解決這些問題，構(gòu)建高效的基因工程菌很有必要。

目前基因工程菌已經(jīng)在人工實(shí)驗(yàn)條件下表現(xiàn)出良好的石油降解能力。已有研究表明，美國的研究者將帶有CAM、NAH、OCT、XAL的4種石油降解質(zhì)粒導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)，形成了一種“多質(zhì)粒超級(jí)菌”該細(xì)菌能大大地縮短石油在海面上被降解的時(shí)間。

目前在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建降解石油的基因工程菌有大致相同的流程：

（1）從油田或者是石油污染的區(qū)域分離出多種可降解石油的菌種，再從其中篩選出降解效果最好的菌株。

（2）分析鑒定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位使用的方法包括形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測試、抗性的測試以及16SrRNA基因序列同源性分析等。同時(shí)對其生長特性、環(huán)境影響因素以及對石油的中各組分的降解效果進(jìn)行研究。例如研究表明該菌株對芳香烴的降解能力較弱。

（3）取已知的芳香烴降解菌株經(jīng)行其降解能力的測試以及加氧酶活的檢測。通過一些的實(shí)驗(yàn)手段，包括酶學(xué)研究、PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒的敲除等等確定降解芳香烴的相關(guān)酶，針對該酶的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序。在大腸桿菌中表達(dá)該酶，對其進(jìn)行進(jìn)一步的定位以及含量的研究。

（4）將編碼相關(guān)降解酶的基因重組到自殺質(zhì)粒上形成重組質(zhì)粒，自殺質(zhì)粒帶有某段自殺基因能在非指定底物或者是非指定環(huán)境中不能生存生長。并將重組質(zhì)粒通過DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)導(dǎo)入之前篩選出來的細(xì)菌中，形成基因工程菌。

（5）通過對工程菌的生長特性、底物降解的特異性以及酶活性、遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性等等因素進(jìn)行研究，直至該工程菌具有降解石油中不同組分且效率較高的效果，同時(shí)其生長特性沒有發(fā)生很明顯的改變。

（6）制備工程菌菌劑，在實(shí)驗(yàn)室中模擬石油污染的環(huán)境修復(fù)過程，了解在污染區(qū)域的環(huán)境條件下，工程菌的降解效率如何。

4 前景與展望

鑒于對環(huán)境的破壞很小而且能永久地清除污染物的同時(shí)不帶來二次污染，使用的經(jīng)濟(jì)成本低，生物法治理石油污染是以后該領(lǐng)域的必然趨勢。但目前對高分子多環(huán)芳烴以及瀝青質(zhì)的降解依然是難以攻克的難題，未來的研究方向可以朝尋找該類石油降解基因方向發(fā)展。此外，在實(shí)驗(yàn)室研究相對成熟的基因工程菌還未投入到壞境中使用主要是存在如下安全隱患：

（1）工程菌細(xì)胞內(nèi)帶有的抗生素基因會(huì)導(dǎo)致廣泛的耐藥菌出現(xiàn)。

（2）工程菌攜帶的致病因子在環(huán)境中傳播，后果嚴(yán)重。所以在真正將基因工程菌投入到環(huán)境中使用之前，需要慎重的考慮，同時(shí)應(yīng)該應(yīng)用一些新的方法，例如加入一段自殺基因等使其完成任務(wù)后自動(dòng)消失，解決安全隱患。

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