鄭雨婷,王夢馨,崔 林,韓善捷,俞鵬飛,韓寶瑜

中國計量大學(xué)浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室, 杭州 310018

基于EPG技術(shù)分析茶樹品種對茶小綠葉蟬的抗性及其相關(guān)的抗性物質(zhì)

鄭雨婷,王夢馨,崔 林,韓善捷,俞鵬飛,韓寶瑜*

中國計量大學(xué)浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室, 杭州 310018

為深入探討假眼小綠葉蟬在茶樹上的刺探行為,進而篩選合適的刺探電位(electrical penetration graph, EPG)參數(shù)作為評判茶樹抗感性指標,遂比較紫鵑、寧波黃金芽和黃觀音等11個國家級和特色茶樹良種對該葉蟬抗感性,并解析茶樹抗感性與主要化學(xué)成分的相關(guān)性。使用刺探電位儀檢測了該葉蟬在這11個茶樹品種上的多種刺探行為及其參數(shù)、以聚類分析等方法解析各品種上EPG參數(shù)而判斷每品種對于葉蟬的抗感性；再以HPLC檢測茶葉主要成分,分析抗感性與化學(xué)成分的關(guān)聯(lián)程度。結(jié)果如下：(1)進一步明確了代表該葉蟬在茶樹上取食行為的7種EPG波形及其可能的生物學(xué)意義,即Np、A、S、C、E、F和R波,解析了各種波形的特征和出現(xiàn)規(guī)則,認為E波、F波以及未確定生物學(xué)意義的R波是抗性相關(guān)波。(2)在5h測試期間,葉蟬在黃觀音和龍井43品種上的刺探次數(shù)最多,紫鵑、寧波黃金芽和金觀音上的次之,鐵觀音和安吉白茶上的最少；E波平均持續(xù)時間在鐵觀音和黃牡丹上最長,烏牛早和安吉白茶上次之,紫鵑上最短；F波平均持續(xù)時間在黃觀音上最長,紫鵑、龍井43和寧波黃金芽上次之,金觀音上最短。(3)以刺探次數(shù)、韌皮部取食波E波歷期、韌皮部取食困難波F波歷期為指標,將11個品種聚為2類,即第Ⅰ類：安吉白茶、烏牛早、紫牡丹、中茶108、黃牡丹和鐵觀音；第Ⅱ類為黃觀音、龍井43、紫鵑、寧波黃金芽和金觀音；抗性強弱為：第Ⅱ類>第Ⅰ類。(4)從感性至抗性品種,兒茶素類含量明顯升高,且兒茶素總量與E波歷期顯著負相關(guān)(P0.05)；咖啡堿、氨基酸和可溶性糖含量皆未與E波、F波歷期明顯相關(guān)。認為：E波和F波歷期以及刺探次數(shù)可作為茶樹抗感性的主要參數(shù)；R波可能與韌皮部取食抗性相關(guān)；兒茶素類是抗性相關(guān)物質(zhì)。研究可為深入探討茶樹抗蟲機理提供參考。

假眼小綠葉蟬；茶樹；取食行為；EPG；抗蟲性

假眼小綠葉蟬Empoascavitis(G?the)(半翅目,葉蟬科)是我國大陸茶園最重要的害蟲,成、若蟲刺吸茶樹嫩芽、嫩葉和嫩莖的汁液,雌成蟲產(chǎn)卵于嫩莖皮層,注入酶類于茶樹莖葉,影響芽葉生理生化代謝以及營養(yǎng)物質(zhì)的正常運輸,致芽葉失水凋萎、葉脈暗紅、葉緣葉尖卷曲、葉片紅褐焦枯,以至于脫落。常年致茶葉減產(chǎn)10%左右,嚴重時可達30%以上或超過50%[1]。幾十年來主要依靠化學(xué)防治,雖有效控制假眼小綠葉蟬的發(fā)生和為害,但其已對吡蟲啉、聯(lián)苯菊酯和啶蟲脒等化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生顯著抗性[2]。業(yè)界估測,約有40%的茶園施藥量是用于防治假眼小綠葉蟬的。大量的施藥時常造成茶葉農(nóng)殘超標,影響健康飲用。為減少化學(xué)農(nóng)藥施用量,可充分利用茶樹自身所具有的形態(tài)抗性、抗生性和耐害性等御蟲機制。我國茶樹種質(zhì)資源豐富,不乏抗性品種,曾莉等[3]鑒定了西雙版納國家茶樹種質(zhì)資源圃30份茶樹種質(zhì)對假眼小綠葉蟬的抗性,發(fā)現(xiàn)茶樹抗性與葉片葉肉厚度、上表皮細胞數(shù)、柵欄組織厚度和海綿組織厚度皆呈負相關(guān)。黃亞輝等[4]也報道,茶梢上假眼小綠葉蟬蟲口密度與茶樹葉片柵欄組織厚度、海綿組織厚度、主脈下方表皮厚度和主脈下方厚角組織厚度呈極顯著負相關(guān)。即茶樹形態(tài)具有抗葉蟬性能,而抗生性也是植物抗蟲性重要性能,涉及的機理更為復(fù)雜,需進一步深入探討。

刺探電位技術(shù)(electrical penetration graph,EPG)是一項用于研究刺吸式口器害蟲在寄主植物上取食行為的電生理技術(shù),它能夠?qū)⒗ハx口針在抗、感性植物組織內(nèi)的取食活動轉(zhuǎn)化為可視電信號,準確記錄昆蟲口針在植物組織中的刺探行為和位置[5- 6]。EPG作為抗蟲性的輔助研究手段,近20—30年在國際植保領(lǐng)域取得了長足進展,研究對象已從蚜蟲擴展到粉虱、薊馬、葉蟬和盲蝽等大多數(shù)刺吸式昆蟲[7- 9]。研究內(nèi)涵不斷拓展,從基礎(chǔ)波形的定義、生物學(xué)意義鑒定直至應(yīng)用,Miranda等[10]、Zeng等[11]、Cameron等[12]利用EPG探究了各種殺蟲劑對各類昆蟲在其寄主植物取食上的影響,發(fā)現(xiàn)殺蟲劑皆能減弱昆蟲的取食行為,但不同殺蟲劑減少昆蟲取食程度存在差異。Lei等[13]、Zhao等[14]利用EPG技術(shù)研究了攜帶病毒植物對刺吸式昆蟲取食的影響。而1970年Crane則最早應(yīng)用EPG技術(shù)研究了葉蟬HordniacircellataBaker的取食行為,隨后研究者們相繼對葉蟬科昆蟲取食行為進行了細致的探究[15-18]。苗進等[19- 20]參考葉蟬等其他刺吸式取食昆蟲的波形,首次探討了假眼小綠葉蟬在茶樹新梢上刺探電位波形的類型及其與刺探取食行為之間的對應(yīng)關(guān)系,明確其取食波為A、E、C、F、R、S和非刺探波NP等7種波形。金珊等[21- 22]利用EPG技術(shù)結(jié)合體視顯微鏡和口針切片技術(shù),鑒定得到的假眼小綠葉蟬取食波形為E1、E2、E3、E4、E5和E6波,分別對應(yīng)A、E、C、F、R和S波。

在假眼小綠葉蟬波形特征和生物學(xué)意義鑒定的基礎(chǔ)上,苗進等[19- 20]、金珊等[21- 22]和劉麗芳等[23]基于EPG技術(shù)評判了數(shù)種茶樹品種對假眼小綠葉蟬感、抗性,其結(jié)果與田間葉蟬蟲口密度大小基本一致,支持了EPG技術(shù)檢測茶樹抗蟲性的可信性。然而,我國茶樹種植資源已記載3000多份,已有的少量茶樹品種(系)的抗蟲性報道主要是調(diào)研了品種之間蟲口密度差異,很少涉及茶葉化學(xué)組成,關(guān)于茶樹抗蟲性與EPG波形的相關(guān)性未見報道。本研究以現(xiàn)階段全國廣泛推廣的11個國家級茶樹良種和特色良種為試驗材料,利用EPG技術(shù)解讀假眼小綠葉蟬在這些品種上的取食行為,進而評定茶樹品種抗、感性差異,再檢測茶葉化學(xué)組成,探析抗感性與化學(xué)組成的關(guān)系,為深入研究茶樹抗蟲性提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

將假眼小綠葉蟬雌、雄成蟲配對接種于中國計量大學(xué)實驗茶園的盆栽茶樹上,罩上60目養(yǎng)蟲籠以防其逃逸。葉蟬產(chǎn)卵于茶樹嫩枝上,遂剪取1芽7葉茶枝水培于人工氣候箱,箱內(nèi)溫度(25±2)℃,相對濕度75%±5%,光照L∶D=14∶10。待茶枝上卵孵化為若蟲,繼續(xù)觀測其發(fā)育,選擇生長一致的3齡若蟲用于EPG試驗。

1.2 供試茶樹品種

選用單行條植于中國計量大學(xué)試驗茶園中的鐵觀音、金觀音、黃觀音、紫牡丹、黃牡丹、龍井43、安吉白茶、寧波黃金芽、紫鵑、中茶108和烏牛早等11個茶樹良種,試驗時剪取健壯的1芽4葉茶枝,插入培養(yǎng)缽中,引入供試的3齡葉蟬于其上。

1.3 EPG技術(shù)記錄和各種波形的統(tǒng)計分析

1.3.1 EPG記錄

采用Tjallingii設(shè)計的DC-EPG Giga- 8型EPG記錄儀。將假眼小綠葉蟬3齡若蟲和供試茶樹嫩枝分別與生物電流放大器的昆蟲電極和植物電極相連。昆蟲電極是一段長3—4cm、直徑18.5μm的金絲。粘連昆蟲時,先將培養(yǎng)皿放在冰袋上,放入假眼小綠葉蟬3齡若蟲,迅速蓋上皿蓋,待葉蟬不動時用毛筆輕輕調(diào)整葉蟬位置,使其背部朝上。金絲端部蘸少量銀膠,形成銀膠滴,粘接葉蟬中胸背板。粘接之后,讓葉蟬在葉片上自由活動,饑餓1h,再小心地將連有葉蟬若蟲的昆蟲電極插入放大器的輸入探頭,輕輕地將假眼小綠葉蟬接到芽下第二葉背面。由于金絲柔軟,葉蟬可在一定范圍內(nèi)自由活動。將植物電極插入栽有1芽4葉鮮嫩茶梢的盆缽基質(zhì)中。當昆蟲口針刺入植物組織時,則回路閉合,回路電流經(jīng)AD轉(zhuǎn)換器放大、轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號保存于電腦內(nèi),經(jīng)Probe 3.0軟件轉(zhuǎn)化為波形圖譜輸出,顯示在電腦屏幕上,供研讀并轉(zhuǎn)換為可供統(tǒng)計的數(shù)字文件。

1.3.2 統(tǒng)計分析

葉蟬在每個品種上的取食行為連續(xù)記錄5h,每次同時測試8頭,試驗皆在室溫(25±2)℃下進行。參照前人研究,確定與假眼小綠葉蟬取食相關(guān)波形。統(tǒng)計分析時選其中10頭供試葉蟬EPG圖譜,分析供試葉蟬在每個品種上的每種波形歷期、刺探次數(shù)。對品種之間取食相關(guān)波形(E、F、A、S、C和R波)歷期、非取食波(Np波)歷期、以及刺探次數(shù)分別作差異性檢驗；以E波歷期、F波歷期和刺探次數(shù)作為參數(shù),將11個品種作為實體進行聚類分析,先評判“類”之間抗感性差異,再基于取食相關(guān)波形(E波、F波)歷期、刺探次數(shù)評判“類”內(nèi)的品種之間抗感性差異,進而對11個品種的抗感性排序。

1.4 茶葉理化成分檢測及其與抗性的相關(guān)性分析

1.4.1 儀器及試劑

HPLC由美國Agilent公司制造,型號為Agilent1260。所用乙腈、甲醇為色譜純,醋酸鈉、三乙胺、乙醇、氧化鎂和鹽酸為分析純；PITC購自Aladdin公司,純度標示量為98.0%；純凈水為Milli-Q純水。

咖啡堿、兒茶素、茶氨酸和17種氨基酸標樣購自Agilent公司,17種氨基酸混合標準品包括天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)和賴氨酸(Lys)。兒茶素標樣包括：兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)。

1.4.2 茶葉主要理化成分檢測

5月上旬假眼小綠葉蟬盛發(fā)時采摘供試茶樹品種的1芽2葉,制成蒸青茶樣,裝入塑封袋置于-20 ℃冰箱備用。測定生化成分時根據(jù)具體分析方法取出適量樣品進行相應(yīng)的前處理。

可溶性糖測定：稱取0.2g茶粉放入試管中,注入10mL蒸餾水,在沸水浴上加熱提取可溶性糖類。提取液冷卻后在3000r/min下離心30min,將上清液即粗提液稀釋10倍后以蒽酮比色法測定可溶性糖含量。重復(fù)5次,計算平均值。

氨基酸測定：稱取2.0g茶粉置于具磨口塞的錐形瓶中,加入75mL去離子水,蓋好瓶蓋,沸水浴浸提1h。吸取6mL提取液,在2000r/min下離心5min。吸取2mL上清液用0.45μm濾膜過濾。吸取600μL濾液于2.0mL的EP管中,加入0.2mol/L PITC-乙腈溶液以及1mol/L三乙胺-乙腈溶液各200μL,輕搖,再用渦旋器振蕩1min以便混勻。室溫下靜置lh,加入400μL正己烷,渦旋震蕩1min后靜止30min,取下層溶液進HPLC測定氨基酸含量。重復(fù)5次,計算平均值。

分析氨基酸的色譜條件：色譜柱為PhenomenexLuna C18 色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),柱溫為43℃。流動相A:V[0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液(以醋酸調(diào)pH6.5) ]∶V(乙腈)=93∶7；流動相B∶V(乙腈):V(水)=4∶1。流動相經(jīng)0.45μm濾膜過濾。梯度洗脫：0—20min,0—4%B；20—21min,4%—20%B；21—40min,20%—22%B;40—41min,22%—30%B；41—46min,30%—100%B;46—48min,100% B;48—53min,100%—0B；53—60min,0%B。流速：1.0mL/min。檢測波長為254nm；進樣量20μL。

兒茶素含量測定：稱取0.2g茶粉,放入試管中,加入50%甲醇溶液9mL,30s渦旋混勻后,常溫下超聲10min,3000r/min下離心10min,取上清液用EDTA溶液稀釋10倍后經(jīng)0.45μm濾膜過濾,濾液用于HPLC測定兒茶素含量。重復(fù)5次,計算平均值。

檢測兒茶素的色譜條件：色譜柱為PhenomenexLuna C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),柱溫為30℃。流動相A∶V(乙酸)：V(乙腈)=1∶999；流動相B∶乙腈。流動相經(jīng)0.45μm濾膜過濾。梯度洗脫：0—30min,0%B—15%B；30—40min,15%—25%B；40—50min,40%—60%B。流速∶0.5mL/min。檢測波長為278nm；進樣量為20μL。

咖啡堿按照國標8312—2013方法測定[24]。

1.4.3 茶葉主要理化成分與抗性的相關(guān)性分析

可溶性糖、氨基酸、兒茶素和咖啡堿是茶葉主要成分,分析這4類物質(zhì)的含量分別與供試葉蟬若蟲在不同品種上刺探次數(shù)、韌皮部取食波(E波)平均歷期和韌皮部困難波(F波)平均歷期的相關(guān)性。用DPS軟件完成相關(guān)計算[25]。

2 結(jié)果和分析

2.1 假眼小綠葉蟬刺吸波形的特征及其出現(xiàn)規(guī)則

本研究得到7種主要波形及特征如圖1,與苗進等[19- 20]金珊等[21- 22]鑒定的相似。本研究參照苗進等的方法命名波形(圖1、圖2),并詳細地觀察了各種波形出現(xiàn)的規(guī)則：

(1)Np波：非刺探波；A波：路徑波；S波：口針向韌皮部刺探和進入韌皮部的唾液分泌波；C波：口針到達韌皮部前的主動取食波；E波：韌皮部取食波；F波：取食困難波；R波：休息波。Np波是葉蟬口針刺探葉片前的一段平直波,在電壓為0的基準線上,此時葉蟬若蟲在葉片表面走動但不引起電壓變化(圖1)。

圖1 假眼小綠葉蟬在茶樹上取食波形及其頻率Fig.1 EPG waveforms and frequency of E.vitis feeding on tea cultivarsNp波：非刺探波；A波：路徑波；S波：口針向韌皮部刺探和進入韌皮部的唾液分泌波；C波：口針到達韌皮部前的主動取食波；E波：韌皮部取食波；F波：取食困難波；R波：休息波

(2)分析發(fā)現(xiàn),在葉蟬口針刺透葉片之前,許多茶樹品種上葉蟬刺吸的EPG圖譜只是振幅很低的雜亂波形,持續(xù)時間通常少于30s。在葉蟬每次取食過程中,通常以A波開始和結(jié)束,其頻率范圍為0—1Hz,主頻為0.5Hz。S波緊隨A波之后或出現(xiàn)在E波和F波之間,頻率范圍0—9Hz,主頻為0—1Hz。C波在E波之前出現(xiàn),持續(xù)時間短,主頻為5—6Hz,次頻為10—11Hz,振幅大,波形有規(guī)律。E波每次持續(xù)時間長短不一,主頻為4—5Hz,次頻為9—10Hz,振幅和頻率皆低于C波,波形成鋸齒狀。F波通常出現(xiàn)在E波之后,頻率混雜,主頻為4—5Hz,次頻為0—1Hz,F波的波形在不同茶樹品種上略有差異。R波則在F波之后出現(xiàn),頻率混雜,主頻為0—1Hz,波形多樣,通常是平緩的線條。在本研究中,F波經(jīng)常與E波或R波交錯出現(xiàn)。而R波隨F波出現(xiàn),主要以兩種模式出現(xiàn)：一是與F波交錯出現(xiàn)(圖2),二是保持一條平直的波形緩慢下降到口針撥出。此外,在F波與R波交錯過程中還觀察到F-R的過渡波形(圖1),波形似F波與R波的結(jié)合,頻率混雜,主頻為0- 5Hz。假眼小綠葉蟬一次完整刺探波形基本模式為：Np-A-S-C-E-F-(E-F)R-(F-R)A-Np,非完整取食波形基本模式有：Np-A-Np,Np-A-S-C-E-A-Np,Np-A-E-S-F-R-Np,Np-A-E-F-E-F-R-A-Np等。

圖2 F-R過渡波及其頻率和E、F、R波轉(zhuǎn)換Fig.2 F-R Transition waveform with its frequency and transition among waveforms E, F and R

2.2 假眼小綠葉蟬在不同茶樹品種上取食行為的差異

供試葉蟬在11個茶樹品種上各種波形歷期占總記錄時間百分率如圖3,刺探次數(shù)和各種波形歷期如表1。黃觀音和龍井43上的刺探次數(shù)最多；紫鵑、寧波黃金芽和金觀音上的次之；鐵觀音和安吉白茶上刺探次數(shù)最少,皆少于30次。鐵觀音和黃牡丹上E波的平均持續(xù)時間最長,皆超過50min,分別占整個測試時間的17.29%和17.01%,烏牛早和安吉白茶的次之,紫鵑的最短、僅占6.30%。黃觀音上F波平均持續(xù)時間最長,占整個測試時間的17.66%,紫鵑、龍井43和寧波黃金芽上F波平均持續(xù)時間次之,金觀音上F波平均持續(xù)時間最短、只占6.06%。Np波在11個供試品種上的歷時最長,金觀音品種上的非刺探波(Np波)歷時最長,黃觀音的最短,分別占總記錄時間的65.38%和40.62%,兩者間差異達到顯著水平(P0.05)。路徑波A波占整個測試時間的百分率：黃觀音和紫鵑上的最大,分別是15.86%和15.80%,龍井43(13.00%)和金觀音(11.7%)次之,皆顯著高于黃牡丹(6.98%)和鐵觀音(5.36%)。R波占整個測試時間的百分率：寧波黃金芽和中茶108上分別為21.37%和19.03%,顯著大于金觀音(3.81%)和黃牡丹(3.55%)。比較發(fā)現(xiàn)：(1)黃觀音、龍井43、金觀音和紫鵑刺探次數(shù)多、路徑刺探波時間長；(2)非韌皮部取食總的刺探時間(路徑波、唾液分泌波和休息波之和)以紫鵑(34.13%)、黃觀音(33.91%)和寧波黃金芽(33.26%)最長,鐵觀音(13.64%)和黃牡丹(11.74%)最短；(3)韌皮部取食時間(取食波E波和取食困難波F波之和)以黃牡丹、黃觀音和鐵觀音最長,分別占25.09%、24.90%和24.88%,金觀音最短,只占13.29%,方差分析顯示四者間差異達到顯著水平(P<0.05)。

圖3 假眼小綠葉蟬7種EPG波形歷期在11個茶樹品種上占5h測試時間百分率Fig.3 The percentage of 7 EPG waveforms′ average duration of E.vitis on each of 11 tea plant cultivars during 5 hoursa：紫鵑；b：龍井43；c：寧波黃金芽；d：黃觀音；e：金觀音；f：中茶108；g：紫牡丹；h：安吉白茶；i：烏牛早；j：黃牡丹；k：鐵觀音

2.3 11個供試品種對假眼小綠葉蟬抗感性的聚類分析

假眼小綠葉蟬主要以口針刺透葉肉細胞和吸取汁液而危害茶樹,研究發(fā)現(xiàn)以取食波的歷期長短作為主要指標衡量茶樹抗感性與田間調(diào)查結(jié)果基本一致[19,21-22]。本研究選用假眼小綠葉蟬口針在茶葉上的刺探次數(shù)、在韌皮部取食波E波歷期和韌皮部取食困難波F波歷期等3個參數(shù),先進行標準化轉(zhuǎn)換,消除量綱,再使用類

表1 5 h測試期間假眼小綠葉蟬在11個茶樹品種上的刺探次數(shù)和各波形平均持續(xù)時間

標有不同字母的同一列數(shù)據(jù)(平均差±標準誤)之間的差異達顯著水平(P<0.05)；采用了 Duncan′s 多重比較Np波：非刺探波；A波：路徑波；S波：口針向韌皮部刺探和進入韌皮部的唾液分泌波；C波：口針到達韌皮部前的主動取食波；E波：韌皮部取食波；F波：取食困難波；R波：休息波

圖4 假眼小綠葉蟬在11個茶樹品種上取食行為的類平均法聚類圖Fig.4 Cluster analysis diagram for feeding behavior of E.vitis on 11 tea plant cultivars based on average-linkage cluster method

平均法進行系統(tǒng)聚類,將11個品種歸納為2大類(圖4)。第Ⅰ類：安吉白茶、烏牛早、紫牡丹、中茶108、黃牡丹和鐵觀音等6個品種；第Ⅱ類：黃觀音、龍井43、紫鵑、寧波黃金芽和金觀音等。對這2種類型品種上的EPG相關(guān)參數(shù)進行統(tǒng)計分析(表2)發(fā)現(xiàn)：(1)第Ⅰ類上的葉蟬平均刺探次數(shù)、A波和 F波平均歷期均顯著低于第Ⅱ類(P0.05)；(2)第Ⅰ類上E波歷期和NP波歷期則顯著高于第Ⅱ類；(3)S波、C波和R波在2種類型之間均未達到顯著性差異?？梢?葉蟬在兩類品種之間的取食行為有顯著差異,以第Ⅱ類抗性較強。

若以韌皮部取食波E波歷期和刺探次數(shù)為指標,則11個茶樹品種對葉蟬抗性排序為：紫鵑>龍井43>寧波黃金芽>金觀音、黃觀音>中茶108>紫牡丹>安吉白茶>烏牛早>黃牡丹>鐵觀音。

表2 假眼小綠葉蟬在2類茶樹品種上平均刺探次數(shù)和各波形平均持續(xù)時間

2.4 供試茶樹品種主要化學(xué)成分含量及其與抗性的相關(guān)性

本研究檢測了11個茶樹品種芽梢的兒茶素、咖啡堿、氨基酸和可溶性糖含量(表3),可見每個茶樹品種中EGC和EGCG單體含量高于其他成分,二者之和占總量50%以上；紫鵑、寧波黃金芽和龍井43的兒茶素總量較高,顯著高于紫牡丹的和安吉白茶的(P0.05)；抗性品種的兒茶素總量高于感性品種的。紫鵑和紫牡丹的咖啡堿含量最高,金觀音、烏牛早等品種的次之,顯著高于龍井43和黃觀音的(P0.05)(圖5)。中茶108、紫鵑的可溶性糖含量顯著高于紫牡丹的、黃牡丹的和金觀音的(P0.05)；其他茶樹品種之間可溶性糖含量差異不明顯(圖6)。本研究的11個茶樹品種氨基酸總量占干重2.8%—4.5%(表4),茶氨酸含量最高,脯氨酸次之；比較不同茶樹品種氨基酸含量差異,發(fā)現(xiàn)安吉白茶的氨基酸總量最高,中茶108和烏牛早的次之,皆顯著高于黃牡丹的(P0.05)。

表3 11個茶樹品種中兒茶素含量/(mg/g)

分析各個茶樹品種的化學(xué)成分與EPG抗性指標的相關(guān)性(表5),發(fā)現(xiàn)兒茶素總量與韌皮部取食波(E波)平均歷期呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。兒茶素總量與刺探次數(shù)和韌皮部取食困難波(F波)歷期皆呈正相關(guān),但未達到顯著水平。氨基酸、可溶性糖和咖啡堿含量與EPG韌皮部抗性指標(E、F波歷期)都沒有相關(guān)性。

圖5 11個茶樹品種咖啡堿含量(按含量從高到低排列) Fig.5 Content of caffeine from each of eleven tea cultivars (the order from high low to content)

圖6 11個茶樹品種中可溶性糖含量(按含量從高到低排列) Fig.6 Content of soluble sugar from each of eleven tea cultivars (the order from high to low content)

3 討論

3.1 假眼小綠葉蟬各種EPG波形及其反映的刺吸機理

不同種類的刺吸式害蟲取食策略存有差異,Backus等[26]發(fā)現(xiàn)葉蟬屬取食策略為破損細胞取食,金珊等[21- 22]利用連續(xù)切片和TEM技術(shù)觀察了人工飼料中、以及葉片組織中假眼小綠葉蟬口針取食活動,判定假眼小綠葉蟬取食策略也為破損細胞取食,葉蟬的破損細胞取食策略區(qū)別于蚜蟲的胞間取食策略,其對植物損傷更為嚴重。

在解析假眼小綠葉蟬取食波形的生物學(xué)意義時,本研究主要參考苗進等[19- 20]鑒定的7種波形特征及其生物學(xué)意義,并結(jié)合金珊等[21- 22]的研究,對假眼小綠葉蟬取食波形進行鑒定,還補充了新出現(xiàn)波形的特征。我們在分析過程中發(fā)現(xiàn)：多數(shù)茶樹品種上,在口針刺探前,EPG圖譜呈振幅很低的雜亂波形；金珊等也在Np波中觀察到不規(guī)則的小波；這是假眼小綠葉蟬在取食前對葉片表面的清掃行為。A波頻率和波形特征與苗進等(A波)、金珊等(E1波)相似,金珊等又將E1波細分為E1-A、E1-B和E1-C 3個亞波,履行了1次刺探取食的開始和結(jié)束；A波有時出現(xiàn)在取食中間,A波是假眼小綠葉蟬刺透葉片、開通渠道和破損多細胞的過程。S波為唾液分泌波,頻率和波形特征與苗進等(S波)一致[19- 20],對應(yīng)金珊等E6波[21- 22],通常出現(xiàn)在刺透葉片和韌皮部取食過程中。C波為口針到達韌皮部前的主動取食波；E波為韌皮部被動取食波；通過EPG分析比較,發(fā)現(xiàn)C波持續(xù)時間僅占總測試時間的0.02%—2.39%,遠小于E波的持續(xù)時間和所占比例,與刺吸式昆蟲獲得食物主要通過被動取食,即韌皮部內(nèi)的壓強將汁液推入昆蟲口針結(jié)論一致[27- 28]。F波在已有研究報道中出現(xiàn)不多,其頻率與苗進等F波[19]、金珊等鑒定的E4波描述相似[21],但其波形、持續(xù)時間和出現(xiàn)模式上稍有差異,即本研究F波緊隨E波出現(xiàn),波形復(fù)雜、總持續(xù)時間顯著長于苗進等的F波、金珊等E4波的總持續(xù)時間。Njihia等[29]在組織學(xué)中演示推斷與F波相似的Ib波,Ib波與緩慢移動口針刺透和吸取葉肉細胞漿液行為相關(guān)。Backus等[26]猜測F波代表單細胞刺透,是一種破裂細胞取食行為。由此推測F波產(chǎn)生時口針仍位于韌皮部吸取汁液,但韌皮部中可能存在某種物質(zhì)阻礙假眼小綠葉蟬正常取食,又不至于無法取食。

表4 11個品種茶樹中氨基酸含量/(mg/g)

表5 茶梢主要化學(xué)成分含量與3個EPG抗性指標的相關(guān)性

“**”表示相關(guān)性極顯著(P<0.01),“*”表示相關(guān)性顯著(P<0.05)

R波頻率特征與苗進等R波[20]、金珊等E5波[22]相似,在金珊等研究中E5波不易被觀察到,持續(xù)時間短,出現(xiàn)在E4波(F波)之后；在苗進等研究中R波出現(xiàn)頻率低,持續(xù)時間從幾分鐘到幾小時不等[20, 22]。本研究R波出現(xiàn)頻率較高,跟隨在F波之后,通常以兩種模式跟隨F波出現(xiàn)：一是與F波交錯出現(xiàn),二是保持一條平直的波形緩慢下降到口針撥出；數(shù)據(jù)比對發(fā)現(xiàn),F波總持續(xù)時間長,R波總持續(xù)時間普遍也相對較長,最高可占總測試時間的20%。而且。本研究中還發(fā)現(xiàn)“F-R”過渡波形,由此推測R波也是取食相關(guān)的波形,可在一定程度上能反應(yīng)茶樹抗性情況,但之前發(fā)現(xiàn)R波出現(xiàn)頻率低,沒有被重視,具體的生物學(xué)意義沒有被明確定義。本研究推測,R波剛發(fā)生時假眼小綠葉蟬口針仍位于韌皮部,是取食受阻時的緩沖休息,或是長時間受阻取食后緩慢移動口針直至口針離開葉片的過程。金珊等研究假眼小綠葉蟬在人工飼料上的取食行為時,只觀察到E1(A)、E2(E)和E3(C),說明S、E和F波只能在取食植物時被觀察到,推測S波、F波和R波的產(chǎn)生與植物體內(nèi)的生化成分密切相關(guān)[22]。

3.2 基于EPG技術(shù)而評估茶樹對葉蟬的抗性

本研究以11個茶樹良種為目標。龍井43、中茶108、烏牛早和安吉白茶是江浙地區(qū)傳統(tǒng)制作綠茶的良種,寧波黃金芽是加工黃茶的良種,黃觀音、金觀音、鐵觀音、黃牡丹和紫牡丹則是福建推廣制作烏龍茶的良種,紫鵑則是云南省制作普洱茶的良種。解析EPG技術(shù)記錄的刺吸式昆蟲取食行為可以獲取許多植物抗蟲性的信息。本研究采用數(shù)個EPG參數(shù)為變量、對實體(11個品種)聚類分析,分為2類：第Ⅰ類包括安吉白茶、烏牛早、紫牡丹、中茶108、黃牡丹和鐵觀音；第Ⅱ類含有黃觀音、龍井43、紫鵑、寧波黃金芽和金觀音。分析這2類的各項EPG波形指標,發(fā)現(xiàn)第Ⅰ類的每個品種上葉蟬平均刺探次數(shù)、A波和F波平均歷期皆顯著小于第Ⅱ類的(P0.05)。第Ⅰ類的E波和NP波平均歷期顯著大于第Ⅱ類。這兩種類型的S波、C波和R波歷期之間差異皆未達到顯著水平。由于第Ⅰ類刺探次數(shù)少、A波、F波和R波平均持續(xù)時間短、以及E波平均持續(xù)時間長,說明該類型茶樹品種在葉蟬口針刺破葉片表面、達到韌皮部之前及其在韌皮部取食的整個過程所受阻礙少,為感性品種；第Ⅱ類品種上葉蟬刺探次數(shù)多,A波、F波和R波平均持續(xù)時間最長,均顯著高于第Ⅰ類,說明該類型茶樹品種在葉蟬口針刺破葉片表面、達到韌皮部之前及其在韌皮部取食的整個過程所受阻礙大,為抗性品種。其抗性強弱為：第Ⅱ類>第Ⅰ類。

若以E波歷期為指標,再比較每類茶樹品種的抗感性：則在第Ⅱ類中發(fā)現(xiàn)紫鵑上E波持續(xù)時間最短,抗性最強,抗性由強到弱排序為紫鵑>龍井43>寧波黃金芽>金觀音>黃觀音；第Ⅰ類中鐵觀音和黃牡丹持續(xù)時間最長,更易受葉蟬危害,感性抗性由強到弱為：鐵觀音>黃牡丹>烏牛早>安吉白茶>紫牡丹>中茶108。與劉麗芳等[23]認為茶樹抗葉蟬取食能力由強至弱為龍井43>中茶108>安吉白茶結(jié)果一致。在第Ⅱ類中,金觀音上F波持續(xù)時間顯著短于其他4個抗性品種上F波,或許金觀音品種可能擁有某類未被鑒定的物質(zhì)或缺乏葉蟬適口的營養(yǎng)物質(zhì),從而有效地阻抑葉蟬持續(xù)取食。而且金觀音和黃觀音是鐵觀音與黃旦的人工雜交后代中選育而成的無性系新良種,抗性、適應(yīng)性和成活率皆超過雙親[30],并且金觀音和黃觀音抗葉蟬性能超過親本(鐵觀音、黃旦)。本研究中葉蟬在抗性茶樹品種上的Np歷期短于感性品種、R波歷期也較長,這與其他研究[20,22]略有差異,由于葉蟬在抗性品種上取食過程中E波、A波、F波和R波歷期較長,試驗時間5h是固定的,Np歷期就短了。

3.3 茶樹抗感性與茶葉化學(xué)成分的相關(guān)性

借助于EPG技術(shù)快速有效鑒定不同茶樹品種抗感性等級,檢測了構(gòu)成茶葉滋味的4類物質(zhì),期望揭示抗感性與呈味物質(zhì)之間的相關(guān)性。兒茶素類是茶多酚的主要成分,但具有苦澀味,占茶葉干重12%—24%?？Х葔A可刺激神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生興奮、消減疲乏,占茶葉干重的2%—4%。茶葉可溶性糖類包括單糖和雙糖、以及少量三糖等寡聚糖,具有水溶性,占干重0.4%—4%。氨基酸具有鮮爽口感,通常占干重1%—4%。本研究比較了11個茶樹品種咖啡堿、兒茶素、可溶性糖和氨基酸的含量差異,只有兒茶素總量在抗性品種和感性品種之間存在差異,以抗性品種的兒茶素總量高于感性品種的,發(fā)現(xiàn)兒茶素含量與韌皮部取食波(E波)持續(xù)時間呈顯著負相關(guān),與刺探次數(shù)和韌皮部取食困難波呈正相關(guān)但未達到顯著性,首次將茶樹理化成分與EPG指標做關(guān)聯(lián)分析。

前人也較多地探討茶葉理化成分與抗蟲性,張貽禮等[31]發(fā)現(xiàn)蟲口密度與咖啡堿含量呈顯著負相關(guān),與氨基酸和茶多酚含量沒有顯著相關(guān)性。鄒武等[32]的研究表明,假眼小綠葉蟬在茶樹品種上的種群數(shù)量與茶多酚、水溶性糖、兒茶素含量相關(guān)關(guān)系不明顯,但與咖啡堿含量呈負相關(guān)、與游離氨基酸呈正相關(guān)。金珊等[33]則發(fā)現(xiàn),γ-氨基丁酸的含量在抗蟲品種中普遍高于感蟲品種,而綠原酸和茶多酚則相反,推測γ-氨基丁酸可能是影響假眼小綠葉蟬取食行為的關(guān)鍵因素。

可見,關(guān)于茶樹抗葉蟬性能與茶葉化學(xué)成分之間的說法不一致,還需要進一步求證。EPG技術(shù)的推廣使用可以快速觀察到昆蟲在植物上的取食特點,對植物抗性進行初步定性,但如果深入解析茶樹抗蟲性機理,還需要與切片技術(shù)、生化與分子生物學(xué)手段和田間觀測等相結(jié)合,才能建立比較完善的抗性評價體系。

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ResistanceofteacultivarstotheteagreenleafhopperanalyzedbyEPGtechniqueandtheirresistance-relatedsubstances

ZHENG Yuting, WANG Mengxin, CUI Lin, HAN Shanjie, YU Pengfei, HAN Baoyu*

ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofBiometrologyandInspection&Quarantine,CollegeofLifeSciencesofChinaJiliangUniversity,Hangzhou310018,China

To thoroughly investigate probing behavior of the tea green leafhopper,Empoascavitis(G?the)， on tea plants, determine adequate electrical penetration graph (EPG) parameters as reliable indices for measuring tea plant resistance/susceptibility levels to the leafhopper, and further analyze their potential correlations to the major defensive components in tea leaves, 11 national or regional elite/specificity cultivars, such as Zijuan, Ningbohuangjinya and Huangguangyin, were studied using EPG techniques. Various leafhopper probing behaviors and EPG parameters were analyzed to evaluate the resistance/susceptibility of every cultivar to the leafhopper. Major (primary) tea leaf chemical components were determined using high-pressure liquid chromatography. Our results showed that: 1) seven distinct EPG waveforms (Np, A, S, C, E, F, and R) with possible biological significance during leafhopper feeding were recorded, and each waveform and its regular emergence sequence were analyzed. The waveforms E and F, plus the waveform R (with unknown biological significance) were considered to be the resistance-related waveforms. 2) During the 5-h testing period, the numbers of probing instances by the leafhopper on cultivars Huangguanyin and Longjing 43 were the highest, followed by those on cultivars Zijuan, Ningbohuangjinya and Jinguanyin, and the numbers on cultivars Tieguanyin and Anjibaicha were the lowest. The average durations of waveform E on cultivars Tieguanyin and Huangmudan were the longest, followed by the durations on cultivars Wuniuzao and Anjibaicha, and that on cultivar Zijuan was the shortest. The average duration of waveform F on cultivar Huangguanyin was the longest, followed by the durations on cultivars Zijuan, Longjing 43, and Ningbohuangjinya, and that on cultivar Jinguanyin was the shortest. 3) These 11 tested tea cultivars were classified into two groups via cluster analysis based on the number of probing instances, and durations of waveforms E and F as indices; group I: cultivars Anjibaicha, Wuniuzao, Zimudan, Zhongcha 108, Huangmudan, and Tieguanyin and group II: cultivars Zijuan, Longjing 43, Ningbohuangjinya, Huangguanyin, and Jinguanyin. The resistance level of tea cultivars in group II was stronger than that in group I. 4) From susceptible to resistant cultivars, the total catechin content rose, and it was negatively correlated with the duration of waveform E (P< 0.05); however, the contents of caffeine, amino acids and soluble sugars were not significantly correlated with the duration of waveform E or F. It is suggested that the number of probing instances, and durations of waveforms E and F are relatively reliable EPG indices for measuring tea plant resistance/susceptibility levels to the leafhopper. Waveform R might be correlated with feeding-resistance in phloem, but needs further investigation. Catechins seemed to be the key defensive compounds in tea leaves against the leafhopper feeding. This study provides in-depth reference information for further investigations on the resistance mechanisms of tea plants against pests.

Empoascavitis(G?the); tea plant; probing behavior; electrical penetration graph; resistance against pest

浙江省自然科學(xué)基金項目(LY17C140002); 浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新項目(2016R40915, 2017R409055)

2017- 04- 27;

2017- 09- 09

*通訊作者Corresponding author.E-mail: han-insect@263.net

10.5846/stxb201704270770

鄭雨婷,王夢馨,崔林,韓善捷,俞鵬飛,韓寶瑜.基于EPG技術(shù)分析茶樹品種對茶小綠葉蟬的抗性及其相關(guān)的抗性物質(zhì).生態(tài)學(xué)報,2017,37(23):8015- 8028.

Zheng Y T, Wang M X, Cui L, Han S J, Yu P F, Han B Y.Resistance of tea cultivars to the tea green leafhopper analyzed by EPG technique and their resistance-related substances.Acta Ecologica Sinica,2017,37(23):8015- 8028.