張玉梅，李鵬鵬*，張牧焓，王晶晶，王道營，徐為民,3

麻鴨HSP90α基因的原核表達(dá)、純化及磷脂結(jié)合活性的鑒定

張玉梅1,2，李鵬鵬1,*，張牧焓1，王晶晶1,2，王道營1，徐為民1,2,3

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；
2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

為研究麻鴨（Anas platyrhynchas）熱休克蛋白HSP90α結(jié)合肌內(nèi)磷脂及抑制磷脂水解的作用機(jī)制，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)，以麻鴨骨骼肌細(xì)胞cDNA為模板擴(kuò)增HSP90α基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，鎳柱親和層析和凝膠層析純化可溶性重組蛋白。結(jié)果表明，獲得的HSP90α開放閱讀框全長為2 187 bp，編碼728 個氨基酸，預(yù)測的理論等電點(diǎn)約為5。構(gòu)建的原核表達(dá)載體pCold1-HSP90α在大腸桿菌中成功可溶性表達(dá)了麻鴨HSP90α，并獲得了高純度的重組HSP90α蛋白。運(yùn)用薄層層析證明該重組蛋白具有穩(wěn)定結(jié)合磷脂酰膽堿的活性，并且該蛋白能顯著削弱磷脂酶A2對磷脂的水解作用。該研究成功克隆并建立了麻鴨HSP90α基因的原核表達(dá)體系，制備了具有磷脂結(jié)合活性的重組蛋白，為進(jìn)一步研究HSP90α與磷脂的相互作用及對肉品加工中磷脂的保護(hù)效應(yīng)提供了理論支持。

麻鴨；HSP90α；原核表達(dá)；純化；磷脂結(jié)合

肌內(nèi)脂類物質(zhì)中不飽和脂肪酸的解離、氧化是肉制品揮發(fā)性風(fēng)味品質(zhì)變化的主因，其中磷脂因富含長鏈多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），對肉制品的風(fēng)味具有更為重要的影響[1]。研究顯示，磷脂含量在鮮肉貯藏及腌臘肉制品加工過程中顯著下降[2-5]，同時游離脂肪酸（free fat acid，F(xiàn)FA）的含量隨之增加，但是甘油三酯的含量變化卻很小。產(chǎn)生的FFA中富含長鏈PUFA，這些長鏈PUFA只可能來自磷脂的水解。所以肌內(nèi)磷脂被認(rèn)為是肉制品中脂肪水解的主要底物[6-7]。肌內(nèi)磷脂水解產(chǎn)生的大量FFA會進(jìn)一步發(fā)生氧化反應(yīng)生成小分子的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，這些物質(zhì)一方面成為腌香風(fēng)味的主要來源[8]，另一方面也會導(dǎo)致肉品酸敗和風(fēng)味劣變[9]。因此研究脂質(zhì)水解氧化過程及其影響因素，對肉類風(fēng)味品質(zhì)控制具有重要的理論和實(shí)踐意義。

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSP）是生物界具有高度保守性的一類熱應(yīng)激蛋白質(zhì)[10]。根據(jù)分子質(zhì)量的大小可分為小分子HSP（sHSP）、HSP60、HSP70、HSP90和HSP110[11]。正常機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的HSP主要作為分子伴侶，幫助蛋白質(zhì)正確折疊和參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等[12]。當(dāng)機(jī)體受到環(huán)境壓力時，HSP會被大量合成并與細(xì)胞內(nèi)各組分如生物膜、蛋白質(zhì)、細(xì)胞骨架元件等相互作用，維持細(xì)胞的穩(wěn)定和正常的生理功能[12-13]。HSP對細(xì)胞膜的流動性、滲透性和完整性具有調(diào)控作用。酵母HSP12通過結(jié)合在細(xì)胞膜外部，幫助細(xì)胞膜維持完整性[14]。乳酸菌sHSP參與維持膜脂的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)[15]。

磷脂和HSP都是細(xì)胞尤其是細(xì)胞膜的重要組分，兩者間關(guān)系密切。已有研究證實(shí)，磷脂能與HSP70蛋白及sHSP結(jié)合[16-17]。此外，Su等[18]的結(jié)果顯示，HSP通過抑制磷脂酶A2的活性保護(hù)磷脂，減少心肌細(xì)胞中膜的脂質(zhì)過氧化。本課題組前期研究表明，HSP可以顯著抑制磷脂酶A2對磷脂的水解作用，對磷脂水解以及肉品風(fēng)味品質(zhì)具有顯著影響[7-8,19]。

本研究從麻鴨中克隆HSP90α基因并構(gòu)建原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中可溶性表達(dá)并提取純化HSP90α重組蛋白，測定其與磷脂結(jié)合及抑制磷脂水解的活性。旨在為解析HSP90α與磷脂綁定的特點(diǎn)提供工作基礎(chǔ)，并為利用HSP90α綁定磷脂的性質(zhì)、研究抑制肉品肌內(nèi)磷脂水解和延緩脂質(zhì)過氧化的新方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻鴨由江蘇南京孝陵衛(wèi)集貿(mào)市場提供，宰后采集組織，-80 ℃保存。

酵母提取物、胰蛋白胨 美國Oxoid公司；瓊脂粉南京奧多福尼生物科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖 南京生興生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌Trans5α、Transetta2 北京全式金生物技術(shù)有限公司；LB培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；異丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、氨芐青霉素 上海生工生物股份有限公司；Taq DNA聚合酶、pMD19-T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等 日本TaKaRa公司；抗體 美國Bioworld Technology公司；磷脂酰膽堿美國Avanti Polar Lipids公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TP600梯度升降溫功能聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國GE Healthcare公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海雷磁儀器有限公司；UV-6100型分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司；Synergy2多功能酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；Scientz-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀電泳槽 北京六一儀器廠；JS-680C全自動凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；VD-650超凈工作臺 蘇州江東精密儀器有限公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)N C B I公布的北京鴨的基因組H s p 9 0 α基因預(yù)測序列，篩選到該基因的C D S序列，運(yùn)用Primer 5.0設(shè)計(jì)基因的特異性引物。上游引物（F）：5’-CTCGGATCCATGCCTGAGGCTGT-3’（下劃線是BamHⅠ酶切位點(diǎn)）；下游引物（R）：5’-TACGTCGACATCCACCTCCTCCAT-3’（下劃線是SalⅠ酶切位點(diǎn)）。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.3.2 麻鴨總RNA提取及cDNA合成

麻鴨總RNA的提取按照TaKaRa公司的TRIzol說明書進(jìn)行操作。取胸肌100 mg，提取總RNA，總RNA經(jīng)電泳檢測，Eppendorf公司核酸定量分析儀測定OD260nm/OD280nm比值及濃度，以1 μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存，長期保存應(yīng)放于-20 ℃。

1.3.3 目的基因的獲得

以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10 μL，其中template 0.5 μL，Taq DNA聚合酶5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 3.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 20 s；56 ℃ 20 s；72 ℃ 2 min，進(jìn)行25 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物純化回收后連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂在含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，然后挑取陽性單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR、酶切和PCR鑒定，連接正確的重組基因質(zhì)粒送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.3.4 序列分析

測序結(jié)果用LaserGene軟件進(jìn)行序列分析，鴨HSP90α基因克隆結(jié)果用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST進(jìn)行同源性比對。利用protparam分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)。

1.3.5 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

在37 ℃條件下用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切pMD19THSP90α及原核表達(dá)載體pCold1 2 h，將酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行切膠純化回收后，用T4連接酶連接（22 ℃，2 h），將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α后進(jìn)行菌液PCR及雙酶切鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功，篩選出陽性重組質(zhì)粒并送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.3.6 融合蛋白原核表達(dá)及可溶性分析

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Transetta2感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種至5 mL含100 μg/mL氨芐的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600nm值為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為0.25 mmol/L，22 ℃、200 r/min誘導(dǎo)過夜。離心收集沉淀，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）重懸菌體，于超聲波細(xì)胞破碎儀上破碎5 min，12 000 r/min離心5 min，分別取出上清液、沉淀，加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min，用12% SDS-PAGE檢測融合蛋白是否為可溶性蛋白，設(shè)置不加IPTG誘導(dǎo)的菌液作對照。

1.3.7 重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將上述鑒定能可溶性表達(dá)HSP90α的菌落接種于500 mL含LB培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。離心（4 500 r/min，15 min）收集菌體，用Binding Buffer（50 mmol/L的磷酸鹽，pH 7.6，150 mmol/L的NaCl，5 mmol/L的咪唑）重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎20 min（功率20%，超聲1 s，間停3 s），再離心（12 000 r/min，30 min，4 ℃）收集上清液，棄菌體沉淀。將上清液加入鎳親和層析柱中，用不同濃度的咪唑洗脫液洗脫并收集，初步純化蛋白，取樣液加入SDS-PAGE上樣緩沖液，加熱（95 ℃，10 min），用12% SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)情況。將較純的樣品用10 kDa的超濾管離心濃縮（4 ℃，4 000 r/min，10 min/次），再用Superdex G200進(jìn)一步純化，然后再次用SDS-PAGE檢測純化的產(chǎn)物并離心濃縮。用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，分裝后置于-80 ℃保存。

1.3.8 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定

純化后的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用5%的脫脂牛奶封閉1 h，用Tris-HCl吐溫緩沖液（tris buffered saline with Tween 20，TBST）洗3～5 次，每次10 min，加入含His標(biāo)簽的多克隆抗體，稀釋倍數(shù)1∶1 000，4 ℃孵育過夜，用TBST洗3～5 次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗，稀釋倍數(shù)1∶5 000，37 ℃孵育2 h，再次用TBST洗3～5 次，每次10 min，加入電化學(xué)發(fā)光（electro-chemiluminescence，ECL）液進(jìn)行發(fā)光拍照。

1.3.9 薄層層析法鑒定與磷脂結(jié)合活性測定[20]

層析用的硅膠板在105 ℃活化1 h后取出放置在干燥器中冷卻待用。將純化得到的HSP90α蛋白與磷脂溶液混合并在室溫孵育30 min。孵育結(jié)束后向體系中加入2 倍體積的氯仿，振蕩混勻，12 000 r/min離心5 min后取下層液體。將活化的硅膠板取出放在點(diǎn)樣臺上，在距底端1.5 cm左右點(diǎn)樣，各點(diǎn)樣點(diǎn)保持一定的距離，點(diǎn)樣后常溫下風(fēng)干。將硅膠板放入已平衡好的展開劑甲醇-水-氯仿-三乙胺（5∶0.6∶13∶0.04，V/V）中展開。待展開劑擴(kuò)散至距硅膠板頂端2 cm處，取出硅膠板在通風(fēng)櫥中吹干。用溴百里香酚藍(lán)染液（0.08 g溴百里香酚藍(lán)，加入0.01 mol/L NaOH溶液200 mL）染色，染色20 s后，取出并用濾紙吸干殘留的染液，自然晾干形成斑點(diǎn)并拍照。

從表1中可以看出，2005年、2008年、2010年和2013年山東省耕地面積占比都超過60%，但總體面積在減少，說明山東省是以耕地為主的地區(qū)，但隨著社會的發(fā)展，耕地不斷被占用。建設(shè)用地面積占比都超過10%，主要集中在東南沿海地區(qū)和西北低洼平坦地區(qū)，在巨大的社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的驅(qū)動下，城市化進(jìn)程加快，促使建設(shè)用地不斷向外擴(kuò)張，處于不斷上升的趨勢。

1.3.10 HSP90α對磷脂水解的抑制

使用EnzChek Phospholipase A2Assay Kit，先將10 μL HSP90α（稀釋到不同濃度）與50 μL磷脂的脂質(zhì)體底物在25 ℃共孵育30 min，然后加入含有磷脂酶A2的反應(yīng)緩沖液，室溫反應(yīng)10 min后，設(shè)定多功能酶標(biāo)儀的激發(fā)光波長為470 nm，發(fā)射光波長為515 nm，讀取熒光強(qiáng)度，水解產(chǎn)物越多熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，3 次重復(fù)，取平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，然后采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18.0（IBM）對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 麻鴨HSP90α基因的全長克隆及序列分析

以麻鴨骨骼肌細(xì)胞cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得HSP90α開放閱讀框全長為2 187 bp（圖1），擴(kuò)增條帶大小符合預(yù)期。預(yù)測HSP90α編碼728 個氨基酸，分子質(zhì)量為84.12 kDa，理論等電點(diǎn)為5.0。以人的HSP90α三級結(jié)構(gòu)（PDB號：5FWK）為參考結(jié)構(gòu)，預(yù)測鴨HSP90α的二級結(jié)構(gòu)，顯示有36%的氨基酸可能形成α螺旋，15%的氨基酸可能形成β折疊。

圖1 HSP90α的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR product of HSP90α

2.2 HSP90α基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig. 2 Identif i cation of recombinant plasmid pCold1-HSP90α by enzymatic digestion

使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ對表達(dá)載體pCold1和PCR獲得的HSP90α基因進(jìn)行酶切和連接，獲得重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定（圖2），獲得4 500 bp的大片段和約2 000 bp的小片段，分別與pCold1和HSP90α基因大小相符。進(jìn)一步測序結(jié)果證實(shí)，插入位置、閱讀框及重組基因序列均準(zhǔn)確無誤，表明目的基因已成功克隆至表達(dá)載體pCold1中，重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pCold1-HSP90α。

2.3 麻鴨HSP90α重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性檢測結(jié)果

將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Transetta2感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)0.25 mmol/L IPTG在22 ℃小量誘導(dǎo)表達(dá)12 h。離心收集菌體，超聲破碎細(xì)胞。為探究融合蛋白的可溶性，將破碎后的菌體上清液、沉淀分別進(jìn)行12%的SDS-PAGE，同時設(shè)置未加誘導(dǎo)劑的重組質(zhì)粒菌液作為對照。結(jié)果如圖3所示，對比泳道1和泳道2、3、4，發(fā)現(xiàn)利用該系統(tǒng)可以重組表達(dá)鴨HSP90α，蛋白大小約90 kDa（帶有His-tag）與預(yù)期大小一致，未加IPTG誘導(dǎo)劑的重組菌在預(yù)期大小的條帶處沒有明顯的表達(dá)條帶出現(xiàn)。另外，泳道4和泳道3對比，可以明顯看出在22 ℃誘導(dǎo)條件下，大腸桿菌可以大量可溶性表達(dá)麻鴨HSP90α蛋白。

圖3 重組鴨HSP90α在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of recombinant duck HSP90α protein

2.4 重組蛋白的純化

2.4.1 HSP90α重組蛋白的初步純化

圖4 HSP90α蛋白Ni-NTA親和層析后SDS-PAGE檢測圖譜Fig. 4 SDS-PAGE analysis of HSP90α obtained from Ni-NTA spin column

2.4.2 HSP90α重組蛋白的凝膠過濾結(jié)果

圖5 HSP90α凝膠過濾層析色譜圖及SDS-PAGE檢測圖譜Fig. 5 Size exclusion chromatogram and SDS-PAGE analysis of recombinant HSP90α protein

如圖5所示，樣品經(jīng)過Superdex G200層析柱純化后得到5 個洗脫峰，將不同的洗脫峰收集起來并用12%SDS-PAGE檢測。結(jié)果顯示，純化后的融合蛋白條帶比較單一，雜帶消失，可去除大分子蛋白和部分小分子蛋白。圖中1號洗脫峰為高純度的目的蛋白HSP90α，將該洗脫峰收集起來濃縮后用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，分裝后放-80 ℃保存待用。

2.5 純化融合蛋白的Western blot鑒定結(jié)果

將分子篩純化后的融合蛋白用組氨酸標(biāo)簽單克隆抗體進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果如圖6所示，在預(yù)期目標(biāo)蛋白處出現(xiàn)非常單一的條帶，并且大小與預(yù)期也一樣，說明純化得到的蛋白是預(yù)期的重組蛋白。

圖6 重組HSP90α蛋白的Western blot分析Fig. 6 Western blot analysis of recombinant HSP90α protein by using anti-His monoclonal antibody

2.6 薄層析法鑒定HSP90α與磷脂的結(jié)合活性

磷脂的薄層析實(shí)驗(yàn)通過磷脂混合物的不同組分在展開劑中的移動速率的差異，將磷脂混合物各組分分開。HSP90α與磷脂結(jié)合的薄層析結(jié)果顯示（圖7），與對照組相比，隨著在磷脂酰膽堿和HSP90α共孵育體系中加入的HSP90α量的增加，在展開劑中遷移的磷脂酰膽堿顯色形成的斑點(diǎn)面積逐漸變小，其中加入15 μg HSP90α的實(shí)驗(yàn)組比對照組磷脂酰膽堿顯色斑點(diǎn)的面積減小了約90%，變化顯著。這表明HSP90α與磷脂結(jié)合，形成的綁定體顯著抑制了磷脂在展開劑中的遷移。

圖7 薄層色譜圖Fig. 7 Thin layer chromatography

2.7 HSP90α對磷脂水解的抑制

磷脂酶A2在磷脂的sn-2位水解磷脂形成游離脂肪酸和溶血卵磷脂。HSP90α與磷脂結(jié)合形成磷脂綁定體，可能影響磷脂酶A2對磷脂的水解。因此利用熒光分光光度法測定了HSP90α對磷脂酶A2水解磷脂活性的影響。由圖8可知，隨著反應(yīng)中HSP90α濃度的增加，檢測到的磷脂水解產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度逐漸降低，與不含HSP90α的對照組相比，當(dāng)HSP90α濃度為0.4 μmol/L時，磷脂水解產(chǎn)物明顯減少（約13%）；當(dāng)HSP90α濃度為6.4 μmol/L時，磷脂水解產(chǎn)物減少了約70%。這表明HSP90α與磷脂的結(jié)合使磷脂水解產(chǎn)物減少，HSP90α顯著抑制了磷脂酶A2對磷脂的水解作用，可能是由于HSP90α與磷脂結(jié)合，使磷脂酶A2無法識別和攻擊磷脂sn-2位的酯鍵，對磷脂起到了保護(hù)作用。

圖8 HSP90α對磷脂水解的影響Fig. 8 Effects of different HSP90α concentrations on phospholipid lipolysis

3 討論和結(jié)論

隨著人們生活水平的不斷提高，動物性食品在膳食中的比重持續(xù)增加，近十年來圍繞肉類食品風(fēng)味品質(zhì)及其形成機(jī)理的研究，受到越來越多的重視。肌內(nèi)磷脂占肉品肌內(nèi)脂肪的比重達(dá)50%以上[7,21]。磷脂富含長鏈PUFA，其水解產(chǎn)生的PUFA極易氧化產(chǎn)生揮發(fā)性呈味物質(zhì)，既能形成肉制品的腌香風(fēng)味[22]，又可能導(dǎo)致肉品風(fēng)味劣變[23]；因此肌內(nèi)磷脂的水解是肉品風(fēng)味的重要來源，如何控制磷脂水解、利用其水解氧化對肉品風(fēng)味產(chǎn)生的雙重效應(yīng)調(diào)控肉品品質(zhì)成為了肉品加工貯藏的研究熱點(diǎn)[24-25]。細(xì)胞膜磷脂與HSP的關(guān)系極為密切，在生物體內(nèi)，兩者相互作用維護(hù)細(xì)胞膜的完整性等[12-14]。此外，有研究顯示，HSP可以干擾磷脂酶A2的激活途徑[26]，并能抑制磷脂酶A2的活性從而保護(hù)磷脂，減少膜磷脂的過氧化[27]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)，從鴨胸肉中提取的HSP90α可綁定磷脂并顯著削弱磷脂酶A2對磷脂的水解作用[19]，進(jìn)一步研究表明HSP90α與磷脂間穩(wěn)定的相互作用可能發(fā)生在磷脂的極性頭端和非極性側(cè)鏈上[28]，但是磷脂在HSP90α上的結(jié)合位點(diǎn)及兩者相互作用的影響因素仍有待研究。開展以上研究需要大量高純度的HSP90α蛋白，然而直接從鴨胸肉中提取HSP90α，工作量大，操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)周期長，耗材較多且提取量少[29]。利用大腸桿菌進(jìn)行體外重組表達(dá)目標(biāo)蛋白，因具有操作簡便、成本低、表達(dá)效率高、產(chǎn)物穩(wěn)定且易鑒定等優(yōu)點(diǎn)，在食品領(lǐng)域有較大的發(fā)展空間，在基因表達(dá)技術(shù)中占有重要的地位，是生物技術(shù)研究中的重要工具[30]。

本研究運(yùn)用基因重組技術(shù)將麻鴨HSP90α基因克隆到表達(dá)載體pCold1，并導(dǎo)入到大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，成功構(gòu)建了pCold1-HSP90α的大腸桿菌表達(dá)體系；通過Ni-NTA親和層析和凝膠過濾層析，最終獲得了高純度的HSP90α；采用薄層析法鑒定了HSP90α重組蛋白與磷脂結(jié)合的活性，并驗(yàn)證了HSP90α與磷脂的結(jié)合可顯著抑制磷脂水解，為研究HSP90α與磷脂的相互作用及深入研究HSP90α與磷脂結(jié)合對肉品風(fēng)味的影響建立了工作基礎(chǔ)。

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Prokaryotic Expression, Purif i cation and Identif i cation of Phospholipid Binding Activity of Anas platyrhynchas HSP90α

ZHANG Yumei1,2, LI Pengpeng1,*, ZHANG Muhan1, WANG Jingjing1,2, WANG Daoying1, XU Weimin1,2,3
(1. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;2. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China; 3. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing,Quality and Safety Control, Nanjing 210095, China)

The present study was conducted to express and purify the heat shock protein 90 alpha (HSP90α) of Anas platyrhynchas in prokaryotic expression system for further study of the mechanism of interaction between HSP90α and phospholipids and inhibition of phospholipid hydrolysis by HSP90α. The HSP90α gene was cloned from A. platyrhynchas skeletal muscle cDNA by RT-PCR. The gene sequence and its amino acid sequence were analyzed with bioinformatic tools.An inducible expression vector was constructed by enzyme digestion-ligation reactions and transformed into Escherichia coli for expression using isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) as an inducer. The recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography and gel chromatography. As results, the open reading frame of HSP90α was 2 187 bp in length, and the deduced protein was composed of 728 amino acids with 5 glycosylation sites and 67 phosphorylation sites; its predicted isoelectric point was about 5. The E. coli vector pCold1-HSP90α successfully expressed the recombinant HSP90α protein in the supernatant of bacterial lysate. Thin-layer chromatography demonstrated that the recombinant HSP90α could stably bind to phosphatidylcholine. Lipolysis assay showed that HSP90α significantly restrained the hydrolysis of phospholipid. In conclusion, this study may provide a foundation for further study of the interaction between HSP90α and phospholipids and the potential of HSP90α to protect phospholipids in processed meat.

Anas platyrhynchas; HSP90α; prokaryotic expression; purification; phospholipid binding

2017-01-23

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31701532；31401560）；江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（BK20161378）；江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所基金項(xiàng)目（JG201702）

張玉梅（1985—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿馄芳庸づc質(zhì)量控制。E-mail：zhangyumei0608@163.com

*通信作者簡介：李鵬鵬（1986—），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)槿馄芳庸づc質(zhì)量控制。E-mail：lipp0514@gmail.com

10.7506/spkx1002-6630-201802016

Q816

A

1002-6630（2018）02-0099-06

張玉梅, 李鵬鵬, 張牧焓, 等. 麻鴨HSP90α基因的原核表達(dá)、純化及磷脂結(jié)合活性的鑒定[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(2):99-104.

10.7506/spkx1002-6630-201802016. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Yumei, LI Pengpeng, ZHANG Muhan, et al. Prokaryotic expression, purification and identification of phospholipid binding activity of Anas platyrhynchas HSP90α[J]. Food Science, 2018, 39(2): 99-104. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802016. http://www.spkx.net.cn