柳明波,方 霞,梁 欣,李錫燕

(廣西醫(yī)科大學第十附屬醫(yī)院/欽州市第一人民醫(yī)院，廣西 欽州 535000)

·論著·

GM試驗聯(lián)合CD4+T淋巴細胞診斷艾滋病患者侵襲性曲霉病的研究

柳明波,方 霞,梁 欣,李錫燕

(廣西醫(yī)科大學第十附屬醫(yī)院/欽州市第一人民醫(yī)院，廣西 欽州 535000)

目的探討半乳甘露聚糖(GM)試驗聯(lián)合CD4+T淋巴細胞檢測對艾滋病(AIDS)患者合并侵襲性曲霉菌病(IA)的早期診斷價值。方法回顧性分析2014年1月—2016年12月某院住院懷疑IA的AIDS患者197例，分為確診IA組(35例)、臨床診斷IA組(疑似病例,96例)和非IA組(66例)，比較GM試驗、GM試驗聯(lián)合CD4+T淋巴細胞計數(shù)檢測診斷IA的靈敏度和特異度。結(jié)果確診IA組、臨床診斷IA組、非IA組患者GM值中位數(shù)(最小值，最大值)分別為1.29(0.65，1.84)、0.91(0.36，1.23)、0.11(0.28，0.72)pg/mL，CD4+T淋巴細胞計數(shù)分別為45(29，69)、79(35，99)、89(59，158)cell/μL，三組患者GM值和CD4+T淋巴細胞計數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。單獨GM試驗診斷AIDS患者IA的靈敏度為64.9%，特異度為72.7%；1周內(nèi)連續(xù)2次GM試驗診斷AIDS患者IA的靈敏度為72.5%，特異度為95.5%；GM試驗和CD4+T淋巴細胞聯(lián)合檢測的靈敏度為86.3%，特異度為90.9%。結(jié)論GM試驗對AIDS 患者IA有較好的診斷價值，且連續(xù)行GM試驗、GM試驗聯(lián)合CD4+T淋巴細胞計數(shù)檢測將進一步提高IA臨床診斷價值。

半乳甘露聚糖； CD4+T淋巴細胞； 艾滋??； 侵襲性曲霉菌病

侵襲性真菌感染(invasive fungal infection, IFI)是人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染者/艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)患者最常見的機會感染，嚴重時可導致患者死亡[1-2]。IFI在AIDS患者中的發(fā)病率和病死率均較高，分別為41.2%、22.9%[3-4]。HIV感染可以影響患者的細胞免疫功能使其發(fā)生異常，從而使患者免疫功能低下而引起一系列機會性感染和腫瘤的發(fā)生[5-6]。機會性感染是導致晚期AIDS患者死亡的最重要原因，其中IFI所導致的機會感染占較高比例[7]。研究顯示，半乳甘露聚糖(galactomannan, GM)試驗有診斷惡性血液病等患者侵襲性曲霉菌病(invasive aspergillosis, IA)的價值，但在AIDS患者中的相關報道較少；有研究顯示CD4+T淋巴細胞檢測對診斷AIDS患者侵襲性曲霉菌病有一定價值[8-9]。因此，本研究對GM試驗和CD4+T淋巴細胞檢測診斷IA的價值進行分析評價，旨在評價GM試驗聯(lián)合CD4+T淋巴細胞檢測在診斷AIDS患者IA的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2014年1月—2016年12月欽州市第一人民醫(yī)院感染科懷疑IA的AIDS住院患者197例，男性88例，女性109例，年齡17～69歲。研究納入標準：(1)感染科住院HIV/AIDS患者；(2)抗菌藥物應用時間>10 d，或伴發(fā)熱；(3)患者行GM試驗和CD4+T淋巴細胞計數(shù)檢測。根據(jù)IA的診斷標準將患者分三組，分別為確診IA組(35例)、臨床診斷IA組(疑似病例，96例)和非IA組(66例)，且治療前同時行GM試驗和CD4+T淋巴細胞計數(shù)。三組患者在性別、年齡方面比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。AIDS診斷標準：依據(jù)1993年美國疾病控制與預防中心(CDC) 發(fā)布的AIDS診斷標準, 抗-HIV陽性，并由欽州市疾病預防控制中心以免疫印跡法確診試驗陽性。IA的診斷標準[10]：(1)確診：通過組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)曲霉菌或無菌組織培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)曲霉菌；(2)臨床診斷：有IA宿主/環(huán)境因素、臨床及影像學表現(xiàn)，而無微生物學依據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 真菌培養(yǎng)及鑒定 采用法國生物梅里埃VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)及其配套試劑進行真菌鑒定。將患者血、胸腹腔積液、深部咳出的痰以及其他深部組織液進行真菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性標本的菌落接種于沙氏瓊脂培養(yǎng)基，然后根據(jù)菌落生長、顏色、形態(tài)等特征，結(jié)合鏡檢菌絲或孢子的形態(tài)確定菌種。

1.2.2 GM試驗檢測 采集患者入院后晨起空腹靜脈血3 mL，以1 000 r/min 離心10 min，留取上清液200 μL于-20℃保存；然后于一周內(nèi)再次采集患者靜脈血取血清保存后待檢測。操作步驟依據(jù)曲霉菌GM檢測試劑盒[丹娜(天津)生物科技有限公司提供]說明書進行，并使用全自動酶聯(lián)測定儀進行測定。參照美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)建議cut-off = 0.5為界定值，依據(jù)曲霉菌陽性判斷標準[11]：連續(xù)兩次GM>0.5或單次>1.0均為陽性。

1.2.3 CD4+T淋巴細胞計數(shù)檢測 抽取抗凝靜脈血3 mL立即送檢，應用FACSCanto II流式細胞儀[碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司提供]檢測CD4+T淋巴細胞絕對數(shù)(cell/μL)，CD4+<50 cell/μL判定為陽性。6色TBNK試劑盒和FACS溶血素均購自美國BD公司。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，非正態(tài)分布資料以中位數(shù)(最小值，最大值)表示，多組非正態(tài)分布資料總體比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗或H檢驗，檢驗統(tǒng)計量為H，多組兩兩比較采用Wilcoxon秩和檢驗，檢驗統(tǒng)計量為T。采用敏感度、特異度評價GM試驗相關指標的診斷水平，率的比較采用χ2檢驗,進行受試者特征工作曲線(ROC曲線)分析。

2 結(jié)果

2.1 三組患者基本情況 確診IA組、臨床診斷IA組發(fā)熱患者均>80%，100%有咳嗽、咳痰癥狀，出現(xiàn)影像學改變者分別占88.57%、96.88%。確診IA組54.29%痰涂片陽性，77.15%痰培養(yǎng)陽性，34.29%灌洗液培養(yǎng)陽性。各組臨床表現(xiàn)及檢查結(jié)果見表1。

表1197例AIDS患者各組臨床表現(xiàn)及檢查結(jié)果[例(%)]

Table1Clinical manifestations and detection results of each groups of 197 AIDS patients(No. of cases[%])

分組確診IA組(n=35)臨床診斷IA組(n=96)非IA組(n=66)發(fā)熱29(82．86)87(90．63)16(24．24)咳嗽、咳痰35(100．00)96(100．00)7(10．61)支氣管擴張11(31．43)24(25．00)0(0．00)白細胞<3．5×109/L18(51．43)56(58．33)2(3．03)血小板<50×109/L15(42．86)49(51．04)2(3．03)CT影像學改變?31(88．57)93(96．88)0(0．00)結(jié)核感染病史12(34．29)25(26．04)3(4．55)曲霉菌陽性 病理學檢查1(2．86)0(0．00)0(0．00) 痰涂片19(54．29)3(3．13)0(0．00) 痰培養(yǎng)27(77．15)0(0．00)0(0．00) 灌洗液培養(yǎng)12(34．29)0(0．00)0(0．00) 血培養(yǎng)6(17．14)0(0．00)0(0．00)

*: 肺部空洞伴或不伴曲霉腫塊、浸潤、結(jié)節(jié)和各種程度的肺或胸膜纖維化

2.2 GM值與CD4+T淋巴細胞計數(shù)比較 三組患者GM值和CD4+T淋巴細胞計數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。三組數(shù)值兩兩比較，確診IA組的GM值高于非IA組，CD4+T淋巴細胞計數(shù)低于非IA組(均P<0.05)；臨床診斷IA組GM值高于非IA組(P<0.05)，而CD4+T淋巴細胞計數(shù)兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；確診IA組與臨床診斷IA組的GM值和CD4+T淋巴細胞計數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2三組AIDS患者GM值與CD4+T淋巴細胞計數(shù)比較[中位數(shù) (最小值, 最大值) ]

Table2Comparison of GM value and CD4+T lymphocyte counting among three groups of AIDS patients (medium [minimum, maximum])

組別GM值(pg/mL)CD4+T淋巴細胞計數(shù)(cell/μL)確診IA組(n=35)1．29(0．65，1．84)45(29，69)臨床診斷IA組(n=96)0．91(0．36，1．23)79(35，99)非IA組(n=66)0．11(0．28，0．72)89(59，158)H53．7422．67P0．000．00

2.3 GM試驗和CD4+T淋巴細胞計數(shù)對AIDS患者IA的診斷能力

2.3.1 單次GM試驗 單次GM試驗診斷AIDS患者IA(包括確診與臨床診斷)的靈敏度為64.9%，特異度為72.7%。見表3。

2.3.2 連續(xù)2次GM試驗 1周連續(xù)2次進行GM試驗診斷AIDS患者IA的靈敏度為72.5%，特異度為95.5%，高于單次檢測GM試驗的特異度(均P<0.05)。見表3。

2.3.3 單次GM試驗聯(lián)合CD4+T淋巴細胞檢測 單次GM試驗聯(lián)合CD4+T淋巴細胞檢測診斷AIDS患者IA的靈敏度為86.3%，特異度為90.9%，高于單次檢測GM值的靈敏度和特異度(均P<0.05)。見表3。

表3 GM試驗和CD4+T淋巴細胞計數(shù)對AIDS患者IA的診斷效能

2.3.4 三種檢測方法診斷AIDS患者IA的ROC曲線 單次GM試驗、連續(xù)2次GM試驗，以及單次GM試驗聯(lián)合CD4+T淋巴細胞檢測對AIDS患者IA的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.713(95%CI：0.581～0.844)、0.905(95%CI：0.825～0.985)和0.930(95%CI：0.895～1.002)。見圖1。

圖1 三種檢測方法診斷AIDS患者IA的ROC曲線

Figure1ROC curve of three detection methods for daignosing IA in patients with AIDS

3 討論

目前，在IFI診斷研究中，非培養(yǎng)診斷方法是國內(nèi)外學者關注的熱點。主要的診斷方法有兩種，一種是血清學方法，基于免疫學原理；另一種是分子生物學方法，以聚合酶鏈式反應(PCR)技術為基礎[12-13]。兩種方法都有各自的優(yōu)點和缺點，血清學方法具有較高的敏感性和特異性，技術發(fā)展相對成熟，但缺點是會產(chǎn)生假陽性、假陰性等問題，這主要是由于免疫學原理的屬性所導致的結(jié)果。分子生物學方法的優(yōu)點是特異性高，缺點主要是樣本采集及檢測過程相對復雜，相關的檢測技術尚未完全發(fā)展成熟[14]。目前，IA檢查診斷方法主要有：(1)影像學檢查，通過CT檢查的特征性改變輔助診斷；(2)光學顯微鏡下的病原學檢查；(3)血清學方法包括GM試驗和β-1,3-D-葡聚糖試驗(β-1,3-D-glucan, BDG, G試驗)；(4)PCR檢測曲霉菌細胞核物質(zhì)[15]。

GM試驗已經(jīng)被歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組和美國國立變態(tài)反應和感染病研究院真菌病研究共識組(EORTC/MSG)認定為臨床診斷IFI中IA的微生物學診斷標準，并推薦對高危成人患者進行常規(guī)檢測，每周檢測2次，診斷標準為成人如果連續(xù)2次>0.5判定為陽性；兒童患者連續(xù)2次>0.8或單次>1.5為陽性標準[16-17]。本研究結(jié)果顯示，GM試驗單次檢測靈敏度較低(64.9%)，而特異性(72.7%)尚可；1周內(nèi)連續(xù)2次行GM試驗檢測可以提高靈敏度和特異度，分別為72.5%、95.5%。單次GM試驗假陽性率為27.3%(18/66)，表明GM試驗在診斷AIDS患者IA中有較高的假陽性率，可能與患者接受了抗菌藥物治療有關，如β-內(nèi)酰胺酶、氨芐西林、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉維酸等抗菌藥物均可導致假陽性，其中有1例新生隱球菌感染GM試驗結(jié)果為陽性。因此，進行GM試驗時要注意避免假陽性或注意分析假陽性相關的影響因素。本組研究結(jié)果表明，單次檢測假陰性率較高(35.1%)，而連續(xù)2次進行GM試驗檢測可以降低假陰性率(27.5%)，可能與曲霉菌細胞壁多糖成分釋放和檢測靈敏度有關，說明可以通過連續(xù)進行GM試驗，提高診斷的特異性。

目前，尚未見關于GM 試驗聯(lián)合CD4+T淋巴細胞計數(shù)檢測對AIDS患者合并IA診斷價值的相關報道。研究[18]報道，CD4+T淋巴細胞計數(shù)與AIDS機會感染出現(xiàn)的頻率有一定關系，CD4+T淋巴細胞下降時AIDS患者也容易發(fā)生其他機會感染，因此，需要與GM試驗聯(lián)合檢測進行診斷。GM試驗聯(lián)合CD4+T淋巴細胞檢測診斷IA的靈敏度為86.3%，特異度為90.9%，可以明顯提高診斷準確率。本研究中IA病例包括確診IA病例與臨床診斷IA病例，對診斷能力的評價可能有一定影響；臨床診斷IA病例均有曲霉菌CT影像學特征改變，并且給予抗真菌治療后有效，因此，保證了總體評價的準確性。另一方面，本研究如果能進一步分析GM試驗不同折點對AIDS患者IA的診斷效能，對IA患者的診斷具有重要臨床意義。

本研究結(jié)果顯示，CD4+T淋巴細胞聯(lián)合GM試驗的診斷靈敏度相對較高，而連續(xù)2次GM試驗的診斷特異度更高，臨床醫(yī)生應該根據(jù)臨床情況采取相應的診斷策略，早期診斷IA。

綜上所述，GM試驗對AIDS患者IA具有較好的診斷價值，且連續(xù)監(jiān)測及聯(lián)合CD4+T淋巴細胞計數(shù)可以提高臨床診斷價值。

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GalactomannantestcombinedwithCD4+TlymphocytesforthediagnosisofinvasiveaspergillosisinpatientswithAIDS

LIUMing-bo,FANGXia,LIANGXin,LIXi-yan

(QinzhouFirstPeople’sHospitalandtheTenthAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Qinzhou535000,China)

ObjectiveTo evaluate the effect of galactomannan(GM) test combined with CD4+T lymphocyte detection on early diagnosis of invasive aspergillosis (IA) in patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS).Methods197 AIDS patients who were suspected with IA in a hospital from January 2014 to December 2016 were analyzed retrospectively, they were divided into confirmed IA group (n=35), clinically diagnosed IA group (n=96, suspected cases), and non-IA group(n=66), sensitivity and specificity of GM test and GM test combined CD4+T lymphocyte counting for diagnosing IA were compared.ResultsIn confirmed IA group, clinically diagnosed IA group, and non-IA group, the medium values of GM (minimum, maximum) were 1.29(0.65，1.84)pg /mL, 0.91(0.36，1.23)pg /mL, and 0.11(0.28，0.72)pg /mL respectively, CD4+T lymphocyte counting were 45(29，69)cells/μL, 79(35，99)cells/μL, and 89(59，158)cells/μL respectively, GM value and CD4+T lymphocyte counting among three groups were significantly different(allP<0.05). The sensitivity and specificity of single GM test for diagnosing IA in AIDS patients were 64.9% and 72.7% respectively; sensitivity and specificity of two consecutive GM test within one week for diagnosing IA were 72.5% and 95.5% respectively; sensitivity and specificity of GM test combined CD4+T lymphocyte counting were 86.3% and 90.9% respectively.ConclusionGM test has better diagnostic value for IA in AIDS patients, continuous GM test and GM test combined CD4+T lymphocyte counting will further improve the clinical diagnostic value for IA.

galactomannan; CD4+T lymphocyte; acquired immunodeficiency syndrome; invasive aspergillosis

[Chin J Infect Control，2018，17(1)：36-40]

2017-04-10

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌青年基金(Z2013746)；廣西醫(yī)科大學青年科學基金(GXMUYSF201347)

柳明波(1979-)，男(漢族)，湖北省咸寧市人，主管技師，主要從事微生物檢驗及分子生物學研究。

柳明波 E-mail: mingabo@126.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2018.01.008

R519

A

1671-9638(2018)01-0036-05

孟秀娟、左雙燕)