吳 華,周曉君,李天嬌,黃東良

(海南省人民醫(yī)院,海南 ?？?570311)

·論著·

2016年海南省高毒力肺炎克雷伯菌的臨床分布、毒力基因和分子流行病學特點

吳 華,周曉君,李天嬌,黃東良

(海南省人民醫(yī)院,海南 ?？?570311)

目的分析2016年海南省某醫(yī)院高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)的臨床分布、莢膜分型、分子分型、毒力基因攜帶及藥敏情況。方法回顧性分析2016年1—12月該院臨床分離的肺炎克雷伯菌，通過黏液拉絲試驗選取hvKP，對菌株進行藥敏試驗，與普通肺炎克雷伯菌(cKP)比較；采用聚合酶鏈反應(PCR)法對菌株進行莢膜分型、毒力基因和耐藥基因檢測，采用脈沖場凝膠電泳(PFGE)和多位點序列分型(MLST)方法對菌株進行分子分型。結(jié)果共分離hvKP 84株，其中主要標本來源為痰(45株)；K1和K2是hvKP的主要莢膜型，ST23、ST65和ST86是hvKP的主要ST型；rmpA、aerobatin、allS、kfuBC和cf29a在hvKP中的攜帶率分別為90.48%、96.43%、42.86%、66.67%和53.57%，均高于cKP，PFGE發(fā)現(xiàn)allS基因僅存在于K1型；hvKP對抗菌藥物的耐藥率普遍低于cKP。結(jié)論痰是hvKP菌株，尤其是K1型hvKP的主要標本來源；超過90%的hvKP菌株攜帶rmpA和aerobatin基因，allS基因僅存在于K1型hvKP中。

肺炎克雷伯菌； 黏液表型； 毒力基因； 抗菌藥物； 耐藥性； 抗藥性，微生物； 莢膜分型； 分子分型

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)是一種常見的致病菌，廣泛分布于世界各地。二十世紀八十年代以來，東南亞地區(qū)報道了一種可導致社區(qū)獲得性感染，使患者發(fā)生原發(fā)性肝膿腫的高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，hvKP)，該菌除了引起肝膿腫，極易播散引起其他重要部位的轉(zhuǎn)移性感染，預后較差。KP根據(jù)莢膜多糖抗原的結(jié)構(gòu)可分為79個型別[1]，hvKP相關的型別主要有K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57和KN1[2]。hvKP菌株在血瓊脂平板上生長可表現(xiàn)出高黏液性，研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，hvKP攜帶黏液表型調(diào)節(jié)基因(rmpA)和氣桿菌素(aerobactin)，因此表現(xiàn)為高毒力。KP毒力相關的因素還包括菌毛、外膜蛋白、氮代謝等，對應的毒力基因為uge、mrkD、ureA、fimH、wabG等。血瓊脂平板上不表現(xiàn)高黏液性的菌株通常被認為是普通肺炎克雷伯菌(classicKlebsiellapneumoniae，cKP)，hvKP和cKP在莢膜分型、分子分型、毒力基因攜帶和對抗菌藥物的敏感性方面都存在差別。本文對某醫(yī)院2016年分離的hvKP進行標本分布、莢膜分型、分子分型、毒力基因攜帶及藥敏情況等方面分析，旨在為臨床診治hvKP引起的感染提供實驗室支持依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2016年1—12月海南省人民醫(yī)院就診患者分離的KP。痰或傷口分泌物分離病原菌時，應符合痰、傷口分泌物標本原始涂片上皮細胞<10個/低倍視野；同一患者重復分離的菌株只留取患者首次分離的菌株。

1.2 菌株定義 通過黏液拉絲試驗(string test，ST)對KP進行分類。用無菌接種環(huán)輕挑在血瓊脂培養(yǎng)基上生長16～18 h的KP，如有黏液絲形成且長度≥5 mm即判為ST陽性；反之，黏液絲長度<5 mm或無黏液絲形成則為ST陰性。病例組為ST陽性菌株，即為hvKP；對照組為ST陰性菌株，即為cKP。

1.3 菌株鑒定及藥敏分析 菌株鑒定采用VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)，根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)[5]標準進行藥敏試驗，檢測菌株對哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢西丁、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、環(huán)丙沙星的敏感性；藥敏所用藥物均購自英國OXOID公司。采用雙紙片法進行超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的檢測，紙片購自中國食品藥品鑒定研究院。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.4 莢膜分型與毒力基因檢測 采用聚合酶鏈式反應(PCR)方法檢測莢膜血清型K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57和毒力基因rmpA、aerobactin、allS、mrkD、kfuBC、cf29a、fimH和wabG。引物合成和擴增條件參照文獻[6]，引物由上海生工生物公司合成，擴增試劑購自日本Takara公司。

1.5 多位點序列分型(MLST)及耐藥基因檢測 采用PCR方法進行MLST和耐藥基因KPC-2和NDM-1的檢測。耐藥基因引物合成參照文獻[6] ，MLST的7個管家基因的引物序列參照MLST網(wǎng)站。PCR引物擴增后進行測序，測序結(jié)果提交至網(wǎng)站進行比對，分別得出每個位點的型別號，然后綜合7個位點的型別號得出每株菌的ST型別(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/)。

1.6 脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型 根據(jù)Han等[7]改良的方法對KP進行膠塊制備、酶切及電泳，PFGE電泳DNA大小的標記菌為Braenderup血清型沙門菌H9812。采用BioNumerics軟件對PFGE圖像和MLST結(jié)果進行處理和分析。

1.7 統(tǒng)計分析 應用WHONET 5.6軟件統(tǒng)計菌株對抗菌藥物的敏感、中介及耐藥率；應用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，兩組率的比較使用卡方檢驗或Fisher精確概率檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株情況 2016年1—12月共分離KP 571株，其中hvKP菌株84株，占所有KP的14.71%。84株hvKP菌株標本來源為痰45株，膿腫穿刺液或膿性分泌物16株，血和尿各7株，腹腔積液和其他無菌體液各4株，膽汁1株。對照組為隨機選取的72株cKP菌株，標本來源為痰23株，尿21株，傷口分泌物14株，膽汁5株，腹腔積液4株，血3株，腦脊液和關節(jié)液各1株。

2.2 菌株的莢膜分型及毒力基因攜帶情況 84株hvKP中K1型33株(39.29%)，其中有16株分離自痰標本；K2型18株(21.43%)，其中6株分離自痰標本，5株分離自膿腫或膿性分泌物；K20型7株(8.33%)，K5型和K54型各5株(各占5.95%)， K16、K57型各3株(各占3.57%)，另有10株ST陽性菌株不能被現(xiàn)有的引物所分型。hvKP和cKP 毒力基因的比較見表1。

2.3 MLST情況 84株hvKP中ST23型33株，ST86型11株，ST592型6株，ST65型5株，ST268、ST412和ST420型各3株，ST29型和ST1049型各2株，ST22、ST35、ST36、ST45、ST124、ST188、ST218、ST375、ST380、ST419、ST660、ST692、ST828、ST1764、ST1805、ST1853型各1株。K1型全部為ST23型， K2型中有11株為ST86型，5株為ST65型。見圖1。

2.4 PFGE分型情況 84株hvKP中有1株菌的PFGE分不出條帶，故只分析83株菌情況。莢膜型和ST型別一致者帶型較為接近或相似，不同者則帶型多樣，另發(fā)現(xiàn)allS基因幾乎全部為K1型。見圖1。

表1hvKP和cKP毒力基因的比較

Table1Comparison of virulence genes between hvKP and cKP

基因hvKP(n=84)株數(shù)比率(%)cKP(n=72)株數(shù)比率(%)χ2PrmpA7690．4822．78119．270．000aerobactin8196．4334．17132．790．000allS3642．8656．9425．810．000kfuBC5666．671520．8332．840．000cf29a4553．5756．9438．70．000mrkD84100．0072100．00 - -fim84100．0072100．00 - -wabG84100．0072100．00 - -

2.5 菌株的藥敏情況 hvKP對常用抗菌藥物的敏感性均高于cKP，且ESBLs的產(chǎn)生率(8.33%)也低于cKP(43.06%)，未發(fā)現(xiàn)對碳青霉烯類藥物耐藥的hvKP，發(fā)現(xiàn)5株對碳青霉烯類藥物不敏感的cKP，其中1株KPC-2陽性，1株NDM-1陽性。hvKP和cKP對抗菌藥物的藥敏情況比較見表2。

表2 hvKP和cKP對常用抗菌藥物的藥敏情況比較

*：指卡方值已校正

3 討論

hvKP最初報道來自肝膿腫患者，因其感染社區(qū)來源的無基礎疾病患者，而且感染菌株可由原發(fā)部位轉(zhuǎn)移播散至其他部位，故稱為hvKP。進一步研究發(fā)現(xiàn)，hvKP感染的患者可以單純表現(xiàn)為肺、腦和前列腺膿腫[8]，侵襲性感染的原發(fā)部位已不僅局限于肝臟，還可以侵犯多個部位。KP是引起呼吸道感染的主要病原菌[9]，本研究發(fā)現(xiàn)hvKP中，53.57%來自痰標本。鑒于肺泡的解剖結(jié)構(gòu)，肺部感染的細菌可能容易進入血流，然后隨血流到達其他部位引起的轉(zhuǎn)移性感染，所以hvKP肺部感染應引起臨床醫(yī)生的重視。

目前，hvKP在國際上尚無統(tǒng)一的定義標準，但是研究發(fā)現(xiàn)菌落的高黏液表型與菌株高毒力密切相關，菌落的高黏液表型是細菌耐受細胞吞噬作用和細胞殺傷作用的物質(zhì)基礎[10]。高黏液表型可通過ST試驗來判斷，故一般研究都將ST試驗作為hvKP的篩選試驗。另外，雖然高黏液的菌落肉眼看起來是黏稠的，但菌株的高黏液表型不能依據(jù)肉眼觀察黏液性狀來判斷，而必須根據(jù)ST試驗結(jié)果來判斷[11]。ST試驗操作簡單，不需要特殊的儀器設備，容易被臨床微生物工作者所接受。目前的研究結(jié)果尚未證實是否所有hvKP菌株都具有高黏性特征[2]，因而根據(jù)黏液表型可能會出現(xiàn)hvKP漏檢。莢膜被認為是KP最重要的毒力決定因素。臺灣的一項研究[12]發(fā)現(xiàn)，K1型是導致KP菌血癥最常見的血清型，K2型是呼吸道標本中最常見的血清型。但本研究發(fā)現(xiàn)，痰標本中hvKP最多的莢膜型別為K1型，可能存在地區(qū)差異。

注：K-type指莢膜分型，ST type指序列分型，S-type指標本類型( sp：痰，se：分泌物，ps：膿液，bl：血，cv：無菌中段尿；bi：膽汁，ab：腹腔積液；sf：腦脊液，pus：膿性分泌物，pu：引流液)

圖183株hvKP的PFGE聚類分析圖

Figure1Dendrogram based on PFGE of 83 hvKP strains

研究[3-4,11]發(fā)現(xiàn)，黏液表型調(diào)節(jié)基因(rmpA)和氣桿菌素(aerobactin)多存在于hvKP，說明以上兩種因素可增強KP的毒力。本研究中hvKP菌株rmpA和aerobactin陽性率均超過90%，而在cKP菌株中的陽性率則低于5%，因此，我們認為此兩種基因可用來鑒別hvKP和cKP。本組研究結(jié)果顯示，cf29a、allS和kfuBC 3個基因的陽性率，在hvKP中為42.86%～66.67%，在cKP中為6.94～20.83%，因此，不能用這三個基因區(qū)分hvKP和cKP。cf29a基因可以表達黏附素cf29k，研究表明，cf29a基因的檢出率與hvKP明顯相關[13]；allS基因可編碼尿囊素調(diào)節(jié)因子的活性劑，使hvKP在需氧和厭氧的條件下以尿囊作為碳源、氮源及能量源[13]；kfuBC基因表達產(chǎn)物參與鐵攝取系統(tǒng)，能通過螯合作用介導細菌吸收僅在人體腸道中才有的游離三價鐵，故可增強hvKP在腸道中的定植，kfuBC還與hvKP膿腫性眼內(nèi)炎高度相關[13]。本研究發(fā)現(xiàn)wabG、fimH和mrkD 3個基因在hvKP和cKP組之間差異無統(tǒng)計學意義。既往研究[14-16]發(fā)現(xiàn)，wabG可使KP耐受吞噬作用而促進感染，I型菌毛的尖端黏附素fimH基因是KP泌尿道感染的重要毒力因素，mrkD基因可通過III型菌毛促進生物膜的形成。

近年來，KP對碳青霉烯類藥物的耐藥率有升高的趨勢，與大多數(shù)文獻報道[17-18]一致。本研究中hvKP對抗菌藥物的耐藥率，以及ESBLs的產(chǎn)生率均低于cKP，可能與地區(qū)差異有關?？山雍腺|(zhì)粒造成的耐藥基因快速水平轉(zhuǎn)移對KP耐碳青霉烯類藥物起著重要的作用[19]；如Siu等[20]發(fā)現(xiàn)的1株K2型高毒力的菌株通過質(zhì)粒接受KPC-2基因而出現(xiàn)對碳青霉烯類藥物耐藥；Wei等[21]報道了ST23型hvKP從ST11型菌株獲得KPC-2基因的現(xiàn)象；KPC-2基因可以從cKP傳播給hvKP[6]。本研究發(fā)現(xiàn)了攜帶KPC-2基因的cKP菌株，因此，KPC-2基因可能傳播給hvKP，使其對碳青霉烯類藥物產(chǎn)生耐藥，醫(yī)院感染控制專職人員及臨床醫(yī)生應加強對KP感染的重視。

目前，分子分型技術已廣泛應用于細菌的溯源分析。由于PFGE分型技術分辨力高，被認為是暴發(fā)感染溯源中細菌分型的“金標準”。MLST技術由于操作簡單、可重復性好、已經(jīng)實現(xiàn)全球數(shù)據(jù)比對和綜合分析等優(yōu)勢，也成為臨床微生物科研常用的一種分型技術。本研究中同源性的菌株未發(fā)現(xiàn)標本類型的聚集，說明本研究菌株無明顯暴發(fā)。本研究顯示，allS基因幾乎只存在于K1型的hvKP，推測allS基因是K1型hvKP所特有的基因，可用來鑒定K1型hvKP。MLST分析發(fā)現(xiàn)，K1莢膜型菌株基本都是ST23型；而K2型菌株主要為ST86型和ST65型，但仍存在ST375和ST380型，存在多樣性，與臺灣的研究[22]結(jié)果基本一致。

總之，通過對醫(yī)院一年期間分離的KP進行研究，發(fā)現(xiàn)痰為hvKP的主要標本來源，臨床醫(yī)生應注意呼吸道標本中分離hvKP的意義。K1和K2型是hvKP最主要的莢膜型別，ST23、ST65和ST86是hvKP主要的ST型別。毒力基因aearobatin、allS、rmpA、kfuBC和cf29a在hvKP中的攜帶率均高于cKP，allS基因可以用于K1型hvKP的鑒定。盡管hvKP對抗菌藥物的耐藥率均低于cKP，耐藥性可以通過KPC-2基因進行傳播，應警惕獲得性耐藥的可能。

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Clinicaldistribution,virulencefactors,andmolecularepidemiologyofhypervirulentKlebsiellapneumoniaeinHainanProvincein2016

WUHua,ZHOUXiao-jun,LITian-jiao,HUANGDong-liang

(HainanGeneralHospital,Haikou570311,China)

ObjectiveTo investigate clinical distribution, capsular serotyping, molecular typing, virulence gene carriage, and antimicrobial susceptibility of hypervirulentKlebsiellapneumoniae(hvKP) strains isolated from a hospital in Hainan Province in 2016.MethodsKlebsiellapneumoniae(K.pneumoniae) isolated from the hospital between January and December 2016 were analyzed retrospectively, hvKP strains were selected through string test, antimicrobial susceptibility testing was performed and compared with classicK.pneumoniae(cKP); capsular serotyping, virulence genes, and drug resistance genes of hvKP strains were detected with polymerase chain reaction, molecular typing was performed with pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing.ResultsA total of 84 hvKP strains were isolated, the main specimen source was sputum(45 strains); K1 and K2 were the major capsular serotypes of hvKP, while ST23, ST65, and ST86 were the main sequence types of hvKP. The carriage rates ofrmpA,aerobatin,allS,kfuBC, andcf29ain hvKP were 90.48%, 96.43%, 42.86%, 66.67%, and 53.57% respectively, all of them were statistically higher than those of cKP strains, PFGE found thatallS was positive only among K1 strains; most antimicrobial resistance rates of hvKP were lower than those of the cKP.ConclusionSputum is the main specimen source of hvKP, especially K1 serotype; more than 90% of hvKP strains carryrmpA andaerobatingenes,allS gene only exists in K1 type hvKP.

Klebsiellapneumoniae; mucoid phenotype; virulent gene; antimicrobial agent; drug resistance; microbial; capsular serotyping; molecular typing

[Chin J Infect Control，2018，17(1)：10-15]

2017-04-16

海南省自然科學基金(20158266)

吳華(1980-)，女(漢族)，河南省開封市人，副主任技師，主要從事臨床微生物研究。

吳華 E-mail：syjykwuhua@163.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2018.01.003

R181.3+2

A

1671-9638(2018)01-0010-06

孟秀娟、左雙燕)