劉 偉 常 娜 潘昊君 李 昕

1)河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 開封 475000 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450014

·論著科研之窗·

CART阻抑對(duì)阿爾茨海默病大鼠記憶能力的影響

劉 偉1)常 娜1)潘昊君1)李 昕2)△

1)河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 開封 475000 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450014

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：100只Wistar大鼠由河南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量260～300 g。

1．2方法

1．2．2 大鼠記憶能力檢測(cè)：大鼠記憶能力檢測(cè)用Morris水迷宮方法檢測(cè)，水迷宮為高60 cm，直徑150 cm的圓形水池。將水迷宮劃分為4個(gè)象限，每個(gè)象限正上方有攝像機(jī)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，在第三象限放入一個(gè)白色的塑料泡沫為平臺(tái)，分別從4個(gè)象限的入水點(diǎn)把大鼠面向池壁的方向放在水池中，保持泳池中的水位在平臺(tái)上1 cm，水溫維持在22 ℃。記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間為逃避潛伏期(超過60 s記為60 s)，實(shí)驗(yàn)持續(xù)4 d，每天檢測(cè)4次，每次間隔時(shí)間為20 min，逃避潛伏期為最后平均值。5 d后撤掉平臺(tái)，將大鼠在第1象限正中點(diǎn)面朝池壁的方向放入水中，觀察并記錄大鼠在60 s內(nèi)穿過平臺(tái)的次數(shù)。所有大鼠在實(shí)驗(yàn)開始前1 d分別進(jìn)行2 min的適應(yīng)性訓(xùn)練。

1．2．4 RT-PCR檢測(cè)IDE、LRP-1、NEP水平：取100 mg的大鼠腦皮層組織，加入1 mL的Trizol溶液，混合后，放在室溫下裂解反應(yīng)5 min，加入氯仿(Trizol與氯仿比例為5：1)，劇烈震蕩15 s，放在室溫條件下靜置3 min，4 ℃，14 000 r/min離心10 min，吸取上清液至EP管中，加入500 μL的異丙醇，上下顛倒20次，靜置10 min，4 ℃，14 000 rpm離心10 min，棄上清液，用乙醇洗滌2次，晾干后，用DEPC水溶解，保存在-80 ℃?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR試劑盒檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平。

IDE上游引物：5’-CAAACACTGTTTATGGACTG-3’下游引物：5’-TGCTGAATTGAATGTGTACC-3’；LRP-1上游引物：5’-TCTTGGTGCCTTTTGTGTGAC-3’下游引物：5’-CTCTTCCTCGTTTTTGCTCTC-3’；GAPDH上游引物：5’-GCCAAGGCTGTGGGCAAGGT-3’下游引物：5’-TCTCCAGGCGGCACGTCAGA-3’；NEP上游引物：5’-AAAGCTAAAGAAGAAAACAG-3’下游引物：5’-CAGTGCCAACAAACAAAT-3’。

2 結(jié)果

2．1大鼠記憶能力檢測(cè)結(jié)果構(gòu)建的AD大鼠模型，經(jīng)CART連續(xù)處理16 d后，水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠記憶能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4 d訓(xùn)練后，模型組大鼠逃避潛伏期明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期與對(duì)照組大鼠相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組大鼠逃避潛伏期明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。如圖1A。第5天去除平臺(tái)后，模型組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。假手術(shù)組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1B。

注：A：逃避潛伏期；B：目標(biāo)象限停留時(shí)間；C：穿越平臺(tái)次數(shù)；1：對(duì)照組；2：假手術(shù)組；3：模型組；4：實(shí)驗(yàn)組；aP>0.05 vs 1；bP<0.01 vs 1；cP<0.01 vs 3圖1 CART對(duì)AD大鼠記憶能力的影響

注：1：對(duì)照組；2：假手術(shù)組；3：模型組；4：實(shí)驗(yàn)組；aP>0.05 vs 1；bP<0.01 vs 1；cP<0.01 vs 3圖2 CART對(duì)AD大鼠腦組織中A1-40水平的影響

注：A：mRNA相對(duì)表達(dá)水平；B：免疫印跡圖；C：蛋白相對(duì)表達(dá)量；1：對(duì)照組；2：假手術(shù)組；3：模型組；4：實(shí)驗(yàn)組；aP>0.05 vs 1；bP<0.01 vs 1；cP<0.01 vs 3圖3 CART對(duì)AD大鼠腦組織中IDE、NEP、LRP-1表達(dá)水平的影響

2．4 Tau蛋白磷酸化水平檢測(cè)結(jié)果Tau 5是磷酸化和非磷酸化的Tau 蛋白抗體，檢測(cè)Tau 5水平能夠反映組織中Tau蛋白的總體水平。模型組大鼠中Tau 5水平及Tau 磷酸化水平(Tau pSp199/202、TaupT231)明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組大鼠中Tau 5水平及Tau 磷酸化水平(Tau pSp199/202、TaupT231)明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。假手術(shù)組大鼠中Tau 5水平及Tau 磷酸化水平(Tau pSp199/202、TaupT231)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

注：A：免疫印跡圖；B：蛋白相對(duì)表達(dá)量；1：對(duì)照組；2：假手術(shù)組；3：模型組；4：實(shí)驗(yàn)組；aP>0.05 vs 1；bP<0.01 vs 1；cP<0.01 vs 3圖4 CART對(duì)AD大鼠腦組織中Tau蛋白磷酸化水平影響結(jié)果

A：免疫印跡圖；B：蛋白相對(duì)表達(dá)量；1：對(duì)照組；2：假手術(shù)組；3：模型組；4：實(shí)驗(yàn)組；aP>0.05 vs 1；bP<0.01 vs 1；cP<0.01 vs 3圖5 CART對(duì)AD大鼠腦組織中GSK-3水平的影響

3 討論

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EffectofCARTinhibitionofmemoryabilityofAlzheimer'sdiseaserats

LIUWei*，CHANGNa，PANHaojun，LIXin

*DepartmentofNeurology，HuaiheHospitalAffiliatedtoHenanUniversity，Kaifeng475000，China

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.24.001

2014年河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目，編號(hào)：201402018

△通信作者：李昕(1975-)，研究生，副主任醫(yī)師。研究方向：腦血管病、神經(jīng)變性病。Email：lzh999@126.com

R-332

A

1673-5110(2017)24-0001-06

(收稿2017-08-11)

王喜梅

信息：劉偉，常娜，潘昊君，等．CART阻抑對(duì)阿爾茨海默病大鼠記憶能力的影響[J]．中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2017，20(24)：1-6．