趙赟安 丁卉 胡曉蕾 黃建勝 趙志鋼

麗水市中心醫(yī)院產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的分子流行病學(xué)研究

趙赟安 丁卉 胡曉蕾 黃建勝 趙志鋼

目的 明確麗水市中心醫(yī)院產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的分子流行病學(xué)特征，為臨床抗感染治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法收集2011年3月至2015年10月麗水市中心醫(yī)院分離的碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥肺炎克雷伯菌（CR-KP）。采用Vitek2-compact系統(tǒng)鑒定菌株并聯(lián)合紙片擴(kuò)散法（K-B法）檢測(cè)其藥敏，改良Hodge試驗(yàn)檢測(cè)碳青霉烯酶；PCR法擴(kuò)增KPC基因，測(cè)序后利用BLAST比對(duì)確定基因型；腸桿菌科基因間重復(fù)序列分型法（ERIC-PCR）聯(lián)合多位點(diǎn)序列分型（MLST）鑒定菌種同源性；進(jìn)而探討產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的分子流行病學(xué)特征。結(jié)果 共收集到70株CR-KP，其中68株改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果均為blaKPC-2基因。ERIC-PCR結(jié)果顯示，70株KPC型肺炎克雷伯菌分為A、B、C、D、E5個(gè)克隆群分別為63株(90.0%)、3株、2株、1株、1株；MLST分成6個(gè)ST型，其中ST11型63株（90.0%)，ST35型2株，ST1型2株，ST592、ST1883、ST494型均1株。結(jié)論 麗水市中心醫(yī)院碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌的主要克隆群為ST11型，是我院流行感染的主要原因。

碳青霉烯酶 肺炎克雷伯菌 腸桿菌科重復(fù)序列 多位點(diǎn)序列分型 分子流行病學(xué)

肺炎克雷伯菌是臨床常見(jiàn)的條件致病菌之一，近年來(lái)隨著大量抗生素的廣泛使用導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥率居高不下，產(chǎn)碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌最主要的耐藥機(jī)制，其中在我國(guó)以產(chǎn)KPC酶為主[1]。筆者對(duì)我院分離到的耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌（CR-KP）擴(kuò)增KPC基因并測(cè)序比對(duì)，聯(lián)合腸桿菌科基因間重復(fù)序列分型技術(shù)（ERIC-PCR）和多位點(diǎn)序列分型（MLST）對(duì)陽(yáng)性菌株進(jìn)行分子流行病學(xué)分析，分析麗水地區(qū)產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷菌伯流行特征。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2011年3月至2015年10月我院從臨床分離的碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌，剔除重復(fù)菌株。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心惠贈(zèng)，KPC陽(yáng)性肺炎克雷伯菌IR79由浙江大學(xué)附屬兒童醫(yī)院細(xì)菌室周明明惠贈(zèng)。

1.2 儀器與試劑 藥敏MH培養(yǎng)基和藥敏紙片均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，包括頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、頭孢西丁、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、妥布霉素、復(fù)方磺胺甲惡唑、左氧氟沙星、阿米卡星、米諾環(huán)素、多黏菌素B、磷霉素。Vitek-2compact細(xì)菌鑒定儀購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司。

1.3 藥物敏感性試驗(yàn) 采用Vitek2-compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)聯(lián)合紙片擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，藥敏結(jié)果按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2015 年的標(biāo)準(zhǔn)判定[2]。

1.4 改良Hodge試驗(yàn) 配制大腸埃希菌ATCC259220.5麥?zhǔn)蠞岫龋?∶10稀釋后均勻涂布于M-H平板，平板中央貼厄他培南紙片（10μg）。接種環(huán)挑取2～3個(gè)待測(cè)菌菌落，以紙片邊緣為起點(diǎn)離心方向劃線接種，35℃培養(yǎng)18～24h后觀察結(jié)果。大腸埃希菌ATCC25922為陰性對(duì)照菌株，肺炎克雷伯菌IR79為陽(yáng)性對(duì)照株。若抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)“矢”狀者為陽(yáng)性。

1.5 KPC基因檢測(cè) PCR引物參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[3]，由上海生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系（50μl）：模板4μl，上下游引物各 2μl，HieffTMPCRMasterMix 混合液25μl，加水至 50μl。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性 5min，94℃變性 30s，55℃退火 50s，72℃延伸 1min，循環(huán) 35 次，最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，120V，30min。PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與GenBank基因庫(kù)中遞交的序列進(jìn)行比較（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）。

1.6 腸桿菌基因間重復(fù)共有序列聚合酶鏈反應(yīng)（ERIC-PCR）分型 熱裂解法提取細(xì)菌DNA。選用腸桿菌科細(xì)菌廣泛存在于菌體DNA中的重復(fù)序列ERIC1：3′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-5′，ERIC2：3′-AAG －TAAGTGACTGGGGTGAGCG-5′作為引物，參照文獻(xiàn)[4]。反應(yīng)體系（25μl）：模板 2μl，上下游引物各 1μl，HieffTMPCRMasterMix混合液 12.5μl，加水至 25μl。PCR 擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性 1min，94℃變性 1min，42℃退火 1min，68℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)，68℃延伸8min。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中120V電泳30min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。PCR擴(kuò)增條帶數(shù)量及位置相同者為同一克隆群，主要條帶位置相同，副條帶相差1條的為亞型。否則為不同克隆群[5]。

1.7 多位點(diǎn)序列分型 使用MLST網(wǎng)站提供的肺炎克雷伯菌 7個(gè)管家基因（rpoB,gapA,mdh,pgi,phoE,infB,tonB）設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增目的序列并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交到PubMLST網(wǎng)站比對(duì)確定ST型。實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件參考網(wǎng)址：http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html

1.8 臨床資料收集 收集菌株的分離時(shí)間、科室、樣本類(lèi)型等資料，查閱患者病歷獲取臨床資料并進(jìn)行匯總分析。

2 結(jié)果

2.1 blaKPC-2基因檢測(cè)結(jié)果 2011年3月至2015年9月共收集到70株KPC型肺炎克雷伯菌，測(cè)序后結(jié)果提交至NCBI網(wǎng)站比對(duì)均為blaKPC-2基因，見(jiàn)圖1。

圖1 部分KPC基因陽(yáng)性菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌藥物敏感性結(jié)果 藥敏結(jié)果顯示CR-KP對(duì)大多數(shù)β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素高度耐藥，對(duì)慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、米諾環(huán)素耐藥率低分別為64.28%、68.57%、28.57%、11.42%，未分離到多黏菌素B耐藥的菌株，見(jiàn)表1。

表1 產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌對(duì)常用抗生素的耐藥率（%）

2.3 ERIC-PCR同源性分析 結(jié)果提示70株KPC型肺炎克雷伯菌分為 5類(lèi)克隆群（A、B、C、D、E），A 類(lèi)為主要克隆群有63株，B、C、D、E為散發(fā)的克隆群分別有3、2、1、1株。ERIC分型匯總歸納結(jié)果如圖2。

圖2 ERIC分型結(jié)果電泳圖（M為DNA標(biāo)志物，1號(hào)代表E類(lèi)克隆群，2號(hào)代表D類(lèi)克隆群，3、4、5代表B類(lèi)克隆群，6、7代表C類(lèi)克隆群，8、9、10、11、12、13 代表 A 類(lèi)克隆群）

2.4 MLST分型結(jié)果 對(duì)所有菌株的7個(gè)管家基因進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)序比對(duì)得到6個(gè)ST型，其中以ST11型為主，共有63株占（90.0%），全為ERIC分型中的A克隆群，ST35和 ST1型各 2株，ST592、ST1883和 ST494型各1株，歸納結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌MLST分型歸納結(jié)果（株）

2.5 耐藥菌臨床分布流行特征 70株產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌中，痰液53株（76.0%），尿液10株（14.0%），其余標(biāo)本7株（10.0%）。在2011年和2015年我院分離到較多的耐藥菌株分別為26株和22株，其中ICU分別為15株和14株曾爆發(fā)小規(guī)模流行，見(jiàn)表3。全院12個(gè)科室都曾分離到耐藥菌，70株致病菌中39株分離自ICU 病房（56.0%），15株來(lái)自腦外科（21.0%），ICU 和腦外科病房為我院感染流行的主要病區(qū)，見(jiàn)表4。

表3 2011和2015年ICU和全院菌株數(shù)據(jù)（株）

表4 臨床各科室菌株分離情況（株）

3 討論

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院內(nèi)常見(jiàn)的條件致病菌，可引起呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及血液系統(tǒng)等感染。近年來(lái)由于抗生素的大量使用，使肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥率逐年增加，有報(bào)道指出2006年國(guó)內(nèi)肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥率只有不到1.0%[6]，到2012年就高達(dá)10.8%[7]。目前，碳青霉烯酶包括Ambler分類(lèi)中的A類(lèi)、B類(lèi)和D類(lèi)[8-9]。KPC酶是一種容易在肺炎克雷伯菌中流行的A類(lèi)碳青霉烯酶，其活性部位為絲氨酸殘基，主要水解頭孢菌素、青霉素類(lèi)等抗生素。由于KPC基因位于質(zhì)粒上，可通過(guò)轉(zhuǎn)座子、插入序列等結(jié)構(gòu)在不同菌株間傳播，容易造成流行感染，應(yīng)當(dāng)高度重視。

本研究中70例產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌基因型均為KPC-2型，與國(guó)內(nèi)陸續(xù)報(bào)道的文章相符[10-13]。實(shí)驗(yàn)藥敏結(jié)果顯示CR-KP對(duì)大多數(shù)β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素高度耐藥，對(duì)慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、米諾環(huán)素耐藥率較低分別為64.2%、68.5%、28.5%、11.4%，未分離到多黏菌素B耐藥的菌株。本研究聯(lián)合ERIC分型技術(shù)和MLST分型技術(shù)對(duì)70株耐藥菌進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn):ST11型產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌為主要流行菌株有63株（90.0%），與杭州、寧波、紹興等地區(qū)曾報(bào)道的結(jié)果一致[14-15]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)所有的ST11型CR-KP均來(lái)自同一菌群（ERIC分型中主要克隆群A）。兩種方法得到基本一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明ST11型CR-KP為麗水地區(qū)主要耐藥菌群。雖然我院耐藥菌基本來(lái)源于同一克隆群（ST11型），但仍需警惕其他克隆群菌株的流行。本研究還發(fā)現(xiàn) 5 種散發(fā) ST 型：ST1、ST35、ST592、ST494、ST883，其中ST35型2株分離自ICU病區(qū)同一床位的前后2例患者，ST1型2株則來(lái)自呼吸內(nèi)科相鄰2個(gè)床位的患者。這種現(xiàn)象說(shuō)明耐藥菌很可能通過(guò)床頭柜、椅子、消毒不徹底的棉被等在病區(qū)傳播，造成交差感染。

在匯總臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，我院的ICU和腦外科為院內(nèi)感染的主要感染病區(qū)，70株致病菌中39株分離自ICU病房占56.0%，15株來(lái)自腦外科占21.0%，2011年分離得到的26株耐藥菌株，ICU15株（58.0%）；2015年分離到22耐藥株，ICU14株（64.0%）。2011年產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌首次在ICU爆發(fā)小規(guī)模流行（2011年7至8月內(nèi)分離得到10株菌株均為ST11型），之后3年檢出率明顯下降，但在2015年6至8月ICU又爆發(fā)小規(guī)模感染（3個(gè)月的時(shí)間分離得到11株菌株為ST11型）。分析發(fā)現(xiàn)ICU容易爆發(fā)流行感染很可能與入住ICU的患者常同時(shí)具備多種危險(xiǎn)因素，長(zhǎng)期住院、患者機(jī)體功能差、侵襲性操作、免疫抑制狀態(tài)及前期使用抗生素等緊密相關(guān)[16-17]。同時(shí)ICU病房患者的轉(zhuǎn)診治療很可能為耐藥菌院內(nèi)傳播的重要途徑。

為了減少院內(nèi)感染發(fā)生，我們不僅加強(qiáng)宣傳醫(yī)院感染的相關(guān)知識(shí)，增強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員和患者家屬防護(hù)意識(shí)，做到早期監(jiān)測(cè)、控制和隔離，而且加強(qiáng)各個(gè)科室之間的交流合作，防止因?yàn)檗D(zhuǎn)科治療而發(fā)生交叉感染。嚴(yán)格要求各個(gè)科室增加診療環(huán)境及物品消毒頻次，做到深度消毒，并取得了良好的成果。

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Genotyping of KPC-producing Klebsiella pneumoniae isolated from Lishui Central Hospital

ZHAO Yun’an,DING Hui,HU Xiaolei,et al.
Clinical Laboratory，Lishui Central Hospital,Lishui 323000, China

Objective To identify the genotypes of KPC-producing Klebsiella pneumoniae isolated from Lishui Central Hospital. Methods Seventy clinical strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae (CR-KP)were isolated from Lishui Central Hospital from March 2011 to October 2015.The strains were identified with Vitek2-compact system,and drug sensitivity was detected with disk diffusion method(K-B method).The modified Hodge test was used to detect carbapenemase;KPC gene was amplified with PCR,and BLAST was used to determine the genotype after the sequencing.Enterobacteriaceae intergenic repetitive sequence classification (ERIC-PCR)and multiple loci sequence classification (MLST)were used to identify the homology of strains. Results Among 70 strains of CR-KP,68 strains were modified Hodge test positive and confirmed to carry blaKPC-2 gene.ERIC-PCR showed that there were 63 strains of group A(90.0%),3 of group B,2 of group C,1 of group D and 1 of group E.MLST showed that there were 63 strains of ST11(90.0%),2 of ST35,2 of ST1,1 of ST592,1 of ST1883 and 1 of ST494,respectively. Conclusion ST11 is the main genotype of KPC-producing Klebsiella pneumoniae isolated from Lishui Central Hospital.

Carbapenemase Klebsiellapneumoniae Enterobacteriaceae intergenic repetitive sequence Multipleloci sequence Molecular epidemiology

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.24.2017-962

浙江省麗水市公益性技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目（2014GYX023）

323000 麗水市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科

趙志鋼，E-mail:zjlszzg@163.com

2017-04-26）

嚴(yán)瑋雯）