黃欣 高清平

CCLG-ALL2008誘導(dǎo)緩解方案化療兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的效果觀察

黃欣 高清平

目的 探討CCLG-ALL2008誘導(dǎo)緩解方案化療兒童急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）的效果。方法 回顧性選取ALL患兒134例，其中67例（觀察組）給予CCLG-ALL2008誘導(dǎo)緩解方案化療，另67例（對照組）給予常規(guī)多藥聯(lián)合化療。觀察并比較兩組患兒療效、化療不良發(fā)應(yīng)發(fā)生率、化療后熱休克蛋白90（Hsp90）表達(dá)水平、5年生存率。結(jié)果 觀察組患兒治療有效率高于對照組（P＜0.05），化療不良反應(yīng)發(fā)生率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），化療后Hsp90 mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于對照組（均P＜0.05），5年生存率高于對照組（P＜0.05）。結(jié)論 CCLG-ALL2008誘導(dǎo)緩解方案化療兒童ALL，效果確切，預(yù)后相對較佳，值得臨床應(yīng)用。

CCLG-ALL2008 兒童急性淋巴細(xì)胞白血病 Hsp90 預(yù)后

急性白血病是血液系統(tǒng)的一類惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康[1]。兒童是急性白血病的高發(fā)群體，其中3/4為急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）。ALL的發(fā)病率和病死率均較高，在兒童病死原因中居第2位[2]。目前臨床對ALL的主要治療方法是化療，但ALL發(fā)病原因多樣、病情復(fù)雜多變，治療相對困難，預(yù)后欠佳易復(fù)發(fā)[3]。且化療亦嚴(yán)重?fù)p害人體正常組織，引發(fā)各種不良反應(yīng)，加上耐藥性的出現(xiàn)，化療效果大打折扣[4]。如何提高化療效果、減少不良反應(yīng)是目前臨床研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。熱休克蛋白90（Hsp90）是一類分子伴侶蛋白，在腫瘤細(xì)胞中具有調(diào)節(jié)多種癌蛋白的功能，參與腫瘤細(xì)胞的生存、增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲等病理過程；有效抑制白血病細(xì)胞內(nèi)Hsp90的活性，可使白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡和分化，緩解病情[5]。CCLG-ALL2008方案是中國兒童白血病協(xié)助組（CCLG）制定的一種化療方案。有研究顯示，CCLGALL2008誘導(dǎo)緩解方案化療ALL可在最短時間內(nèi)殺死白血病細(xì)胞，獲得有效緩解[6]?；诖?，本研究旨在觀察CCLG-ALL2008誘導(dǎo)緩解方案化療兒童ALL的效果，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 回顧性選取2010年4月至2012年3月本院收治的經(jīng)骨髓穿刺術(shù)檢查確診為ALL的患兒134例（排除既往接受過化療者），其中67例（觀察組）給予CCLG-ALL2008誘導(dǎo)緩解方案化療，另67例（對照組）給予常規(guī)多藥聯(lián)合化療。兩組患兒性別、年齡、BMI、WBC比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2化療方法

1.2.1 觀察組 給予CCLG-ALL2008誘導(dǎo)緩解方案化療。（1）第 1～7天：給予潑尼松片（Pred）（生產(chǎn)廠家：天津力生制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H12020123），用量：60mg/（m2·d）；（2）第8～：停止給予Pred改為給予地塞米松（Dex），第29天開始減量，3d減半，9d減停；第8天和第15天給予柔紅霉素（DNR）（生產(chǎn)廠家：Actavis Italy S.p.A.，批準(zhǔn)文號：H20100552）共 2 次，每次用量：30mg/m2；第 8、15、22、29 天給予門冬酰胺酶（L-ASP）（生產(chǎn)廠家：貴州千紅生化制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H120023613），1次/3d，每次 5 000U/m2；第 8、11、14、17、20、23、26、29 天給予長春新堿（VCR）（生產(chǎn)廠家：浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H120043326）共8次，每次用量：1.5mg/m2；（3）第 1、15、33 天給予氨甲喋呤（MTX）治療，劑量為：1～5g/m2，治療期間進(jìn)行腎功能密切監(jiān)測，血清肌酐值（Scr）＜1.2mg/dl，則常規(guī)給藥劑量：5g/m2；Scr在 1.2～2mg/dl，則劑量減半；若＞2mg/dl，則給予 1g/m2。

1.2.2 對照組 給予常規(guī)多藥聯(lián)合化療。（1）第1～7天：給予Pred，用量：60mg/（m2·d）；（2）第8～天：繼續(xù)給予Pred，第29天開始減量，7d后減停；第8天和第9天加用DNR共2次，每次用量：30mg/m2；給予L-ASP，1次/3d，每次 5 000U/m2；第 8、15、22、29 天給予 VCR，每次用量：1.5mg/m2。

1.3 Hsp90表達(dá)水平檢測 留取患兒化療后骨髓液4ml，加入4ml淋巴細(xì)胞分離液，2 000rpm離心20min，提取單個核細(xì)胞，-80℃冰箱備存。

1.3.1 RT-PCR法檢測Hsp90 mRNA表達(dá)水平 （1）嚴(yán)格按照Trizol試劑盒（杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司）說明書提取組織總RNA；（2）引物設(shè)計：實(shí)驗(yàn)引物均由上海博亞生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成；Hsp90引物序列為正義鏈 5′-GAGAGCCTGACAGACCC-3′，反義鏈 5′-GCCCAATCATGGAGATGT-3′；β-actin 正義鏈 5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反義鏈 5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′；（3）采用 Access RTPCR系統(tǒng)（美國Promega公司）將組織總RNA擴(kuò)增成DNA目的片段，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性2min，95℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 30s，30 個循環(huán)，72℃終延伸10min；（4）PCR產(chǎn)物經(jīng)EB染色和1.8%瓊脂糖凝膠電泳后，采用紫外分析儀觀察，并采用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，用Hsp90 mRNA與β-actin的灰度比值表示Hsp90 mRNA的相對表達(dá)水平。

1.3.2 Western blot法檢測Hsp90蛋白表達(dá)水平 （1）采用改良異硫氰酸胍法提取總蛋白，-80℃下凍存；（2）蛋白濃度采用NanoDrop分光光度計測量，將蛋白溶入等體積的緩沖液中煮沸10min，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離；（3）將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上；（4）PVDF膜置入封閉液中，4℃下振蕩60min，加入一抗（1∶100稀釋），4℃過夜，漂洗3次（每次 10min），加入二抗（1∶1 000稀釋），37℃孵育 120min，漂洗 3次（每次10min）后，與X線膠片共同放入暗盒內(nèi)曝光3min，常規(guī)顯影與定影，將Hsp90與β-actin蛋白的灰度值比值作為Hsp90蛋白相對表達(dá)水平。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察并比較兩組患兒療效、化療不良發(fā)應(yīng)發(fā)生率、化療后Hsp90表達(dá)水平、5年生存率。

1.4.1 患兒療效 判斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）完全緩解：臨床癥狀消失；血象：Hb≥100g/L、PLT≤100×109/L、中性粒細(xì)胞絕對值≥1.5×109/L，原始粒細(xì)胞≤5%，外周血分類無白血病細(xì)胞，WBC及巨核細(xì)胞正常；（2）部分緩解：5%＜骨髓原粒細(xì)胞≤20%，臨床癥狀和血象中任1項(xiàng)未完全達(dá)標(biāo)；（3）未緩解：臨床癥狀、髓象及血象均未達(dá)到完全緩解和部分緩解。完全緩解或部分緩解視為治療有效。

1.4.2化療不良反應(yīng) 包括惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、PLT減少及感染發(fā)生。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法估計兩組患者的生存率并繪制生存曲線，兩組患者生存率的比較采用log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒療效及化療不良反應(yīng)發(fā)生率比較 觀察組患兒化療后完全緩解56例，部分緩解8例，未緩解3例，發(fā)生化療不良反應(yīng)11例。對照組患兒化療后完全緩解39例，部分緩解9例，未緩解19例，發(fā)生化療不良反應(yīng)12例。觀察組治療有效率高于對照組（95.52%vs 71.64%，P＜0.05），化療不良反應(yīng)發(fā)生率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（16.42%vs 17.91%，P＞0.05）。

2.2 兩組患兒化療后Hsp90表達(dá)水平比較 見圖1-2、表 2。

圖1 兩組患兒化療后Hsp90 mRNA的凝膠電泳結(jié)果（M：DNA marker）

圖2 兩組患兒化療后Hsp90蛋白的凝膠電泳結(jié)果

表2 兩組患兒化療后Hsp90表達(dá)水平比較

由圖1-2、表2可見，觀察組患兒化療后Hsp90 mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于對照組（均P＜0.05）。

2.3 兩組患兒5年生存率比較 見圖3。

圖3 兩組患兒生存曲線比較

由圖3可見，觀察組患兒5年生存率高于對照組（22.39%vs 17.91%，P＜0.05）。

3 討論

白血病屬于造血干細(xì)胞惡性克隆性的疾病，通常是因造血干/祖細(xì)胞發(fā)生惡變后，引起細(xì)胞增殖、分化及凋亡的異常，從而導(dǎo)致大量白血病細(xì)胞增加，正常造血途徑受抑制[7]。白血病因基因突變的誘發(fā)而產(chǎn)生，通常是多個基因相互作用的結(jié)果，其突變主要表現(xiàn)為基因（造血細(xì)胞發(fā)育與分化基因、凋亡基因、細(xì)胞周期基因等）片段丟失或增加、點(diǎn)突變（ras基因）、基因融合及染色體（免疫球蛋白重鏈、T淋巴細(xì)胞抗原受體基因、酪氨酸激酶染色體等）易位等。這種突變是多途徑的復(fù)雜過程，最終導(dǎo)致原癌基因被激活，而抑癌基因滅活，從而使細(xì)胞正常增殖、凋亡被干擾，相互之間平衡被破壞，白血病細(xì)胞過度聚集及分化，對正常血液細(xì)胞生成產(chǎn)生影響，并會侵襲其他臟器組織[8-9]。

ALL的治療方法較多，包括生物治療、放療、多藥聯(lián)合化療及造血干細(xì)胞移植等，目前多藥聯(lián)合化療仍是主要的治療方法[10]。誘導(dǎo)緩解化療在整個ALL治療過程中具有重要意義，CCLG-ALL2008誘導(dǎo)緩解化療方案是多藥聯(lián)合化療，主要包括激素、VCR、DNR及L-ASP等，可在較短時間內(nèi)殺死白血病細(xì)胞，取得緩解效果[11]。本研究結(jié)果顯示，觀察組治療有效率高于對照組，兩組化療不良反應(yīng)發(fā)生率無統(tǒng)計學(xué)差異。分析原因可能是CCLG-ALL2008誘導(dǎo)緩解化療方案未全程使用Pred，而是在Pred試驗(yàn)結(jié)束后改用Dex，且鞘內(nèi)注射未選用3藥聯(lián)合而僅3次MTX單藥鞘內(nèi)注射。Dex的半衰期較長，化療不良反應(yīng)較小，尤其在ALL初治時，患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷較高，化療對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行破壞溶解時的不良反應(yīng)會被放大，患者不耐受會影響化療效果，并使化療風(fēng)險增高，甚至引發(fā)因化療死亡事件的發(fā)生。在誘導(dǎo)緩解化療時需平衡利弊，采取合適的化療方案，CCLGALL2008誘導(dǎo)緩解化療方案在不增加化療不良反應(yīng)的同時提高療效[12]。另外，ALL化療時常出現(xiàn)多藥耐藥現(xiàn)象，白血病細(xì)胞對某一種化療藥物產(chǎn)生耐藥后，會繼而對其他多種藥物產(chǎn)生交叉耐藥，從而使化療失敗[13]。而CCLG-ALL2008誘導(dǎo)緩解方案在第8天時采取Dex替代Pred，由于Dex的半衰期較長，觀察組高劑量Dex的使用可大大降低耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，因此化療效果更顯著[14]。CCLG-ALL2008誘導(dǎo)緩解方案不僅減少鞘內(nèi)注射的次數(shù)，更將3聯(lián)藥物減至單藥注射，從而大大降低各種不良反應(yīng)的發(fā)生，減少對器官的損傷及感染的發(fā)生。

Hsp90是Hsp家族中的成員之一，最初在升高溫度的細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，是所有真核及原核細(xì)胞生存所必需的分子伴侶，后來被證實(shí)在多種細(xì)胞中廣泛存在[15]。Hsp90在信號蛋白的構(gòu)象成熟及穩(wěn)定和參與細(xì)胞生長中起重要作用，Hsp90含量可占正常細(xì)胞總蛋白的1%～2%，對機(jī)體具有保護(hù)作用，而在腫瘤細(xì)胞中其含量可翻倍表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移通過調(diào)節(jié)癌蛋白而參與其過程[16]。本研究結(jié)果顯示，觀察組患兒化療后Hsp90 mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于對照組。這是因?yàn)镠sp90在細(xì)胞質(zhì)中無處不在，且會與多種蛋白結(jié)合形成多伴侶復(fù)合物，參與白血病細(xì)胞增殖及存活的信號傳導(dǎo)途徑，并參與白血病細(xì)胞的耐藥過程[17]。而CCLG-ALL2008誘導(dǎo)緩解方案化療通過Pred與Dex的適時的替代治療，可對Hsp90進(jìn)行有效抑制，阻斷Hsp90對白血病細(xì)胞蛋白的釋放，改變其對惡性腫瘤細(xì)胞生存和生長的潛能作用，因此Hsp90表達(dá)越低，說明緩解效果越好。

本研究結(jié)果顯示，觀察組患兒5年生存率明顯高于對照組。分析原因可能是通過CCLG-ALL2008誘導(dǎo)緩解方案化療可使患兒更加完全順利的渡過第一階段的治療，縮短骨髓抑制時間的同時降低感染，可提高患兒的治療依從性并降低復(fù)發(fā)率，利于預(yù)后。

綜上所述，CCLG-ALL2008誘導(dǎo)緩解方案化療兒童ALL，效果確切，化療不良反應(yīng)發(fā)生率較低，預(yù)后相對較佳，值得臨床應(yīng)用。

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Efficacy of CCLG-ALL2008 inducing remission chemotherapy in children with acute lymphoblastic leukemia

HUANG Xin,GAO Qingping.
Department of Hematology,People's Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China

Objective To evaluate the efficacy of CCLG-ALL2008 induction chemotherapy in children with acute lymphoblastic leukemia(ALL). Methods One hundred and thirty four children with ALL were treated with chemotherapy,including 67 cases receiving CCLG-ALL2008 induced remission chemotherapy (study group)and 67 cases receiving conventional multi-drug combination chemotherapy (control group).The curative effect,incidence of adverse reactions,expression of heat shock protein 90 (Hsp90)after chemotherapy and the 5-year survival rate were observed and compared between the two groups. Results The effective rate in study group was higher than that in control group(P＜0.05).There was no significant difference in incidence of adverse reactions between two groups(P＞0.05).After chemotherapy,the expression of Hsp90 mRNA and protein in study group was lower,and the 5-year survival rate was higher than those in control group(P＜0.05).Conclusion CCLG-ALL2008 inducing remission chemotherapy is more effective than conventional chemotherapy in children with ALL.

CCLG-ALL2008 Childhood acute lymphoblastic leukemia Hsp90 Prognosis

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.24.2017-1178

430060 湖北，武漢大學(xué)人民醫(yī)院血液科

高清平，E-mail：gaoqingping@163.com

2017-05-22）

李媚）