張海波 ，張英 *

（1.陜西省種子管理站，西安710018；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(西安)，西安710018）

棉花種子中轉(zhuǎn)基因成分篩查策略

張海波 1，2，張英 1，2*

（1.陜西省種子管理站，西安710018；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(西安)，西安710018）

2015年中國棉花產(chǎn)量560萬t[1]，約占世界棉花產(chǎn)量的四分之一[2]。棉花棉鈴蟲在中國各棉區(qū)普遍發(fā)生[3]，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的大規(guī)模應(yīng)用，有效地降低了棉鈴蟲的危害[4-5]。2015年，中國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種植面積為370萬hm2[6-7]，國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉已占到99%的市場份額[8]。

由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，轉(zhuǎn)基因作物在應(yīng)用前必須經(jīng)過安全性評(píng)價(jià)[6]。棉花是中國目前唯一轉(zhuǎn)基因商業(yè)化種植的主要農(nóng)作物，加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花種子的監(jiān)管，是轉(zhuǎn)基因棉花種子產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要保障[9-10]。棉花種子的轉(zhuǎn)基因監(jiān)管，包括對(duì)非轉(zhuǎn)基因棉花種子（未標(biāo)注“轉(zhuǎn)基因”字樣的棉花種子）的監(jiān)管和對(duì)轉(zhuǎn)基因種子（標(biāo)注“轉(zhuǎn)基因”字樣的棉花種子）的監(jiān)管。對(duì)非轉(zhuǎn)基因棉花種子的監(jiān)管主要是防止轉(zhuǎn)基因種子混入非轉(zhuǎn)基因種子中非法擴(kuò)散；對(duì)轉(zhuǎn)基因種子的監(jiān)管主要是測定轉(zhuǎn)基因種子的特征特性純度。種子檢驗(yàn)是種子監(jiān)管的技術(shù)支撐，以上兩方面的監(jiān)管將產(chǎn)生大量需要檢測的樣品?？焖佟?zhǔn)確、科學(xué)地對(duì)大量樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測，是當(dāng)前轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)所面臨的一個(gè)關(guān)鍵問題[11]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)以其敏感、快速、簡便等特點(diǎn)，成為最適合轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品快速檢測的技術(shù)[12]。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的篩查法檢測，適合對(duì)大量樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測。中國棉花種子市場主要是國內(nèi)抗蟲棉品種，因此，監(jiān)管的重點(diǎn)也是國內(nèi)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。本研究根據(jù)中國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種子市場情況，分析了抗蟲棉常用的插入基因和調(diào)控元件，選取合適的基因元件組合，建立轉(zhuǎn)基因棉花篩查的靶標(biāo)元件和檢測方法，并對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花種子的轉(zhuǎn)基因特征特性純度檢測進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

非轉(zhuǎn)基因棉花種子新陸早36號(hào)，轉(zhuǎn)Bt基因棉花種子中植棉2號(hào)、中棉所41、中棉所45、中棉所79、魯棉研21號(hào)、魯棉研28號(hào)、魯棉研29號(hào)、魯棉研36號(hào)、魯6269、魯7619、K836和瑞棉1號(hào)，由陜西省農(nóng)作物種子檢驗(yàn)站收集；某轉(zhuǎn)基因抗蟲棉商品種子，購自雨潤西安農(nóng)副產(chǎn)品全球采購中心糧油種子銷售區(qū)。

PCR 擴(kuò)增試劑（Premix ExTaq，R003A）、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（Marker DL1000，貨號(hào)：3591A）購自寶生物工程（大連）有限公司。擴(kuò)增引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2 轉(zhuǎn)基因棉花安全證書批準(zhǔn)情況分析

轉(zhuǎn)基因棉花品種在商業(yè)化應(yīng)用前必須經(jīng)過轉(zhuǎn)基因生物安全性評(píng)價(jià)[6]，通過安全性評(píng)價(jià)的授予《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書》。根據(jù)農(nóng)業(yè)部“轉(zhuǎn)基因權(quán)威關(guān)注”網(wǎng)站中“審批信息”板塊相關(guān)內(nèi)容[13]，查詢了我國自1996年安全性評(píng)價(jià)申報(bào)以來，至2016年獲批《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書》的轉(zhuǎn)基因棉花品種，對(duì)其轉(zhuǎn)入的外源基因進(jìn)行了分析歸類和統(tǒng)計(jì)分析，以此作為轉(zhuǎn)基因棉花篩查策略分析的基礎(chǔ)。

1.3 轉(zhuǎn)基因棉花篩查策略分析

轉(zhuǎn)基因棉花的篩查是對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花中通用元件進(jìn)行檢測。根據(jù)轉(zhuǎn)基因棉花的外源插入元件情況，挑選使用頻率最高和覆蓋全部已知轉(zhuǎn)基因棉花的少數(shù)幾個(gè)外源元件作為檢測靶標(biāo)，如果檢測出其中任何一個(gè)元件，表明該樣品中含有轉(zhuǎn)基因棉花。如果檢測結(jié)果都為陰性，則表明樣品中未檢出已知轉(zhuǎn)基因棉花[14]。根據(jù)轉(zhuǎn)基因棉花篩查原則和轉(zhuǎn)基因棉花安全證書批準(zhǔn)情況，確定轉(zhuǎn)基因棉花檢測的篩查策略。

1.4 基因組DNA提取

樣品基因組DNA的提取采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的新型植物基因組DNA提取試劑盒 （貨號(hào)：DP320）。用紫外分光光度計(jì)ND2000（賽默飛世爾科技公司，Thermo Fisher Scientific）測定獲得DNA的純度和質(zhì)量濃度。8 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳和EB染色檢測DNA樣品的完整性。棉花內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因SadⅠ擴(kuò)增[15]測定DNA樣品中是否存在擴(kuò)增抑制物質(zhì)。

1.5 定性PCR

篩查元件的定性PCR引物采用國家標(biāo)準(zhǔn)中的引物，包括農(nóng)業(yè)部1485號(hào)公告-11-2010《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因棉花定性 PCR方法》[16]、農(nóng)業(yè)部 1782號(hào)公告 -3-2012《調(diào)控元件CaMV 35S啟動(dòng)子、FMV 35S啟動(dòng)子、NOS啟動(dòng)子、NOS終止子和CaMV 35S終止子定性PCR方法》中CaMV 35S啟動(dòng)子和NOS終止子擴(kuò)增引物[17]，具體引物的序列和擴(kuò)增產(chǎn)物大小如表1所示。

定性PCR擴(kuò)增條件及擴(kuò)增程序依據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)[15-17]執(zhí)行。定性PCR擴(kuò)增使用MyCycler PCR儀（美國伯樂（Bio-red）)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物用 20 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳和EB染色。

表1 檢測中所用的引物擴(kuò)增片段長度及引用標(biāo)準(zhǔn)

1.6 轉(zhuǎn)基因棉花篩查檢測方法特異性分析

為了驗(yàn)證選擇的Bt基因、CaMV 35S啟動(dòng)子和NOS終止子篩選引物是否適合對(duì)棉花中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行篩查，利用表1中的引物對(duì)12個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花種子進(jìn)行了試驗(yàn)驗(yàn)證，分別是中植棉2號(hào)、中棉所41、中棉所45、中棉所79、魯棉研21號(hào)、魯棉研28號(hào)、魯棉研29號(hào)、魯棉研36號(hào)、魯6269、魯7619、K836和瑞棉1號(hào)。以新陸早36號(hào)作為非轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)照。

1.7 轉(zhuǎn)基因棉花篩查檢測方法靈敏度分析

用不同質(zhì)量比例的轉(zhuǎn)基因棉花中棉所41種子粉末和非轉(zhuǎn)基因棉花新陸早36號(hào)種子粉末混合，提取基因組DNA，對(duì)Bt基因、CaMV 35S啟動(dòng)子和NOS終止子的篩查方法進(jìn)行靈敏度測試。種子粉末混合比例分別是：中棉所41（轉(zhuǎn)基因成分含量1 000 g·kg－1）、10.0 g 的中棉所 41 和 90.0 g 的新陸早 36 號(hào)混合 （轉(zhuǎn)基因成分含量 100 g·kg－1）、1.0 g的中棉所41和99.0 g的新陸早36號(hào)混合（轉(zhuǎn)基因成分含量 10 g·kg－1）、0.50 g 的中棉所 41 和 99.50 g的新陸早36號(hào)混合（轉(zhuǎn)基因成分含量5 g·kg－1）、0.10 g的中棉所41和99.90 g的新陸早36號(hào)混合（轉(zhuǎn)基因成分含量 1 g·kg－1）、0.10 g 的中棉所 41 和999.90 g的新陸早36號(hào)混合 （轉(zhuǎn)基因成分含量0.1 g·kg－1）、新陸早 36 號(hào)（轉(zhuǎn)基因成分含量 0 g·kg－1）。

1.8 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉特征特性純度檢測分析

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉特征特性純度的測定采用Bt基因檢測方法。對(duì)市場上購買的某轉(zhuǎn)基因抗蟲棉商品種子，隨機(jī)抽取125粒種子，以每粒為1個(gè)樣品進(jìn)行核酸提取和Bt基因的檢測，以測定該轉(zhuǎn)基因抗蟲棉商品種子的抗蟲特征特性純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 商業(yè)化轉(zhuǎn)基因棉花外源插入元件分析

根據(jù)農(nóng)業(yè)部“轉(zhuǎn)基因權(quán)威關(guān)注”網(wǎng)站中“審批信息”內(nèi)容[13]，我國1996年至2016年批準(zhǔn)棉花《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書》共計(jì)2 514份。棉花的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書》有效期為5年，截至2017年10月仍有效的安全證書有863份，全部為抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花。其中，轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac棉花766份，占863份的88.8%；轉(zhuǎn)cry1Ac棉花71份，占 8.2%；轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac+CpTI棉花 26份，占 3.0%（圖1）。

圖1 2012－2016年轉(zhuǎn)基因抗蟲棉獲得生產(chǎn)應(yīng)用的安全證書

從圖1可看出，2011年到2016年批準(zhǔn)的棉花農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)應(yīng)用安全證書分別為40份、129份、236份、142份、165份和191份。批準(zhǔn)的所有轉(zhuǎn)基因棉花都是抗蟲棉，并且都有cry1Ab/cry1Ac融合基因或者cry1Ac抗蟲基因中的1個(gè)。

2.2 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉篩查策略分析

根據(jù)商業(yè)化轉(zhuǎn)基因棉花外源插入元件分析結(jié)果，我國批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因棉花都是轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，含有cry1Ab/cry1Ac融合基因或cry1Ac抗蟲基因中之一，因此對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花的篩查檢測，首先是針對(duì)cry1Ab/cry1Ac融合基因或cry1Ac基因或cry1Ab基因的檢測。農(nóng)業(yè)部1485號(hào)公告-11-2010標(biāo)準(zhǔn)中的Bt基因檢測方法，是根據(jù)cry1Ab/cry1Ac融合基因或cry1Ac基因或cry1Ab基因序列設(shè)計(jì)的特異性方法[16]，可檢出cry1Ab/cry1Ac融合基因或cry1Ac基因或cry1Ab基因序列。

完整的Bt基因表達(dá)盒才能實(shí)現(xiàn)Bt基因的表達(dá)和抗蟲特性的發(fā)揮，即需要啟動(dòng)子和終止子的協(xié)同作用。國產(chǎn)抗蟲棉主要采用CaMV 35S啟動(dòng)子和NOS終止子實(shí)現(xiàn)對(duì)Bt基因的調(diào)控[18-19]，本研究選用農(nóng)業(yè)部1782號(hào)公告-3-2012中的CaMV 35S啟動(dòng)子和NOS終止子檢測方法[17]，對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的調(diào)控元件進(jìn)行篩查檢測。

2.3 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉篩查檢測方法特異性

PCR檢測結(jié)果如圖2所示，在Bt基因 （圖2A）、CaMV 35S 啟動(dòng)子（圖2B）和 NOS 終止子（圖2C）方法的檢測結(jié)果中，所有的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉都可檢出，非轉(zhuǎn)基因棉花為未檢出。這些結(jié)果與預(yù)期相符，說明本研究中選用的Bt基因、CaMV 35S啟動(dòng)子和NOS終止子的篩查檢測方法，能夠有效地對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉進(jìn)行篩查檢測。

圖2 對(duì)棉花基因組DNA中Bt基因、CaMV 35S啟動(dòng)子和NOS終止子的PCR檢測

2.4 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉篩查檢測方法靈敏度

PCR檢測結(jié)果如圖3所示，在Bt基因 （圖3A）、CaMV 35S 啟動(dòng)子（圖3B）和 NOS 終止子（圖3C）方法的檢測結(jié)果中，轉(zhuǎn)基因成分含量1 g·kg－1的混合樣品可以檢測到，轉(zhuǎn)基因成分含量0.1 g·kg－1的混合樣品未擴(kuò)增出條帶，說明本研究選用的引物序列的靈敏度可達(dá)到1 g·kg－1。

圖3 對(duì)棉花基因組DNA中Bt基因、CaMV 35S啟動(dòng)子和NOS終止子的PCR檢測靈敏度

2.5 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉特征特性純度檢測

根據(jù)孫國清等[20]的研究，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種抗性純度會(huì)影響產(chǎn)量。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種抗性純度至少要達(dá)到97%，才可以保證產(chǎn)量不至于損失太大[20]。國家標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)制性要求棉花大田用種的純度不能低于95%。綜合考慮，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種抗性純度至少要達(dá)到97%，才能保證棉花種植農(nóng)田不受損失。

對(duì)市場上購買的某轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種子的125個(gè)單粒PCR檢測結(jié)果顯示，有122個(gè)呈陽性，有3個(gè)單粒（序號(hào)分別是41、67和120）為陰性（圖4），計(jì)算出轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種子的純度為97.6%。說明該抗蟲棉種子的抗蟲抗性純度符合要求，能夠在大田中有效防止棉鈴蟲的侵害。

圖4 采用Bt基因法檢測轉(zhuǎn)基因抗蟲棉特征特性純度結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本研究通過對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書批準(zhǔn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)了商業(yè)化轉(zhuǎn)基因棉花外源插入元件的情況，提出了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉篩查策略和檢測方法，使用Bt基因、CaMV 35S啟動(dòng)子和NOS終止子檢測方法對(duì)12個(gè)常見轉(zhuǎn)基因棉花品種進(jìn)行篩查檢測的試驗(yàn)驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果證明，該檢測方法對(duì)商業(yè)化應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因棉花品種可進(jìn)行特異性的快速篩查檢測，檢測靈敏度可達(dá)到1 g·kg－1，這與吳明生等[21]、Wu 等[22]報(bào)道的檢測靈敏度相近，為棉花中轉(zhuǎn)基因成分的快速準(zhǔn)確檢測提供了技術(shù)依據(jù)。

Bt基因篩查方法可對(duì)棉花的轉(zhuǎn)基因特征特性純度進(jìn)行快速分析。該方法具有以下優(yōu)勢：相對(duì)于常規(guī)的種子純度檢測方法，節(jié)約了時(shí)間成本；可實(shí)現(xiàn)種植前種子純度檢測和控制，最大限度減少純度不合格種子對(duì)大田生產(chǎn)的負(fù)面影響。

該技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的監(jiān)管，對(duì)于防止轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的非法擴(kuò)散和保障棉田的安全生產(chǎn)具有重要意義。

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Screening Strategy for Detection of Genetically Modified Organism in Cotton Seed

Zhang Haibo1,2,Zhang Ying1,2*

在棉花種子的監(jiān)管中，大量的樣品需要進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測，建立快速、準(zhǔn)確、低成本的轉(zhuǎn)基因成分篩查方法十分必要。通過分析我國棉花種子市場和轉(zhuǎn)基因棉花安全生產(chǎn)證書發(fā)放情況，建立了棉花種子中轉(zhuǎn)基因成分快速篩查策略，并對(duì)市場上銷售的棉花品種種子轉(zhuǎn)基因特征特性純度進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，聯(lián)合使用CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子和Bt基因等3個(gè)元件的檢測，可完成對(duì)棉花種子中轉(zhuǎn)基因成分的快速篩查，檢測靈敏度為1 g·kg－1；單用Bt基因可對(duì)抗蟲棉種子的轉(zhuǎn)基因特征特性純度進(jìn)行快速檢測。本研究建立的篩查方法，可對(duì)棉花種子中轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行快速、高靈敏度的篩查。

轉(zhuǎn)基因棉花；轉(zhuǎn)基因檢測；篩查策略；抗性純度；Bt基因

S562.03

A

1000-632X(2017)12-0011-05

10.11963/1000-632X.zhbzy.20171124

2017-10-11 *通信作者：zhying6@gmail.com

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃——“七大農(nóng)作物育種”專項(xiàng)（2017YFD0102006）