李存玉, 彭國平, 鄭云楓, 潘林梅

(南京中醫(yī)藥大學 藥學院, 江蘇 南京 210023)

注射劑中熱原在線檢測儀及應用

李存玉, 彭國平, 鄭云楓, 潘林梅

(南京中醫(yī)藥大學 藥學院, 江蘇 南京 210023)

針對實驗教學中熱原檢測周期長、不便于開展實體教學的問題,為了啟發(fā)大學生創(chuàng)新實踐能力,以學生為主體的研發(fā)小組研制一種可實現(xiàn)熱原在線監(jiān)控的裝置。該裝置基于熱原的光散射特征,在注射劑生產(chǎn)過程中通過密閉管路與生產(chǎn)線對接,杜絕了檢測環(huán)境中微粒懸浮物對檢測過程的污染,實現(xiàn)了熱原快速、在線、無污染檢測。該裝置的研發(fā)充分發(fā)揮了學生的潛力與創(chuàng)造性,實現(xiàn)課堂教學效果與實踐能力的雙提升。

熱原； 在線檢測； 實驗教學； 創(chuàng)新能力

中藥制藥行業(yè)中對于藥品的安全性控制尤為重視,特別是注射劑。因采用靜脈注射進入血液,因而對引起不良反應的有害物質(zhì)的多采用限量控制。熱原的檢測控制方法分為家兔法和動態(tài)濁度法,家兔法是根據(jù)動物體溫波動評價制劑安全性,動態(tài)濁度法是根據(jù)熱原中的主要成分細菌內(nèi)毒素與鱟試劑反應產(chǎn)生的量化關系進行限量評價。兩種方法在具體的實驗教學過程中均具有一定的局限性,家兔法實驗周期較長且對動物穩(wěn)定性要求高[1],學生難以獲得有效數(shù)據(jù);動態(tài)濁度法實驗操作周期長，試劑成本偏高,且對操作要求較高[2]。目前在中藥制藥專業(yè)綜合實驗中通過虛擬仿真系統(tǒng)開展教學,但是對于學生的技能操作培養(yǎng)有所欠缺。

注射劑安全性控制中熱原的限度要求與其臨床安全性直接相關,而且制劑生產(chǎn)過程中熱原污染也存在突發(fā)性、偶然性[3],因此如何實現(xiàn)生產(chǎn)過程在線控制是提升注射劑安全性的關鍵。為了提升教學效果、鍛煉中藥制藥專業(yè)學生的自主創(chuàng)新能力,通過學生自愿申報進入中藥制藥實驗室課題組,由指導教師引導、學院實驗中心提供科研平臺,開展注射劑中熱原在線監(jiān)控裝置研發(fā)。

1 熱原

熱原(pyrogen)又稱細菌內(nèi)毒素(bacterial endotoxin),是革蘭氏陰性菌細胞外壁的脂多糖[4-5],結(jié)構(gòu)為一端是疏水的酯鏈,另一端是親水的糖鏈。類似表面活性劑的結(jié)構(gòu)特點使細菌內(nèi)毒素在水溶液中多以團聚態(tài)膠體的形式存在[6],在水溶液中呈現(xiàn)出納米膠粒子的光散射特征,可通過納米粒子檢測裝置直接檢測。同時,中藥制劑中成分普遍偏低,其粒徑分布與細菌內(nèi)毒素有明顯差異,通過優(yōu)選檢測參數(shù)進行區(qū)分,從而實現(xiàn)細菌內(nèi)毒素快速、在線、無污染檢測,基于此常規(guī)的激光粒徑檢測設備開展教學用熱原在線檢測裝置研制。

2 檢測原理

傳統(tǒng)的衍射和散射原理的激光粒度儀測試亞微米級范圍的顆粒,由于其散射光信號的空間分布趨于一致,其分辨率很低,如果采用偏振光、雙光源、雙鏡頭等信號的信噪比也偏低,達不到測試納米的分辨率和精度。激光照射到顆粒產(chǎn)生的散射光的強度因顆粒的布朗運動而發(fā)生變化。這種光強與顆粒的粒徑相關。通過探測器(常用光電倍增管)在特定光學結(jié)構(gòu)下,將這一起伏漲落的光強轉(zhuǎn)化為電信號,經(jīng)自相關運算得到相關曲線,再由專用軟件分析出平移擴散系數(shù),最后經(jīng)Stoken-Einstein公式,計算出粒度分布[7-9]。

3 激光粒徑檢測儀改造

3.1 熱原在線檢測構(gòu)造

熱原在線檢測儀的內(nèi)部結(jié)構(gòu)見圖1，主要由光學系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和預警系統(tǒng)組成。光學系統(tǒng)包括平行雙激光源、短焦透鏡、光柵、長焦透鏡、光柵濾波器和多點散射光接收器；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)包括光電轉(zhuǎn)換器、信號放大器、信號處理器、數(shù)據(jù)采集器、粒子辨識及定量運算器和數(shù)據(jù)顯示器；在線及預警系統(tǒng)包括在線流動檢測池、超聲探頭和報警器。

圖1 熱原在線檢測儀內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖

3.2 技術性能

結(jié)合中藥制藥專業(yè)綜合實驗的主體內(nèi)容[10],以丹參注射液生產(chǎn)線檢測為例,進行以內(nèi)毒素在線監(jiān)測為目標的新型內(nèi)毒素檢測儀器的樣機開發(fā),對其性能進行全面考察,檢驗儀器性能與在線監(jiān)控的可行性,并設定一系列指標,以反映儀器應用性能,保證儀器檢測結(jié)果的可靠性。

3.2.1 技術性能

檢測不消耗試劑,對藥液無任何污染,可以對制劑中的內(nèi)毒素濃度實現(xiàn)半定量檢測,并與中藥成分進行有效區(qū)分,以及檢測微生物的污染；在3 min內(nèi)可以完成樣品取樣、檢測、結(jié)果輸出;儀器可實現(xiàn)連續(xù)檢測,并通過預警曲線反映制劑中細菌內(nèi)毒素的水平,其檢測最低限度達到0.50 EU/mL,以確保制劑內(nèi)毒素含量在安全范圍之內(nèi)。

3.2.2 技術參數(shù)

適用范圍:注射用水或注射劑生產(chǎn)的在線監(jiān)控,離線快速檢測,注射劑生產(chǎn)設備的潔凈度監(jiān)控、超濾膜完整性檢測等。技術參數(shù)見表1。

表1 技術參數(shù)

3.3 研制方法

3.3.1 在線檢測技術改進

檢測池的優(yōu)化：實現(xiàn)生產(chǎn)線的同步連接、監(jiān)控,增加了超聲混勻裝置,使檢測溶液均勻混合,檢測結(jié)果更準確,富有代表性。根據(jù)注射劑品種設置采樣點間隔,關閉進液口和出液口,使待檢測溶液呈現(xiàn)靜止狀態(tài),對注射劑內(nèi)毒素污染狀況進行監(jiān)控。通過在線檢測池與生產(chǎn)線的對接,實現(xiàn)對注射劑生產(chǎn)線的在線檢測(見圖2)。

圖2 在線檢測示意圖

3.3.2 檢測專屬性

光源采用波長632.8 nm的He-Ne激光器,只選擇顆粒真正產(chǎn)生的單散射信號部分,去除干擾信號,激光源在降低對樣品熱效應的同時,加大功率,并針對樣品,選擇合適的發(fā)射功率,自動調(diào)節(jié)激光衰減；散射光接收器為光電二極管(APD)檢測器,多角度多點接收,暗基數(shù)小,靈敏度高,速度快,性能穩(wěn)定,通過光電二極管將散射光信號接收并轉(zhuǎn)換成電信號,并配有相應的電信號放大器。數(shù)據(jù)處理器是將光強轉(zhuǎn)化為電信號,經(jīng)運算得到相關曲線,再由數(shù)據(jù)分析軟件計算出平移擴散系數(shù),最后經(jīng)Stokes-Einstein公式,計算出粒徑分布。

4 測定結(jié)果及可行性分析

4.1 檢測結(jié)果

對所研制的熱原在線檢測儀進行細菌內(nèi)毒素的檢測限實驗,采用注射用水清洗檢測器的循環(huán)檢測管路以及檢測池,進而采用臨床常用注射液——丹參滴注液為例進行設備的功能性驗證。以丹參滴注液為空白,并分別加入細菌內(nèi)毒素工作標準品,配制成濃度為0.25、0.50、5.00、25.00 EU/mL的細菌內(nèi)毒素溶液進行檢測,測定結(jié)果見圖3—圖7。

由于細菌內(nèi)毒素在溶液中是以團聚狀態(tài)存在,其粒徑大于丹參成分的粒徑分布,而儀器的檢測原理是以溶液中顆粒的體積進行數(shù)據(jù)模型轉(zhuǎn)換成粒徑,所以細菌內(nèi)毒素的粒徑分布強度將丹參滴注液中成分的粒徑分布峰掩蓋[11]。

丹參滴注液中加入細菌內(nèi)毒素后,粒徑分布峰有明顯變化,當內(nèi)毒素濃度降低時,內(nèi)毒素是以低分子量團聚態(tài)存在,隨著濃度升高,逐步呈現(xiàn)出高分子團聚態(tài),濃度與粒徑分布呈現(xiàn)出一定的相關性,也為熱原的在線檢測提供了可行性。圖5中粒徑分布細菌內(nèi)毒素檢測限已達到0.50 EU/mL,可以滿足丹參滴注液中細菌內(nèi)毒素的限度檢測要求。

圖3 丹參滴注液粒度分布

圖4 0.25 EU/ml細菌內(nèi)毒素污染粒度分布

圖5 0.50 EU/ml細菌內(nèi)毒素污染粒度分布

圖6 5.00 EU/ml細菌內(nèi)毒素粒徑污染粒度分布

圖7 25.00 EU/ml細菌內(nèi)毒素污染粒度分布

4.2 檢測結(jié)果的重現(xiàn)性

以丹參滴注液為例,依據(jù)圖2的在線檢測裝置連接內(nèi)毒素檢測系統(tǒng)與藥液管路,對細菌內(nèi)毒素污染后的丹參滴注液進行檢測,測試不同污染條件下滴注液中細菌內(nèi)毒素污染特征峰分布,多次進行重復試驗,測定結(jié)果見表2。在不同內(nèi)毒素污染環(huán)境下的丹參滴注液粒徑分布的D50(累計粒度分布百分數(shù)達到50%時所對應的粒徑)的RSD均低于4%,結(jié)果較穩(wěn)定,數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好。

表2 不同內(nèi)毒素污染的丹參滴注液粒徑分布

4.3 誤差分析

研發(fā)的熱原在線檢測儀旨在拓展中藥制藥專業(yè)對注射劑生產(chǎn)過程的控制,開發(fā)學生的創(chuàng)新實踐能力。初步構(gòu)建的在線檢測系統(tǒng)不可避免地存在檢測誤差,可能導致誤差的原因有:檢測環(huán)境的潔凈度對檢測結(jié)果的影響,空氣中懸浮微粒的介入導致粒徑出現(xiàn)突發(fā)性的增長；注射劑中成分的干擾,目前發(fā)現(xiàn)皂苷類成分與內(nèi)毒素的粒徑特征存在相似性,分析原因是其在溶液中因表面活性以膠束狀態(tài)存在,從而引起檢測誤差的出現(xiàn)。

5 熱原在線檢測儀器的創(chuàng)新性

(1) 新穎的檢測原理。利用激光散射檢出細菌內(nèi)毒素膠體特征而研制的內(nèi)毒素新型檢測儀,具有能快速檢測及在線檢測的優(yōu)勢,彌補了現(xiàn)有熱原檢測技術的缺陷,可通過進一步設備優(yōu)化實現(xiàn)注射液生產(chǎn)過程中的內(nèi)毒素在線檢測,有效控制微生物在生產(chǎn)線中的污染問題,提升注射劑安全性。

(2) 檢測過程無污染。不需要添加檢測探針,針對細菌內(nèi)毒素不同濃度的粒徑分布區(qū)別可以實現(xiàn)半定量檢測,避免了檢測試劑的消耗。同時,在生產(chǎn)過程中通過密閉管路與生產(chǎn)線對接,杜絕了檢測環(huán)境中微粒懸浮物對檢測過程的污染。

(3) 數(shù)據(jù)在線分析。因檢測原理不同,避免了傳統(tǒng)檢測方法需離線分析的問題,通過與在線生產(chǎn)管路直接對接,實時分析注射劑中細菌內(nèi)毒素的污染情況,符合“藥品質(zhì)量是生產(chǎn)出來的而不是檢驗出來的”藥品生產(chǎn)管理要求與理念,解決注射生產(chǎn)過程因微生物污染而帶來的不明不良反應等安全性問題。

6 創(chuàng)新實踐能力鍛煉

熱原在線檢測儀的研發(fā)是起始于滿足專業(yè)實驗的檢測需求。該熱原在線檢測儀的研制成功,豐富了小組成員在物理化學專業(yè)知識，鍛煉了制藥領域創(chuàng)新能力,所研發(fā)的熱原在線檢測儀器通過委托加工的方式,進行了設備組裝,并申請了專利保護。以此為切入點，參加了挑戰(zhàn)杯全國大學生課外學術作品競賽并獲得特等獎,目前研發(fā)的熱原在線檢測設備已在中藥制藥專業(yè)綜合實驗得到應用,學生根據(jù)專業(yè)特長及其個人愛好,對設備的硬件及其檢測軟件進行了優(yōu)化。該研制以制藥過程中存在的問題為導向,發(fā)揮專業(yè)特色、解決實際問題為出發(fā)點的大學生實踐創(chuàng)新能力鍛煉,不僅為現(xiàn)代大學生的培養(yǎng)提供了基礎,也為科學合理的教學改革指引了方向[12-13]。

7 結(jié)語

教學用熱原在線檢測儀的研發(fā)是以解決實際生產(chǎn)中存在的技術難題為出發(fā)點,結(jié)果快速、穩(wěn)定,不僅提高了檢測效率,而且有效提升了注射劑生產(chǎn)技術水平,保障了制劑安全性。利用該裝置多次開展注射用水、丹參滴注液中內(nèi)毒素污染水平在線監(jiān)控,測定結(jié)果表明,誤差小于5%,結(jié)果重現(xiàn)性好。此外,通過采用經(jīng)典的鱟試劑動態(tài)濁度法驗證了結(jié)果準確可靠。目前雖然中藥注射劑中皂苷類成分對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響,后續(xù)仍對針對內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)與光散射特征的相關性展開研究,以期提升設備檢測的專屬性。

該設備滿足了中藥制藥專業(yè)實驗教學需求,實現(xiàn)了“從學生中來、到學生中去”的啟發(fā)式實驗教學設備研發(fā)思路。在教學過程中,本專業(yè)前輩學長的科研精神激勵學生自發(fā)地開展實驗教學改革創(chuàng)新,實驗教學中心提供科研平臺,從而有效促進了學生自主研發(fā)能力,鍛煉了學生的綜合素質(zhì)。

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On-line detector for pyrogen in injection and its application

Li Cunyu, Peng Guoping, Zheng Yunfeng, Pan Linmei

(College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

In view of the problems that the detection cycle of pyrogen is long and it is difficult to carry out solid experimental teaching, and in order to enlighten the college students’ innovative awareness, a device which can realize the on-line monitoring of pyrogen is developed by the student R&D group. The device is based on the light scattering characteristics of pyrogen, and in the process of injection production, the pollution by the suspended particulate matter in the detection environment is eliminated through the connection between the sealed pipeline and the production line, and the rapid, on-line and non-pollution detection of pyrogen is realized. The R&D of the device can give full play to the students’ potential and creativity, and realize the double promotion of classroom teaching effect and practical ability.

pyrogen; on-line detection; experimental teaching; innovative ability

10.16791/j.cnki.sjg.2017.12.024

2017-06-01

國家自然科學基金項目(81503258)；江蘇省高等教育教改研究立項課題基金項目(2013JSJG036)；南京中醫(yī)藥大學教師教學發(fā)展課題基金項目(NZYJSFZ2016-05)

李存玉(1985—),男,江蘇徐州,博士,講師,研究方向為中藥制藥工藝研究

E-mail：licunyuok@163.com

彭國平(1963—),男,江蘇金壇,博士,教授,博士生導師,研究方向為中藥注射劑安全性評價等.

E-mail：guopingpeng@126.com

R917

A

1002-4956(2017)12-0097-05