張 杰, 張曉鵬, 李鵬高 , 趙志強

(1. 首都醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院臨床流行病學(xué)北京市重點實驗室, 北京 100069；2. 首都醫(yī)科大學(xué) 信息中心, 北京 100069)

小鼠糞便細菌基因組DNA提取方法比較

張 杰1, 張曉鵬1, 李鵬高1, 趙志強2

(1. 首都醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院臨床流行病學(xué)北京市重點實驗室, 北京 100069；2. 首都醫(yī)科大學(xué) 信息中心, 北京 100069)

分別將研磨、水煮兩種預(yù)處理方法和改良CTAB法、試劑盒法兩種提取方法進行組合,比較提取小鼠糞便細菌基因組DNA的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),研磨預(yù)處理過的樣品提取到的細菌基因組DNA的濃度和純度均高于水煮預(yù)處理過的樣品,研磨結(jié)合改良CTAB法提取到的DNA完整性好于其他方法,研磨結(jié)合改良CTAB法是一種提取糞便細菌基因組DNA較為實用可靠的方法。

糞便； 細菌基因組DNA； 提取方法

腸道是哺乳動物體內(nèi)最大的消化器官,其中含有數(shù)量巨大的細菌菌群,形成了極其復(fù)雜的細菌微生態(tài)系統(tǒng),腸道微生態(tài)系統(tǒng)中的菌群結(jié)構(gòu)、數(shù)量和種類的變化與機體的健康和疾病有著密切的關(guān)系[1-2]。

糞便的主要成分是微生物的菌體和食物殘渣,其中包含著重要的腸道微生物信息,可以間接地反映腸道微生物的變化情況。近年來隨著分子生物學(xué)研究和技術(shù)的發(fā)展,利用分子生物學(xué)技術(shù)和方法從糞便中提取腸道微生物總DNA，并對相關(guān)疾病進行研究取得了許多突破[3-4]。但是糞便中含有的成分非常復(fù)雜,其中含有的色素、多糖和纖維素等物質(zhì)對TaqDNA聚合酶有抑制的作用；脂類、酸類、多酚等有機物在DNA提取過程中很難去除,這些雜質(zhì)不但易導(dǎo)致目標DNA的降解 ,還直接影響到后續(xù)研究的準確性。因此,以糞便為標本提取細菌基因組DNA進行腸道微生態(tài)研究的關(guān)鍵是能否提取到高質(zhì)量的糞便細菌基因組DNA[5]。

本研究是在已有報道的基礎(chǔ)上比較幾種小鼠糞便細菌基因組DNA提取方法,旨在保證提取效率的同時得到高質(zhì)量的細菌基因組DNA,為腸道微生態(tài)系的研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 實驗材料及儀器

樣品的采集與儲存:BALB/C清潔級小鼠由首都醫(yī)科大學(xué)動物中心提供,3周齡,體重18～22 g,直接從小鼠肛門處收集糞便于1.5 mL的無菌管中,放入-80 ℃保存,備用。

試劑:三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE,國產(chǎn))；十二烷基磺酸鈉(SDS,國產(chǎn))；核糖核酸酶A(RNase A,Promega公司)；蛋白酶 K(Promega公司)；氯化鈉(NaCL,國產(chǎn))；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB,國產(chǎn))；氯仿(國產(chǎn)分析純)；異丙醇(國產(chǎn)分析純)；Tris酚(國產(chǎn))；異戊醇(國產(chǎn)分析純)；無水乙醇(國產(chǎn)分析純)；λDNA/HindⅢ DNA Marker(TIANGEN公司)；100bp DNA ladder Marker(TIANGEN公司)；Gel-Red 核酸染料(Sigma公司)；瓊脂糖(Sigma公司)；熒光定量PCR試劑盒(ABI公司)；引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)；糞便細菌基因組 DNA 提取試劑盒(離心柱型TIANamp Stool DNA Kit,TIANGEN公司)。

儀器:Q5 Real-time PCR擴增儀(ABI公司)；電泳儀(Bio-Rad公司)；高速冷凍離心機(Eppendorf公司)；NanoDrop 2000紫外分光光度儀(Thermo公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(VILBER LOURMA公司)；漩渦混合器(國產(chǎn))；電熱恒溫水浴鍋(國產(chǎn))。

2 實驗方法

2.1 糞便預(yù)處理方法

方法1——研磨:稱取0.1 g小鼠糞便放入滅菌研缽中,在冰上徹底研碎,然后加入1 mL無菌雙蒸水徹底重懸,10 000 r/min、離心10 min ,取上清待用。

方法2——水煮:在0.1 g小鼠糞便中加入1 mL無菌雙蒸水于1.5 mL的EP管中,浸泡10 min后充分振蕩搖勻15 s；將管放置100 ℃水浴10 min；冷卻后10 000 r/min、離心10 min ,取上清待用。

2.2 小鼠糞便細菌基因組DNA提取方法

(1) 改良CTAB方法：參照文獻[6](有改動)，分別在預(yù)處理過的500 μL樣品中加入30 μL、10%SDS,3 μL蛋白酶K(20 g/L),4 μL RNaseA后混勻,37 ℃水浴1 h；每管中加入100 μL NaCL(5 mol/L),顛倒混勻后加入80 μL的CTAB/NaCL(10% CTAB,0.7 mol/L NaCL),輕輕混勻；放入65 ℃水浴10 min；加入等體積酚/氯仿/異戊醇(比例為25∶24∶1)混合液,混勻后12 000 r/min、離心10 min,取上清；上清液中加入0.6倍體積的異丙醇,輕輕混勻,12 000 r/min、離心10 min,棄上清；沉淀用1 mL預(yù)冷的75%乙醇洗滌后,7 500 r/min離心5 min,棄乙醇,在潔凈工作臺中稍加干燥,溶于30 μL TE緩沖液中。

(2) 試劑盒方法：將預(yù)處理好的樣品,分別按照糞便細菌基因組 DNA 提取試劑盒(離心柱型)說明書的步驟進行提取。

2.3 小鼠糞便細菌基因組DNA質(zhì)量分析

2.3.1 細菌基因組DNA純度和濃度測定

分別取2 μL提取到的細菌基因組DNA,在NanoDrop 2000紫外分光光度儀上檢測DNA的質(zhì)量濃度及DNA的A260/A280比值。

2.3.2 細菌基因組DNA完整性測定

分別取5 μL提取到的DNA于含Gel-Red核酸染料的0.8%瓊脂糖凝膠中電泳,工作電壓120 V,50 min后置于凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察、分析結(jié)果。

2.3.3 熒光定量PCR反應(yīng)

使用細菌16S rDNA基因V3區(qū)特異性引物338-F:5’-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’,548-R:5’-AATACGGAGGGTGCAAGCGT-3’,以提取到的小鼠糞便細菌基因組DNA為模板,進行細菌16S rDNA基因熒光定量PCR擴增,每個樣本設(shè)置3次重復(fù),同時設(shè)置不添加模板的陰性對照組。

根據(jù)Power SYBR Green master mix說明書配置熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL。反應(yīng)條件:95 ℃、10 min ，95 ℃、15 s，58 ℃、30 s 、72 ℃，30 s,40個循環(huán)；反應(yīng)完成后利用熔解曲線分析產(chǎn)物的特異性,觀察其擴增曲線以及記錄Ct值(反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))；擴增產(chǎn)物在含Gel-Red核酸染料的1%瓊脂糖凝膠中電泳(電壓100 V,50 min),結(jié)果于凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察、分析。

2.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件,對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 不同方法提取到的小鼠糞便細菌基因組DNA質(zhì)量濃度和純度

結(jié)果見表1。由表1可知：采用相同預(yù)處理方法的樣本,改良CTAB法提取到的DNA質(zhì)量濃度c(DNA)明顯高于試劑盒法提取到的；對于采用相同的提取方法、不同預(yù)處理方法的樣本提取到的DNA質(zhì)量濃度不同,與水煮法相比,研磨法能顯著提高小鼠糞便細菌基因組的c(DNA)；不同方法提取到的細菌基因組DNA質(zhì)量濃度之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 不同方法提取到的小鼠糞便細菌基因組DNA的純度和質(zhì)量濃度

注: a:與研磨+改良CTAB法相比P<0.01；b:與水煮+改良CTAB法相比P<0.01。

A260/A280比值是判斷核酸純度的常用指示值,A260代表核酸的吸光度值,A280代表蛋白質(zhì)的吸光度值。A260/A280的比值在1.6～1.8之間表示DNA的純度較好,A260/A280<1.6說明樣品中有蛋白質(zhì)污染,A260/A280>1.8說明樣品中有RNA污染。理論上純化的DNA的A260/A280比值在1.8左右。測定結(jié)果表明：相同提取方法,經(jīng)過研磨預(yù)處理后提取到的細菌基因組的DNA純度好于水煮預(yù)處理的樣本；采用相同預(yù)處理方法,試劑盒法提到的細菌基因組DNA純度高于改良CTAB法提取到的,但是兩者之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P≥0.05)。

3.2 細菌基因組DNA完整性測定

通過瓊脂糖凝膠電泳圖(見圖1)可見:不同方法提取到的DNA均在23 kb左右處有清晰條帶；相同預(yù)處理方法的樣品,改良CTAB法提取到的小鼠糞便細菌基因組DNA條帶較亮；采用相同DNA提取方法,水煮法預(yù)處理過的樣本提取到的細菌基因組DNA有明顯的拖帶,說明提取到的DNA發(fā)生了降解,DNA分子的完整性變差。

圖1 不同方法提取到的小鼠糞便細菌基因組DNA

3.3 熒光定量PCR檢測細菌基因組DNA擴增效果及擴增產(chǎn)物的有效性分析

利用不同方法提取到的糞便細菌基因組DNA為模板,采用相同DNA模板量對細菌16S rDNA基因進行熒光定量PCR擴增。PCR擴增的溶解曲線上顯示每個樣品擴增的16S rDNA基因均為單一峰,特異性較好(見圖2)。圖3的PCR擴增曲線顯示:以研磨結(jié)合改良CTAB法提取到的DNA為模板擴增細菌16S rDNA基因得到的Ct值最低,與水煮結(jié)合改良CTAB法提取到的DNA擴增得到的Ct值相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),具體結(jié)果見表2。

圖2 不同方法提取到的小鼠糞便細菌基因DNA熒光定量PCR溶解曲線

圖3 不同方法提取到的小鼠糞便細菌基因組DNA熒光定量PCR擴增曲線

預(yù)處理方法提取方法樣本數(shù) Ct值研磨水煮改良CTAB法523．9427±0．2791525．0210±0．1327A研磨水煮試劑盒法524．4320±0．2291524．6947±0．9099

注:A:與研磨+改良CTAB法相比P<0.05

對熒光定量 PCR的擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測表明:擴增產(chǎn)物均可以在200 bp左右看到細菌16S rDNA基因的特異性擴增片段,且無干擾性雜帶,重復(fù)性好(見圖4)；研磨結(jié)合CTAB法獲得的DNA擴增產(chǎn)物條帶最亮；經(jīng)過水煮法預(yù)處理的樣品,不同提取方法提取到的DNA擴增后的產(chǎn)物條帶均較暗,說明經(jīng)過水煮預(yù)處理的樣品提取到的細菌基因組DNA濃度較低,質(zhì)量較差。

圖4 小鼠糞便細菌16S rDNA基因熒光定量PCR擴增產(chǎn)物

4 討論

從糞便中有效地提取到高質(zhì)量的細菌基因組DNA是研究腸道微生態(tài)的基礎(chǔ)和前提。目前,從糞便標本中提取細菌DNA的方法眾多,由于提取機理和步驟的差別,獲得 DNA 的濃度和純度各不相同,導(dǎo)致在后續(xù)實驗,如PCR擴增、DNA 測序等的應(yīng)用效果不同[5-7]。理想的基因組DAN提取方法既要好的DNA的獲得率,又要盡可能地減少DNA的降解[8]。高效穩(wěn)定的細菌基因組DNA提取方法對后續(xù)分子生物學(xué)的研究有著重要的意義[9]。

本實驗的實驗結(jié)果顯示:經(jīng)過不同預(yù)處理的樣本,采用相同的細菌基因組DNA提取方法提取到的DNA質(zhì)量濃度不同,研磨預(yù)處理后提取到的細菌基因組DNA質(zhì)量濃度明顯高于經(jīng)水煮后提取到的DNA質(zhì)量濃度。有文獻報道機械破壁對厚壁菌門的破壁效果要優(yōu)于傳統(tǒng)的酶解作用[10],研磨可以較為徹底地破壞細菌細胞壁,使細胞充分裂解,使更多的DNA游離出來。

水煮法是利用物理方法處理蛋白質(zhì),使其與核酸分離,但是在加熱過程中菌體破裂的比例較小,而且煮沸過程中部分DNA發(fā)生降解[11-12],所以提取到的DNA質(zhì)量濃度較低。因此研磨法與水煮法相比，研磨法是一種更為有效的提高糞便細菌基因組DNA濃度的方法。

此外細菌16SrDNA 基因熒光定量PCR擴增結(jié)果顯示,經(jīng)過水煮法預(yù)處理過的樣品,提取到的DNA完整性較研磨預(yù)處理后提取到的DNA差。已有的研究法發(fā)現(xiàn)[13],采用水煮法雖然促使了細胞膜破裂,釋放出DNA，同時高溫使部分DNA斷裂成小片段。由水煮法處理過的DNA樣品不適用于限制性內(nèi)切酶切分析的實驗,只適用于對DNA要求不高的PCR和RAPD等實驗。由此可知小鼠糞便細菌基因組DNA提取時研磨預(yù)處理方法優(yōu)于水煮預(yù)處理方法。

把經(jīng)過相同預(yù)處理的樣本,采用不同提取方法提取到的細菌基因組DNA進行綜合比較發(fā)現(xiàn):改良CTAB方法提取到的DNA質(zhì)量濃度明顯高于試劑盒法提取到的DNA質(zhì)量濃度；改良CTAB方法的DNA純度低于試劑盒法提取到的DNA純度。試劑盒的方法操作簡單、用時短,提取到的DNA質(zhì)量穩(wěn)定,但是熒光定量PCR的擴增效果比改良CTAB法的差,而且試劑盒價格較貴,使用次數(shù)有限,試劑盒的質(zhì)量因不同廠家和批次也會有所差異,不適合大量樣本的糞便細菌基因組DNA的提取。

改良的CTAB方法提取到的細菌基因組DNA條帶完整、較亮,沒有明顯的降解和蛋白質(zhì)污染；以此為模板進行細菌16SrDNA 基因熒光定量PCR擴增,擴增產(chǎn)物條帶清晰,說明改良的CTAB方法提取到的小鼠糞便細菌基因組DNA能夠滿足下游分子生物學(xué)研究的需要。而且改良CTAB方法在原有的方法上,簡化了操作步驟,減少了有機試劑的使用,縮短了實驗時間,實驗時不需要特殊的儀器設(shè)備,成本較低,適用于大樣本量的糞便細菌基因組DNA的提取。

綜上所述,研磨預(yù)處理方法結(jié)合改良CTAB法是一種提取糞便細菌基因組DNA較為實用可靠的方法,可以為腸道微生態(tài)的大樣本量研究提供幫助。

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Comparison of methods for extracting bacterial genomic DNA from mouse feces

Zhang Jie1, Zhang Xiaopeng1, Li Penggao1, Zhao Zhiqiang2

(1.Beijing Municipal Key Laboratory of Clinical Epidemiology, School of Public Health , Capital Medical University， Beijing 100069, China; 2. Center of Network Information, Capital Medical University，Beijing 100069，China)

Two pretreatment methods of grinding and boiling and two extraction methods such as the improved CTAB method and the kit method are combined respectively to compare the effect of extracting bacterial genomic DNA from the mouse feces. The results show that the concentration and purity of the genomic DNA extracted from the milled pretreated samples are higher than those obtained by the boiling pretreated samples, the integrity of the DNA extracted by the grinding combined with the modified CTAB method is better than that by other methods, and the grinding combined with the modified CTAB method is a practical and reliable method for extracting the genomic DNA from the fecal bacteria.

feces; bacterial genomic DNA; extraction method

10.16791/j.cnki.sjg.2017.12.012

2017-09-06

國家自然科學(xué)基金項目(81573128)資助

張杰(1968—),女,北京, 學(xué)士, 副主任技師, 主要研究方向為分子流行病學(xué)

E-mail：zhangjie@ccmu.edu.cn

趙志強(1979—),男,北京,博士,研究員,研究方向為生物醫(yī)學(xué)工程.

E-mail：zzqmr@ccmu.edu.cn

Q933

B

1002-4956(2017)12-0050-04