郝翠，穆巖，趙恒強(qiáng)，崔莉，劉偉，劉逢芹

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2. 山東省分析測試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250014；3. 山東省千佛山醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014)

正交試驗(yàn)法優(yōu)選黃芩配方顆粒的水提工藝

郝翠1,2，穆巖2，趙恒強(qiáng)2，崔莉2，劉偉2，劉逢芹3*

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2. 山東省分析測試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250014；3. 山東省千佛山醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014)

為優(yōu)選黃芩配方顆粒制備過程中的水提取工藝，采用正交試驗(yàn)法考察了加水量、提取次數(shù)和提取時(shí)間3個(gè)因素在不同水平對(duì)配方顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素總含量和出膏率的影響，并進(jìn)行了含量測定的方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)條件下，影響成分總含量和出膏率的因素按程度大小依次為煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、加水量，且不同煎煮時(shí)間具有顯著性差異(P<0.05)；經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，確定黃芩配方顆粒最佳水提工藝為加水10倍量，煎煮1 h，煎煮3次。本研究優(yōu)選的水提取工藝穩(wěn)定可行，所得產(chǎn)品的有效成分含量和出膏率較高且較為穩(wěn)定，可用于黃芩配方顆粒的制備。

正交試驗(yàn)；黃芩配方顆粒；水提工藝

黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效[1]，藥用歷史悠久，主產(chǎn)于山東、河北、內(nèi)蒙古等地，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為中品，臨床常以單方或復(fù)方治療高血壓、冠心病等疾病[2-3]。研究表明，黃芩含黃酮類、酚苷、醇苷等化學(xué)成分，其中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等黃酮類成分為主要藥效成分，具有抑菌消炎、抗氧化和改善血液循環(huán)等多種藥理活性[4-6]。

中藥配方顆粒是由單味飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒而成的新型飲片形式，保留了傳統(tǒng)飲片的性味與歸經(jīng)特性，具有起效時(shí)間短、劑量準(zhǔn)確、便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。因此，配方顆粒的臨床用量近年來快速增長。目前文獻(xiàn)多集中于報(bào)道不同提取溶劑或先進(jìn)技術(shù)(例如超高壓、超臨界等)對(duì)藥材提取率的影響。例如，有報(bào)道黃芩提取過程中，使用酶法、醇提等工藝大大高于溶劑水的提取率[9-11]，但近期公布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)》[12]明確規(guī)定，配方顆粒提取過程須與湯劑相同，即限定為水提[13-14]，而目前對(duì)于黃芩配方顆粒制備的水提工藝的研究報(bào)道較少。故本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)湯劑的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)法考察了加水量、提取次數(shù)和提取時(shí)間3個(gè)因素在不同水平對(duì)黃芩配方顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素總量以及出膏率的影響，優(yōu)選黃芩配方顆粒的提取工藝，使其更為接近臨床湯劑的應(yīng)用實(shí)踐，避免過高提取率帶來的未知成分或不良反應(yīng)，可為黃芩配方顆粒的制備和進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1120高效液相色譜儀(包括Agilent DAD 檢測器，Agilent Chemstation工作站，美國Agilent)；BSA124S天平(德國Sartorius)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Scientz-10N冷凍干燥機(jī)(寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司)；GZX-9140 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；超聲波清洗機(jī)(SB-3200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試藥

乙腈(美國Fisher Scientific)；無水乙醇(北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)；甲酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；甲酸銨(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；純凈水(娃哈哈集團(tuán)有限公司)；黃芩苷對(duì)照品(批號(hào) 110715-201318，中國食品藥品檢定研究院)；漢黃芩苷(批號(hào) MUST-13052312)、黃芩素(批號(hào) MUST-13082206)、漢黃芩素(純度>98%批號(hào) MUST-13092303，成都曼斯特生物科技有限公司)；黃芩飲片(批號(hào) 16011601，濟(jì)南禾寶中藥材有限公司)，經(jīng)鑒定符合2015版《中國藥典》規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法建立

2.1.1 供試品溶液制備

取黃芩飲片100 g，加水10倍量，稱重，煎煮1 h，補(bǔ)足重量，過濾，濾渣再加水，重復(fù)煎煮3次，過濾，合并3次水提液，然后減壓濃縮至一定體積，凍干24 h后，粉碎過60目篩，乙醇制軟材，過20目篩后60 ℃烘干，過20目篩整粒后密封包裝，即黃芩配方顆粒。

精密稱取0.1 g配方顆粒，置圓底燒瓶中，加70%乙醇40 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液置100 mL量瓶中，用少量70%乙醇分次洗滌容器和殘?jiān)?，補(bǔ)至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻過濾，即得供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素對(duì)照品各5 mg，置50 mL量瓶中，分別用甲醇溶解，定容作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，4 ℃冷藏，備用。分別精密吸取對(duì)照品貯備液適量，置10 mL量瓶中，定容，搖勻，即得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素濃度分別為30.0、12.0、1.5、0.6 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 色譜條件

Wates-WAT054275色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相A: 20 mmol·L-1甲酸銨的1%甲酸水溶液，流動(dòng)相 B: 乙腈，洗脫方式(乙腈比例): 0～5 min，18%，5～8 min，18%～23%，8～18 min，23%～26%，18～50 min，40%～54%，流速0.8 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測波長274 nm，進(jìn)樣量10 μL[15-16]。HPLC色譜圖見圖1。

1.黃芩苷； 2.漢黃芩苷； 3.黃芩素； 4.漢黃芩素。圖1 樣品及混合對(duì)照品的HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of representative sample andmixed reference substances

2.1.4 線性關(guān)系考察

取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1，2，4，6，8，10 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇定容搖勻，配制成不同濃度對(duì)照品溶液，并按2.1.3項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得如下回歸方程：黃芩苷回歸方程Y=8 478.4X+13.468(r=0.999 4)，線性范圍0.20～10 μg·mL-1；漢黃芩苷回歸方程Y=10 112X+101.97(r=0.999 6)，線性范圍0.10～10 μg·mL-1；黃芩素回歸方程Y=11 035X-5.1(r=0.999 3)，線性范圍0.10～10 μg·mL-1；漢黃芩素回歸方程Y=14 602X-0.402 8(r=0.999 9)，線性范圍0.20～10 μg·mL-1。結(jié)果表明，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素在標(biāo)示濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次，測得峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取黃芩飲片適量，按照2.1.1項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含有量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取2.1.1項(xiàng)下同一供試品溶液10 μL，分別在0，4，8，12，24 h進(jìn)樣，測定，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取黃芩配方顆粒適量，共6份，每份加入各對(duì)照品溶液100%的量，按照2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1.3項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的加樣回收率分別為93.32%、97.67%、95.16%和97.48%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.08%、2.56%、4.23%和4.78%。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照 L9(34) 正交設(shè)計(jì)[17]，以煎煮時(shí)間(A)、煎煮次數(shù) (B)、加水量(C) 為影響因素，設(shè)計(jì)3個(gè)不同水平進(jìn)行試驗(yàn)考察。因素水平值見表2。

表2 因素水平表

稱取黃芩飲片100 g，共9份，按表2所示進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將提取液合并，然后減壓濃縮至一定體積，凍干24 h后，粉碎過60目篩，乙醇制軟材，過20目篩后60℃烘干，過20目篩整粒后密封包裝，即黃芩配方顆粒樣品。將樣品按照2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并以HPLC法進(jìn)樣測定黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素4個(gè)有效成分含量。

另取黃芩提取液10 mL置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在恒溫水浴鍋上蒸干后，于105 ℃烘箱中干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質(zhì)量。按下式計(jì)算出膏率:

式中，m1為蒸發(fā)皿與干膏總質(zhì)量；m2為蒸發(fā)皿質(zhì)量；V1為提取液總體積；V2為取的提取液的體積；m為飲片質(zhì)量。

以上述有效成分總量(總黃酮量)以及出膏率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同因素水平對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。具體結(jié)果見表3～4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis

注：F0.05(2,2)=19.00； *表示顯著性差異。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，以總黃酮量和出膏率為指標(biāo)，比較各考察因素的R值可知影響提取效率和出膏率的主要因素是煎煮時(shí)間，其次是煎煮次數(shù)和加水量。方差分析顯示，煎煮時(shí)間P<0.05，具有顯著差異，因此不同煎煮時(shí)間對(duì)活性成分的提取率和出膏率具有顯著影響。而在考察范圍內(nèi)，不同加水量、煎煮次數(shù)P>0.05，此兩項(xiàng)因素影響相對(duì)較低，推測可能是由于黃酮類成分溶解度較高的原因。

綜合總黃酮量和出膏率兩個(gè)考察指標(biāo)可知，在制備黃芩配方顆粒時(shí)，加水10倍量，煎煮1 h，煎煮3次，煎出總黃酮量和出膏率最高，是較適宜的提取條件。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳提取工藝的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性，故進(jìn)行3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。分別稱取黃芩飲片3份，每份100 g，按優(yōu)化所得工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并按上述方法考察總黃酮的含量及出膏率情況，結(jié)果見表5。

結(jié)果表明，在所選取的工藝條件下，總黃酮含量和出膏率較高，且相對(duì)穩(wěn)定。故確定提取工藝為加水10倍量，煎煮1 h，煎煮3次。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

目前，關(guān)于黃芩或其他中藥提取的文獻(xiàn)報(bào)道多集中于使用不同提取溶劑或先進(jìn)技術(shù)(例如超高壓、超臨界等)提高藥材活性成分的提取率，但這與傳統(tǒng)湯劑的水提方式差異較大,容易造成未知不良反應(yīng)，不適用于配方顆粒的提取工藝。另外，以往單一成分指標(biāo)的測定不能準(zhǔn)確反映中藥復(fù)雜體系的質(zhì)量和藥效，因此，本研究采用接近煎煮湯劑形式的水提工藝為研究對(duì)象，通過正交試驗(yàn)法研究了水提過程中的加水量、提取次數(shù)和提取時(shí)間3個(gè)因素在不同水平對(duì)黃芩配方顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素總含量和出膏率的影響，并進(jìn)行了含量測定的方法學(xué)驗(yàn)證。

對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行方差分析可知，各因素對(duì)總黃酮量和出膏率的影響程度為煎煮時(shí)間大于煎煮次數(shù)大于加水量，并且在此實(shí)驗(yàn)條件下，煎煮時(shí)間具有顯著性差異(P<0.05)，加水量和煎煮次數(shù)對(duì)其提取率影響較低，可能是由于黃酮類成分的溶解度較高，對(duì)提取水總量要求較低。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，確定可用于黃芩配方顆粒的最佳水提工藝為加水10倍量，煎煮1 h，煎煮3次。在此條件下，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等黃酮類成分提取率和出膏率高且穩(wěn)定，且提取方法穩(wěn)定可靠，可為黃芩配方顆粒的制備及進(jìn)一步研究提供良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

[1]國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典2015年一部[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015:301.

[2]鄭江萍,梁俊,黃良永,等. 黃芩藥材及其配方顆粒中黃芩苷的含量比較[J]. 海峽藥學(xué),2016,28(5):49-51.

[3]徐玉田. 黃芩的化學(xué)成分及現(xiàn)代藥理作用研究進(jìn)展[J]. 光明中醫(yī),2010,25(3):544-545.

[4]王孟華,曲瑋,梁敬鈺. 黃芩的研究進(jìn)展[J]. 海峽藥學(xué),2013,25(9):6-13.

[5] ZHANG X P, TIAN H, WU C J, et al. Effect of baicalin on inflammatory mediator levels and microcirculation disturbance in rats with severe acute pancreatitis[J]. Pancreas, 2008, 38(7) : 732-738.

[6] ZHANG J A, YIN Z, MA L W, et al．The protective effect of baicalin against UVB irradiationinduced photoaging: an in vitro and in vivo study[J]. Plos One, 2014, 9(6) : e99703.

[7]張紅梅,宋景政,譚紅勝,等. 從湯劑到顆粒劑:中藥配方顆粒20年回顧與展望[J]. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2012,14(4):1740-1753.

[8]王斌. 中藥配方顆粒處方的抽樣調(diào)查和分析[J]. 北方藥學(xué),2016,13(8):166-167.

[9]王宏志,喻春皓,高鈞,等. HPLC分析比較炮制和提取方法對(duì)黃芩活性成分的影響[J]. 中國中藥雜志, 2007, 32(16):1637-1640.

[10]楊宏靜. 黃芩乙醇回流提取工藝研究[J]. 實(shí)用中醫(yī)藥雜志, 2013, 29(6)：492-493

[11] 王宏志,喻春皓,高鈞,等. 酶法提取黃芩中黃芩素、漢黃芩素[J]. 新疆中醫(yī)藥, 2007, 30(7):851-854.

[12]國家藥典委員會(huì).中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)[EB/OL].[2017-03-02]. http://www.chp.org.cn/view/ff808081559d1ea301565ac24962560d?a=xwjx.

[13] 葉殷殷,曾元兒,曹騁,等.中藥配方顆粒的研究進(jìn)展[J].臨床醫(yī)學(xué)工程,2011,18(5):807-809.

[14] 陳培勝,朱月信. 中藥配方顆粒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)研究思路[J]. 中醫(yī)雜志, 2012,53(6):469-472.

[15] 林啟焰,謝凡,程雪梅,等. 正交試驗(yàn)優(yōu)化滋腎養(yǎng)陰顆粒劑提取工藝[J].中成藥,2017,39(1):213-215.

[16] 趙恒強(qiáng),王曉,周潔,等. 山東產(chǎn)區(qū)黃芩HPLC定量指紋圖譜研究[J]. 中國現(xiàn)代中藥,2014,16(7):528-533.

[17] 王學(xué)軍,程敏,梁旭華,等.正交試驗(yàn)優(yōu)化杜仲葉水提液絮凝除雜工藝[J]. 中成藥,2017,39(4):842-844.

OptimizationofthewaterextractionconditionsofHuangqindispensinggranulesbyorthogonaltest

HAOCui1,2,MUYan2,ZHAOHeng-qiang2,CUILi2,LIUWei2,LIUFeng-qin3*

(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China;2.ShandongProvincialKeyLaboratoryofTCMQualityControlTechnology,ShandongAnalysisandTestCenter，Jinan250014,China; 3.ShandongQianfoshanHospital,Jinan250014,China)

∶For the optimization of the water extraction conditions of Huangqin dispensing granules, orthogonal test method was used to investigate the effects of 3 factors, including different water volumes, extraction frequency and extraction duration, on the total content of baicalin, wogonoside, baicalein and wogonin and the extract rate. Meanwhile, the methodology of the HPLC determination was verified. As a result, under the experiment conditions, the importance order was as follows: extraction duration,extraction frequency,water volume. And extraction durations at different level were significant different (P<0.05). The experiment proved that the suitable extraction condition was that Huangqin slices were added 10 times volume of water and extracted 3 times for 1 h each time. The extraction condition optimized in this paper was practical and stable with high extraction rate of active ingredients, which was suitable to be used in the preparation of Huangqin dispensing granules.

∶orthogonal test; Huangqin dispensing granules; water extraction conditions

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.06.004

2017-05-27

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃(2013-201)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2013GSF1120)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2013HM075，ZR2016YL006)

郝翠(1993—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮滤幣c中藥炮制原理。E-mail: hc56558 @163.com

*通信作者，劉逢芹，女，主任藥師，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c臨床藥學(xué)。E-mail: 13791120885@163.com

R284.2

A

1002-4026(2017)06-0022-07