邵宗圓,王 悅,張 菊,楊 程,周 剛,楊如意

安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 蕪湖 241002

耐銅植物茵陳蒿根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及影響因素

邵宗圓,王 悅,張 菊,楊 程,周 剛,楊如意*

安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 蕪湖 241002

采用MiSeq高通量測序技術(shù)對耐銅植物茵陳蒿根際的細(xì)菌16S rDNA基因V3—V4區(qū)片段進(jìn)行了測序,研究了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化,并分析了其與土壤環(huán)境因子的關(guān)系。研究表明,采樣點Cu3中細(xì)菌群落的多樣性、豐富度、均勻度、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)等均顯著低于Cu1和Cu2,但Cu3的覆蓋度高于Cu1。排名前10的優(yōu)勢細(xì)菌門總相對豐度均在95%以上,其中8個優(yōu)勢細(xì)菌門在3個采樣點中是相同的,包括Proteobacteria(變形菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Verrucomicrobia(疣微菌門)、Planctomycetes(浮霉菌門)和Unclassified(未分類門)等。采樣點Cu1中變形菌門、擬桿菌門和芽單胞菌門的相對豐度顯著高于其他兩個采樣點,而酸桿菌門、放線菌門、疣微菌門、綠彎菌門(Chloroflexi)和未分類門則剛好相反,表明細(xì)菌對脅迫環(huán)境的適應(yīng)能力有明顯差異。主坐標(biāo)和冗余分析表明,3個采樣點的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變。土壤環(huán)境因子與細(xì)菌群落的變化關(guān)系密切,8個因子的特征值共解釋了97.5%的總方差。其中,總銅、總磷、pH、有效磷和有機質(zhì)為顯著性因子,可以解釋93.9%的群落變化,但影響不同采樣點細(xì)菌群落的主導(dǎo)因子有所差異。

重金屬污染土壤；植物修復(fù)；根際細(xì)菌；群落結(jié)構(gòu)；高通量測序

由于礦產(chǎn)的開采與冶煉、大氣沉降、污灌、肥藥使用和工業(yè)排放的影響,導(dǎo)致土壤重金屬污染越來越嚴(yán)重。我國耕地土壤的點位超標(biāo)率達(dá)19.4%,主要以鎘、鎳、銅等重金屬無機污染為主[1]。目前,土壤重金屬污染已成為全球性的環(huán)境問題之一,重金屬污染土壤的修復(fù)、治理與復(fù)墾已經(jīng)成為環(huán)境科學(xué)和生態(tài)學(xué)研究的熱點領(lǐng)域。其中,植物修復(fù)作為一種原位修復(fù)技術(shù),不僅處理成本低、環(huán)境友好,而且具有多重生態(tài)功能,受到國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注[2- 3]。但植物修復(fù)也存在處理周期長、適用范圍窄、處理效率低等缺陷,而且有可能通過取食作用增加植食性動物面臨的生態(tài)風(fēng)險[4- 5]。近年來,利用植物和微生物之間的相互作用,建立植物-微生物聯(lián)合修復(fù)體系,強化植物修復(fù)效率成為重要的發(fā)展趨勢[6- 7]。

微生物是聯(lián)系植物與土壤環(huán)境的重要紐帶,對兩者間的相互作用具有重要的調(diào)節(jié)功能。微生物及其產(chǎn)生的各種代謝物廣泛參與土壤、沉積物等環(huán)境介質(zhì)中的物理、化學(xué)和生物化學(xué)反應(yīng),影響重金屬的遷移、轉(zhuǎn)化和生物有效性,進(jìn)而影響植物的生長和對重金屬的吸收與積累[6, 8- 10]。一方面,土壤微生物可以吸附或聚集重金屬[11],從而降低重金屬對植物的脅迫。 另一方面,微生物釋放的有機物能夠絡(luò)合和浸出重金屬,提高其生物有效性[12]。 研究發(fā)現(xiàn),在氨基酸等有機物的作用下,納米氧化銅浸出的Cu2+高達(dá)60%—75%,從而更易于被植物所吸收[13]。海州香薷(ElsholtziasplendensNakai)根際的耐銅細(xì)菌通過分泌有機酸,增加了銅的生物有效性,顯著提高了植物對銅的累積水平,縮短了修復(fù)周期[14]。微生物不僅可以改變重金屬形態(tài),而且可以影響其粒徑大小。研究表明,多種耐硒細(xì)菌可以將高濃度的硒酸鹽或亞硒酸鹽還原為納米級單質(zhì)硒,從而降低其生物毒性,可應(yīng)用于硒污染土壤或水體的修復(fù)[15]。

微生物在重金屬植物修復(fù)中的作用因具體的微生物、植物和重金屬類型,以及環(huán)境條件的差異而有所差別。目前,大多數(shù)研究主要通過從環(huán)境介質(zhì)中分離、篩選、馴化等方式對特定功能的少數(shù)微生物加以利用。但是,現(xiàn)實環(huán)境中微生物是以群落的形式存在的,微生物間的相互作用對植物修復(fù)效率也具有重要影響[16]。因此,研究植物根際的微生物群落,分析影響其群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子,對更好地發(fā)揮微生物的功能具有重要意義。

茵陳蒿(ArtemisiacapillariesThunb.)是一種傳統(tǒng)的中藥材,也是銅礦廢棄地次生演替過程中的先鋒植物,具有較強的銅耐性[2, 4],根部銅積累量高達(dá)533 mg/kg[17]。目前,國內(nèi)外關(guān)于茵陳蒿根際微生物群落,以及在銅礦廢棄地修復(fù)方面的相關(guān)研究還很少。本研究通過高通量測序法,研究了茵陳蒿根際的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),分析了細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子間的關(guān)系,本研究結(jié)果將為闡明細(xì)菌群落變化的關(guān)鍵驅(qū)動因子,更好地利用功能細(xì)菌強化銅礦廢棄地的植物修復(fù)提供參考[16]。

1 材料與方法

1.1 采樣點概況和樣品采集

本研究采樣點位于安徽省蕪湖市南陵縣大工山——鳳凰山古銅礦區(qū)的一處銅礦廢棄地(30°55′51″N, 118°9′23″E)。該地區(qū)屬北亞熱帶濕潤型季風(fēng)氣候區(qū),東亞季風(fēng)盛行,年均降雨量約1400 mm,年均蒸發(fā)量約1377 mm,年平均氣溫約15.8℃。該銅礦廢棄地廢棄時間超過50年,土壤為發(fā)育于坡積母質(zhì)的棕紅壤,質(zhì)地屬沙質(zhì)土壤,極易發(fā)生水土流失。但是,表層土由于長期自然演替導(dǎo)致腐殖質(zhì)含量較高。在研究點內(nèi),植被類型以草本植物為主(占40%以上),海州香薷、鴨跖草(CommelinacommunisL.)、茵陳蒿、酸模(RumexacetosaL.)和頭花蓼(PolygonumcapitatumBuch.-Ham. ex D. Don)等為優(yōu)勢種,零星散布著少量枸骨冬青(IlexcornutaLindl.etPaxt)和白花泡桐(Paulowniafortunei(Seem.) Hemsl.)等灌木和喬木[4]。

本研究以3個面積約為20 m2的廢棄地作為采樣點,樣點之間相距約100—120 m。每個采樣點隨機選取4個1 m × 1 m 的樣方(每個樣方作為一個重復(fù))。將樣方內(nèi)的茵陳蒿整株取出,采用抖根法收集根際土壤,同一樣方內(nèi)的土樣混合均勻,作為一個混合樣(約200 g)。每個采樣點的4個樣品不混合,共計12個樣品。所有土壤樣品立即帶回實驗室,部分新鮮土壤用于提取細(xì)菌總DNA,其余土壤自然風(fēng)干后待用。

1.2 試驗方法

1.2.1土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH的測定：稱取過1mm篩孔的風(fēng)干土10g,加入1mol/L的KCl溶液25mL(土水比為1∶2.5),搖勻30min后用pH計進(jìn)行測定。土壤總磷和有效磷測定：分別采用H2SO4-HClO4消解和HCl-H2SO4浸提,鉬銨藍(lán)比色法進(jìn)行測定。有機質(zhì)的測定采用K2Cr2O7-H2SO4稀釋熱法[18]。土壤Cu、Zn總量采用HF-HClO4-HNO3消解,有效態(tài)Cu、Zn通過0.1mol/L的HCl浸提[18],通過火焰原子吸收分光光度計(AA-6650,島津,日本)測定。

1.2.2細(xì)菌宏基因組16S rDNA測序

利用土壤基因組DNA提取試劑盒(FastDNA? Spin Kit for Soil)提取土壤微生物基因組DNA。總DNA用1%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測,再稀釋10倍后用于PCR擴增。利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA進(jìn)行精確定量,以確定PCR反應(yīng)應(yīng)加入的DNA量。 PCR所用的引物已經(jīng)融合了MiSeq測序平臺的V3—V4區(qū)通用引物,引物序列見表1。

表1 測序引物及序列

PCR體系包括10×PCR buffer 5 μL、dNTP(每種10 mmol/L) 0.5 μL、基因組DNA 10 ng、Bar-PCR primer F (50 μmol/L) 0.5 μL、Primer R (50 μmol/L) 0.5 μL、Plantium Taq (5 U/μL) 0.5 μL,補充無菌水至50 μL。PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s,45℃退火20 s、65℃延伸30 s,共5個循環(huán)；94℃變性20 s,55℃退火30 s、72℃延伸30 s,共20個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR結(jié)束后,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳,用瓊脂糖回收試劑盒(cat:SK8131)對DNA進(jìn)行回收。回收產(chǎn)物用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒定量,根據(jù)測得的DNA濃度,將所有樣品按照1∶1的比例進(jìn)行混合,混合后充分震蕩均勻。該混合樣品由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行后續(xù)的樣品建庫與宏基因測序。

1.3 分析方法

1.3.1根際細(xì)菌多樣性指標(biāo)分析

將多條序列按其序列間的距離進(jìn)行聚類,根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元(Operational taxonomic unit, OTU),序列相似性域值設(shè)為0.97。采用uclust軟件(uclust v1.1.579)對OTU進(jìn)行聚類,uclust首先篩選出序列中最長的reads作為種子序列,找出所有與該序列的相似度在閾值范圍內(nèi)的序列,并歸為一個類,而后依次執(zhí)行此步驟,直到所有序列均完成聚類,每一個類作為一個OTU。

細(xì)菌Alpha多樣性指標(biāo)包括豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、均勻度、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和覆蓋度。豐富度指數(shù)通過OTU的個數(shù)來計算,香農(nóng)-威納指數(shù)衡量群落的異質(zhì)性,通過公式(1)進(jìn)行計算,其中Pi為第i種細(xì)菌數(shù)量占細(xì)菌總量的比值。均勻度按公式(2)計算,其中S為細(xì)菌的總物種數(shù)。

(1)

EH=H/lnS

(2)

ACE指數(shù)用以估計群落中含有的OTU數(shù)目,是生態(tài)學(xué)中估計物種總數(shù)的常用指數(shù)之一,按公式(3)計算：

(3)

其中,ni=含有i條序列的OTU數(shù)目；Srare=含有“abund”條序列或者少于“abund”的OTU數(shù)目；Sabund=多于“abund”條序列的OTU數(shù)目；abund=“優(yōu)勢”O(jiān)TU閾值,默認(rèn)為10。

Chao1指數(shù)也是估計群落中含OTU 數(shù)目的指數(shù)。計算公式如下：

(4)

其中,SChao1=估計的OTU 數(shù)；Sobs=實際OTU 數(shù)；n1=只有一條序列的 OTU 數(shù)目；n2=只有兩條序列的 OTU 數(shù)目。

覆蓋率數(shù)值越高,則樣本中序列沒有被測出的概率越低。該指數(shù)反映了本次測序結(jié)果是否代表樣本的真實情況。計算公式為：

(5)

其中,n1=只含有一條序列的 OTU 的數(shù)目；N=抽樣中出現(xiàn)的總序列數(shù)目。

細(xì)菌群落Beta多樣性可以用來比較多組樣本之間的差別,本研究利用Fast UniFrac軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principal co-ordinates analysis, PCoA)。

1.3.2基于Canoco軟件的冗余分析(RDA)

利用Canoco(version4.5, Centre for Biometry, Wageningen, The Netherlands)軟件分析土壤理化因子和細(xì)菌群落之間的關(guān)系。首先,對茵陳蒿根際土壤細(xì)菌群落做降趨勢對應(yīng)分析(Detrended correspondence analysis, DCA)。結(jié)果顯示,四個排序軸中最長軸為1.03,小于3,因此本研究選擇基于線性模型的冗余分析(Reundancy analysis, RDA)方法進(jìn)行排序[19]。

蒙特卡羅置換檢驗(Monte Carlo permutation)用以檢驗限制性排序模型的顯著性,置換次數(shù)選擇默認(rèn)值499次。預(yù)篩選(Forward selections)可以檢驗?zāi)姆N環(huán)境因子對細(xì)菌群落組成有顯著性的影響。根據(jù)預(yù)篩選的結(jié)果,通過偏冗余分析(partial RDA)的variation partitioning能夠確定具有顯著性影響的各因子的貢獻(xiàn)率[19]。

1.3.3數(shù)據(jù)分析

使用SPSS20.0對土壤理化性質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗,然后做單因素方差分析。不同處理的均值在5%的顯著性水平下做LSD(Least significant difference)多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

采樣點土壤理化性質(zhì)見表2[4]。結(jié)果顯示,土壤均屬于酸性土,不同樣點的酸度有顯著差異(P<0.05),其中樣方Cu1的pH最高。土壤的總銅平均濃度在7.81—25.76g/kg之間,有效銅平均濃度在1.31—5.13g/kg之間,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB15618—1995)》中的三級標(biāo)準(zhǔn)限值,重金屬銅污染嚴(yán)重。3個采樣點土壤銅濃度成遞增趨勢,其中Cu3與其他兩個采樣點之間銅濃度有顯著差異(P<0.05)。土壤中有機質(zhì)的含量在6.40—29.35g/kg之間,3個采樣點之間均有顯著差異(P<0.05),總磷含量在0.22—0.53g/kg之間?？備\濃度平均在0.22—0.43g/kg之間,Cu3采樣點的總鋅、有效鋅水平顯著高于其他兩個采樣點。所有采樣點均受到銅、鋅兩種重金屬的復(fù)合污染。

表2 土壤理化性質(zhì)

表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差,用不同字母標(biāo)記的數(shù)據(jù)表示在5%的顯著性水平下有顯著性差異P<0.05

圖1 茵陳蒿根際土壤細(xì)菌16S rDNA基因V3—V4區(qū)瓊脂凝膠電泳圖Fig.1 PCR amplification targeting the V3—V4 region of bacterial 16S rDNA geneCu1、Cu2和Cu3代表W3個采樣點,M 標(biāo)記物GM331,Marker GM331

2.2 16S rDNA擴增產(chǎn)物

土壤細(xì)菌總DNA片段長度約為10000 bp左右。16S rDNA基因V3—V4區(qū)擴增產(chǎn)物1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1(Marker: GM331)。特異性引物對能夠擴增出16S rDNA基因V3—V4區(qū)片段,擴增產(chǎn)物大約600 bp。目的片段亮度高,沒有非特異性擴增,可用于后續(xù)宏基因測序。

2.3 微生物Alpha多樣性指標(biāo)

所有采樣點測序文庫的覆蓋度均達(dá)到90%以上,說明絕大部分細(xì)菌的序列可以被測出,測序結(jié)果有較好的代表性。細(xì)菌豐富度指數(shù)用于衡量各采樣點細(xì)菌種類數(shù)量,通過OTU的個數(shù)來計算,數(shù)量均在5700條以上,表明各采樣點的細(xì)菌豐富度非常高。在銅濃度較低的Cu1采樣點,其豐富度、香農(nóng)威納指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)分別為11503、7.40、40088和26476,在3個采樣點中均為最大值。Cu1和Cu2兩個采樣點的所有多樣性指數(shù)均無明顯差異,與土壤銅、鋅的結(jié)果相一致。但是,除覆蓋度以外,兩個采樣點的其他所有指數(shù)均顯著高于Cu3(P<0.05,表3)。

表3 土壤細(xì)菌群落多樣性指標(biāo)

不同字母標(biāo)注的數(shù)值表示在5%的顯著性水平下有顯著性差異

2.4 土壤中細(xì)菌的主要類群及分布

圖2 各采樣點主要細(xì)菌類群相對豐度 Fig.2 The relative abundance of the major bacterial phylogenetic groups in different sampling sites

圖2顯示了銅礦廢棄地土壤中相對豐度較高的細(xì)菌類群所占的百分比。各采樣點相對豐度排名前10的優(yōu)勢細(xì)菌所占比例均達(dá)到95%以上,其中8個類群在3個采樣點中是相同的,包括Proteobacteria(變形菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Verrucomicrobia(疣微菌門)、Planctomycetes(浮霉菌門)和Unclassified(未分類門)等。在采樣點Cu1中,變形菌門占比高達(dá)51.63%,雖然其他兩個采樣點變形菌門優(yōu)勢度也最高,但與Cu1相比其占比明顯下降(P<0.05),擬桿菌門和芽單胞菌門變化趨勢與此類似。酸桿菌門在所有采樣點中均排第2位,但與采樣點Cu1相比,Cu2和Cu3中酸桿菌門的占比明顯增加(P<0.05),放線菌門、疣微菌門、綠彎菌門(Chloroflexi)和未分類門的變化趨勢與此類似,尤其是綠彎菌門,其在Cu3中的占比高達(dá)15.27%,居第3位。

2.5 細(xì)菌群落PCoA分析

圖3 各采樣點細(xì)菌群落PCoA聚類 Fig.3 The PCoA analysis of bacterial communities from different sampling sites

由圖3可見,3個采樣點的所有4個重復(fù)均聚類于同一象限,說明組內(nèi)變異相對較小,重復(fù)性較好,而群落之間位置較遠(yuǎn),組間差異明顯。PCoA分析結(jié)果表明,采樣點之間細(xì)菌群落組成的變異受11個主坐標(biāo)成分的控制,前5個主坐標(biāo)成分的特征值均大于1%,其中前兩個主坐標(biāo)成分影響最大,分別能夠解釋74.3%和17.8%的變異,累計解釋能力達(dá)92.07%。

2.6 土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系

蒙特卡羅置換檢驗結(jié)果顯示,第一典范軸和所有典范軸的P值分別為0.004(F=11.145)和0.002(F=14.720),表明該排序模型的解釋變量(即土壤環(huán)境因子)可以很好地解釋響應(yīng)變量(即土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu))的變化,且第一典范軸的影響十分顯著。茵陳蒿根際土壤細(xì)菌群落與根際土壤環(huán)境因子的冗余分析結(jié)果見表4。土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與4個典范軸均具有很高的相關(guān)性(>0.969),其中RDA前兩個排序軸的特征值分別為0.788和0.135,分別解釋了78.8%和13.5%的細(xì)菌物種變化。本文所選的8個土壤環(huán)境因子的特征值共解釋了97.5%的總方差,對茵陳蒿根際土壤細(xì)菌的物種梯度分布有十分顯著的影響。

為了找到可能影響茵陳蒿根際土壤細(xì)菌群落組成的主要因子,對8個理化因子進(jìn)行了預(yù)篩選。分析結(jié)果表明：總銅、總磷、pH、有效磷和有機質(zhì)能顯著影響茵陳蒿根際土壤細(xì)菌的群落組成(P< 0.05)。 根據(jù)預(yù)篩選的結(jié)果,對上述5個因子進(jìn)行Variation partitioning分析,從而得到各因子獨立影響細(xì)菌群落的強度[20]。

對茵陳蒿根際土壤細(xì)菌群落具有顯著性影響的理化因子單獨解釋的貢獻(xiàn)率和總貢獻(xiàn)率結(jié)果見表5。從表中可以看出,土壤總銅對細(xì)菌群落的變化解釋能力最高,為60.6%(P=0.002),其次為總磷、pH、有效磷和有機質(zhì),解釋能力依次為26.8%、26.3%、25.0%和21.0%,蒙特卡羅置換檢驗顯示其P值均達(dá)到顯著水平。上述5個因子總的解釋能力為93.9%,因此有65.8%的解釋能力來自5個因子的重疊部分,說明因子之間對土壤細(xì)菌群落的影響存在較大相關(guān)性。

表4 土壤細(xì)菌群落冗余分析

表5 土壤環(huán)境因子偏冗余分析(pRDAs)

圖4 采樣點和土壤理化因子RDA雙序圖 Fig.4 The RDA biplots generated from samples and environmental variables 圖中實線和實心箭頭表示顯著性因子,虛線和空心箭頭為非顯著性因子；Cu11—Cu14表示樣點1的4個重復(fù),其他樣點與此相同；OM：有機質(zhì),organic matter；TP：總磷,total phosphorus；AP：有效磷,available phosphorus；TCu：總銅,total Cu；ACu：有效銅,available Cu；TZn：總鋅,total Zn；AZn：有效鋅,available Zn

雙序圖(圖4)顯示了各采樣點的細(xì)菌群落與土壤理化因子間的關(guān)系。各采樣點的4個重復(fù)均相距較近,表明采樣點內(nèi)部的變異相對較小,這與PCoA的結(jié)果是一致的。對采樣點1影響最大的是土壤pH,其他因子與該采樣點的細(xì)菌群落呈負(fù)相關(guān)。采樣點2則主要受有效磷、有機質(zhì)、總磷和總銅的影響,與土壤pH則呈負(fù)相關(guān)。影響采樣點3的主要因子是總銅,其次是總磷、有效磷和有機質(zhì)?？梢钥闯?影響采樣點2和3細(xì)菌群落的因子相似,但順序不同,兩者與采樣點1之間均有較大差異。

3 討論

3.1 茵陳蒿根際細(xì)菌群落變化特征

根際微生物在植物吸收、運輸和積累營養(yǎng)元素、重金屬的過程中發(fā)揮著重要作用,但目前對微生物群落及其功能的變化研究偏少,對上述變化產(chǎn)生的生態(tài)學(xué)意義的關(guān)注更顯不足。 筆者前期的研究表明,隨著植物群落的演替和環(huán)境污染程度的提高,叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)群落在短時間內(nèi)物種組成和相對豐度均產(chǎn)生了明顯變化,其對宿主的功能和偏好性(preference)也發(fā)生改變,從而影響植物間的相互作用,反作用于植物群落[21- 23]。本研究利用Illumina公司的MiSeq高通量測序平臺對耐銅植物茵陳蒿根際的土壤細(xì)菌群落進(jìn)行了宏基因組測序和分析。該技術(shù)與變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)指紋圖譜和傳統(tǒng)測序方法相比,具有前處理簡單、通量高、速度快、精度高、信息量大等優(yōu)勢,尤其對群落中的稀有種具有更高的檢出能力[24- 25],已成為微生物生態(tài)學(xué)研究中的重要方法之一。本研究發(fā)現(xiàn),采樣點Cu1和Cu2的細(xì)菌群落多樣性指標(biāo)沒有差異,但細(xì)菌群落的豐富度、香農(nóng)威納指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和均勻度均顯著高于Cu3。從3個采樣點的土壤性質(zhì)看,Cu1的有機質(zhì)、總磷、有效磷等營養(yǎng)條件均顯著低于其他兩個采樣點,因此物種豐富度和多樣性的降低可能主要源于銅和鋅對細(xì)菌產(chǎn)生的脅迫作用。從本次測序的覆蓋度來看,Cu3卻顯著高于Cu1,這可能是由于Cu3中細(xì)菌種類少,多樣性低,優(yōu)勢種優(yōu)勢度十分明顯,非優(yōu)勢種所占比例很低,從而導(dǎo)致絕大多數(shù)細(xì)菌都能被所檢出。

本次測序采用RDP classifier軟件進(jìn)行物種分類,共分為門、綱、目、科、屬等5個層次。分類越精細(xì)其數(shù)量越大,3個采樣點所檢出的屬均在700個以上,因此為便于分析本研究從最高分類單元進(jìn)行比較。各采樣點的優(yōu)勢細(xì)菌門優(yōu)勢度非常明顯,排名前10的細(xì)菌門占比達(dá)95%以上,而且優(yōu)勢細(xì)菌門在3個采樣點中絕大部分是相同的,趨同現(xiàn)象明顯。這可能是由于銅脅迫對耐銅能力相對較弱的細(xì)菌產(chǎn)生了顯著的選擇壓力,導(dǎo)致耐銅細(xì)菌獲得了相對的優(yōu)勢。與此類似,通過DGGE分析該銅礦廢棄地上海州香薷根際的AMF群落,結(jié)果顯示AMF均來自Glomus屬,表明該屬具有較強的耐銅能力[22]。但是,優(yōu)勢細(xì)菌對銅的耐受能力仍有明顯差異。變形菌門在所有采樣點中優(yōu)勢度均最高,但在Cu2和Cu3中其優(yōu)勢度顯著低于Cu1,擬桿菌門和芽單胞菌門同樣如此；酸桿菌門、放線菌門、疣微菌門、綠彎菌門和未分類門的變化則剛好與此相反。這可能跟不同類別的細(xì)菌對環(huán)境的適應(yīng)能力強弱有關(guān),其中的主導(dǎo)因子應(yīng)該仍是銅脅迫。值得注意的是綠彎菌門,其在Cu1中的相對豐度僅為0.54%,但在Cu2和Cu3中分別達(dá)到4.54%和15.27%,增加非常顯著,意味著該菌具有極強的耐銅能力。

3.2 茵陳蒿根際細(xì)菌群落的影響因素

顏慶云等[26]發(fā)現(xiàn),武漢東湖5個站點的浮游生物PCR-DGGE指紋結(jié)構(gòu)的聚類結(jié)果與重金屬濃度的聚類分枝關(guān)系一致,即重金屬是影響浮游生物群落組成的重要因子。為了進(jìn)一步探討影響茵陳蒿根際細(xì)菌群落的環(huán)境因子,本研究做了PCoA和(偏)冗余分析。分析結(jié)果表明,各采樣點內(nèi)部均具有較好的重復(fù)性,這可能跟較小范圍(20 m2)內(nèi)的廢棄地土壤具有較高的同質(zhì)性有關(guān)。但是,3個采樣點則明顯聚成不同的群,說明細(xì)菌群落之間的差異十分明顯。PCoA分析顯示,細(xì)菌群落的變化與11個主坐標(biāo)成分有關(guān),但主要受前幾個主坐標(biāo)成分影響,其中前2個主坐標(biāo)成分的解釋能力達(dá)到92.07%,前8個主坐標(biāo)成分可以解釋99.04%的總方差。本研究所測定的8個土壤環(huán)境因子通過冗余分析投影成4個典范軸,總解釋能力達(dá)到97.5%,說明茵陳蒿根際細(xì)菌群落與這8個因子具有非常密切的關(guān)系。前2個典范軸的累計解釋能力達(dá)到92.3%,與PCoA前2個主坐標(biāo)成分的結(jié)果接近。偏冗余分析進(jìn)一步明確了對茵陳蒿根際細(xì)菌群落具有顯著性影響的環(huán)境因子的貢獻(xiàn)率。影響最大的是總銅,其單獨解釋能力達(dá)到60.6%,5個因子的總解釋能力達(dá)到93.9%。雙序圖則清晰地顯示了影響各個采樣點細(xì)菌群落的關(guān)鍵因子和影響程度。采樣點Cu3銅濃度最高,耐銅的酸桿菌門、放線菌門、疣微菌門、綠彎菌門和未分類門相對豐度與Cu1相比均顯著增加,因此該采樣點與總銅濃度呈正相關(guān)關(guān)系。采樣點Cu1主要受pH影響,與總銅呈負(fù)相關(guān),可能是因為Cu1中的變形菌門、擬桿菌門和芽單胞菌門對銅污染的敏感性相對較高,pH則可以調(diào)節(jié)銅的生物有效性,從而降低銅的脅迫作用。雖然,偏冗余分析的結(jié)果顯示有效銅、總鋅、有效鋅對細(xì)菌群落影響不顯著,但是Pearson相關(guān)分析表明,上述3個因子以及總銅與細(xì)菌群落的豐富度、多樣性和均勻度均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。 這意味著偏冗余分析主要是從細(xì)菌群落整體結(jié)構(gòu)的變化而非群落的多樣性進(jìn)行分析的。

研究植物修復(fù)過程中根際細(xì)菌群落的變化,以及影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的驅(qū)動因子,對于進(jìn)一步完善植物修復(fù)技術(shù),加速重金屬污染的植物-微生物聯(lián)合修復(fù)具有重要參考意義[16, 27]。

[1] 中華人民共和國環(huán)境保護(hù)部、國土資源部. 全國土壤污染狀況調(diào)查公報. 北京: 環(huán)境保護(hù)部, 國土資源部, 2014: 3.

[2] 王慶仁, 崔巖山, 董藝婷. 植物修復(fù)——重金屬污染土壤整治有效途徑. 生態(tài)學(xué)報, 2001, 21(2):326- 331.

[3] Barillas J R V, Quinn C F, Pilon-Smits E A H. Selenium accumulation in plants-phytotechnological applications and ecological implications. International Journal of Phytoremediation, 2011, 13(S1): 166- 178.

[4] Yang R Y, Guo F Y, Zan S T, Zhou G, Wille W, Tang J J, Chen X, Weiner J. Copper tolerantElsholtziasplendensfacilitatesCommelinacommunison a copper mine spoil. Plant and Soil, 2015, 397(1/2): 201- 211.

[5] Jeong S, Moon H S, Nam K. Increased ecological risk due to the hyperaccumulation of As inPteriscreticaduring the phytoremediation of an As-contaminated site. Chemosphere, 2015, 122: 1- 7.

[6] Ma Y, Rajkumar M, Zhang C, Freitas H. Inoculation ofBrassicaoxyrrhinawith plant growth promoting bacteria for the improvement of heavy metal phytoremediation under drought conditions. Journal of Hazardous Materials, 2016, 320: 36- 44.

[7] 李韻詩, 馮沖凌, 吳曉芙, 石潤. 重金屬污染土壤植物修復(fù)中的微生物功能研究進(jìn)展. 生態(tài)學(xué)報, 2015, 35(20): 6881- 6890.

[8] Ma Y, Oliveira R S, Freitas H, Zhang C. Biochemical and molecular mechanisms of plant-microbe-metal interactions: relevance for phytoremediation. Frontiers in Plant Science, 2016, 7: 918.

[9] Wood J L, Tang C X, Franks A E. Microbial associated plant growth and heavy metal accumulation to improve phytoextraction of contaminated soils. Soil Biology and Biochemistry, 2016, 103: 131- 137.

[10] Ullah A, Heng S, Munis M F H, Fahad S, Yang X Y. Phytoremediation of heavy metals assisted by plant growth promoting (PGP) bacteria: a review. Environmental and Experimental Botany, 2015, 117: 28- 40.

[11] Kafantaris F C A, Borrok D M. Zinc isotope fractionation during surface adsorption and intracellular incorporation by bacteria. Chemical Geology, 2014, 366: 42- 51.

[12] Gan M, Song Z B, Zhu J Y, Liu X X. Efficient bioleaching of heavy metals from contaminated sediment in batch method coupled with the assistance of heterotrophic microorganisms. Environmental Earth Sciences, 2016, 75(6): 457.

[13] Gunawan C, Teoh W Y, Marquis C P, Amal R. Cytotoxic origin of copper(II) oxide nanoparticles: comparative studies with micron-sized particles, leachate, and metal salts. ACS Nano, 2011, 5(9): 7214- 7225.

[14] Chen Y X, Wang Y P, Lin Q, Luo Y M. Effect of copper-tolerant rhizosphere bacteria on mobility of copper in soil and copper accumulation byElsholtziasplendens. Environment International, 2005, 31(6): 861- 866.

[16] Wood J L, Zhang C, Mathews E R, Tang C, Franks A E. Microbial community dynamics in the rhizosphere of a cadmium hyper-accumulator. Scientific Reports, 2016, 6: 36067.

[17] 婁曉祎, 楊如意, 郭耀廣, 王兆慧, 楊慧萍, 柳建設(shè). 銅陵市主要銅礦廢棄地耐銅植物的銅積累能力比較研究//2012中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文集(第三卷). 北京: 中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會, 2012: 2631- 2634.

[18] 鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析(第三版). 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000.

[20] Borcard D, Legendre P, Drapeau P. Partialling out the spatial component of ecological variation. Ecology, 1992, 73(3): 1045- 1055.

[21] Zhang Q, Yang R Y, Tang J J, Yang H S, Hu S J, Chen X. Positive feedback between mycorrhizal fungi and plants influences plant invasion success and resistance to invasion. PLoS One, 2010, 5(8): e12380.

[22] Yang R Y, Zan S T, Tang J J, Chen X, Zhang Q. Variation in community structure of arbuscular mycorrhizal fungi associated with a Cu tolerant plant-Elsholtziasplendens. Applied Soil Ecology, 2010, 44(3): 191- 197.

[23] 楊如意, 昝樹婷, 李靜, 蘇楠楠, 孫雯雯, 郭富裕, 周剛. 銅脅迫對叢枝菌根真菌群落功能的影響. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2015, 26(5): 1563- 1570.

[24] 夏圍圍, 賈仲君. 高通量測序和DGGE分析土壤微生物群落的技術(shù)評價. 微生物學(xué)報, 2014, 54(12): 1489- 1499.

[25] 蔡言安, 李冬, 畢學(xué)軍, 曾輝平, 張杰. 基于不同測序技術(shù)的生物群落結(jié)構(gòu)及功能菌分析. 中國環(huán)境科學(xué), 2016, 36(6): 1830- 1834.

[26] 顏慶云, 余育和, 馮偉松. 武漢東湖浮游生物宏基因組與環(huán)境重金屬的關(guān)系. 中國環(huán)境科學(xué), 2010, 30(S1): 52- 56.

[27] 李杰, 賀紀(jì)正, 馬延和, 朱永官, 張蕾. 生物耐銅的分子機理及銅污染環(huán)境的生物聯(lián)合修復(fù). 生態(tài)學(xué)報, 2007, 27(6): 2615- 2626.

Thebacterialcommunitystructureassociatedwithacopper-tolerantplant,ArtemisiacapillariesThunb.,anditsinfluencingfactors

SHAO Zongyuan, WANG Yue, ZHANG Ju, YANG Cheng, ZHOU Gang, YANG Ruyi*

CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,AnhuiNormalUniversity,Wuhu241002,China

The properties and roles of indigenous heavy metal-tolerant microbes have been extensively investigated for plant growth promotion and ecological remediation at contaminated sites, but these studies seldom address the community-level features of the microbes. Three soil samples were collected from the rhizosphere of a Cu-tolerant plant,ArtemisiacapillariesThunb., grown on a Cu mine spoil. The MiSeq high-throughput sequencing technique, targeting the V3—V4 region of the bacterial 16S rDNA gene, was used to investigate the bacterial community structure and analyze the links between the bacterial community and soil environmental parameters. The results showed that sampling site Cu3 contained higher concentrations of Cu and Zn than Cu1 and Cu2 did. The Shannon-Wiener diversity index, richness, evenness, ACE index, and Chao1 index of the bacterial communities in Cu3 were all lower than those of Cu1 and Cu2, but coverage by the bacterial communities in Cu3 was higher than that of Cu1. The top 10 dominant phyla of bacteria accounted for 95% of the total relative abundance and 8 out of the top 10 dominant phyla were the same across all three sampling sites; these were Proteobacteria, Acidobacteria, Bacteroidetes, Gemmatimonadetes, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Planctomycetes, and Unclassified. The relative abundances of Proteobacteria, Bacteroidetes, and Gemmatimonadetes were higher in Cu1 than in Cu2 and Cu3, but the opposite was true for Acidobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Chloroflexi, and Unclassified phyla, indicating that different bacteria responded differently to Cu stress. The relative abundance of Chloroflexi, which only accounted for 0.54% of the bacterial community in Cu1, was 4.54% and 15.27% in Cu2 and Cu3, respectively. Bacterial communities were clustered into three different groups, according to principal coordinates analysis (PCoA) and redundancy analysis (RDA). The variation in bacterial communities was controlled by 11 principal coordinates, among which the first and second coordinates explained 74.3% and 14.8% of the total variance, respectively. Soil environmental parameters were closely related to the differences in bacterial community and explained 97.5% of the total variance. Total Cu, total P, pH, available P, and organic matter were the significant parameters; altogether, they accounted for 93.9% of the total variance in bacterial community. Total Cu was the most powerful factor, and explained 60.6% of the total variance independently. However, the dominant parameters differed across sampling sites. The RDA bioplots revealed that the bacterial community in Cu3, which showed the highest Cu tolerance, was positively related to total Cu. In contrast, the relatively Cu-sensitive bacterial community in Cu1 was positively correlated with pH and negatively correlated with total Cu. It is of vital importance to study how bacterial communities in the plant rhizosphere change with the environment and screen functional bacteria for plant-microbe remediation of heavy metal contamination.

heavy metal contaminated soils; phytoremediation; rhizosphere bacteria; community structure; high-throughput sequencing

國家自然科學(xué)基金資助項目(41001368); 安徽省自然科學(xué)基金資助項目(1508085SMC211); 2016年高校優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目(gxyqZD2016025)

2016- 08- 26; < class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期

日期:2017- 07- 12

*通訊作者Corresponding author.E-mail: yangruyi@mail.ahnu.edu.cn

10.5846/stxb201608261743

邵宗圓,王悅,張菊,楊程,周剛,楊如意.耐銅植物茵陳蒿根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及影響因素.生態(tài)學(xué)報,2017,37(22):7679- 7688.

Shao Z Y, Wang Y, Zhang J, Yang C, Zhou G, Yang R Y.The bacterial community structure associated with a copper-tolerant plant,ArtemisiacapillariesThunb., and its influencing factors.Acta Ecologica Sinica,2017,37(22):7679- 7688.